益腎養(yǎng)髓方對脊髓型頸椎病大鼠脊髓中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響及其神經(jīng)修復(fù)作用研究

唐彬，銀河，楊博文，金哲峰，秦曉寬，劉志偉，魏戌，孫凱，齊寶玉，陳忻*，朱立國，3*

脊髓型頸椎?。╟ervical spondylotic myelopathy，CSM）是由于椎間盤突出、韌帶骨化、頸椎失穩(wěn)或畸形、生物力學(xué)改變等導(dǎo)致脊髓受壓或缺血損傷，進(jìn)而引起的脊髓傳導(dǎo)功能障礙性疾病[1]。近年來其發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡趨于年輕化，成為嚴(yán)重危害中老年乃至青年人健康的常見頸椎疾患之一[2]。手術(shù)療法能夠有效解除脊髓的壓迫，并同時改善脊柱的穩(wěn)定性，是臨床上治療CSM的重要手段。但對于不能耐受手術(shù)、輕度或癥狀不明顯的中度CSM患者，非手術(shù)療法仍然是必要的。

前期臨床研究已證實(shí)益腎養(yǎng)髓方用于治療病情平穩(wěn)、手術(shù)指征不明顯的早中期CSM患者已獲得比較滿意的臨床療效，且其可緩解CSM患者術(shù)后臨床癥狀[3]。在臨床證據(jù)較為充分的前提下，益腎養(yǎng)髓方的藥效研究及其對神經(jīng)元保護(hù)作用的基礎(chǔ)研究，對于闡明其療效機(jī)制和促進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化具有非常重要的意義。

本研究采用國際公認(rèn)的吸水膨脹材料壓迫脊髓的方法建立CSM動物模型，前期相關(guān)基礎(chǔ)研究已證實(shí)該造模方法的穩(wěn)定性較好并得到了研究者的認(rèn)可[4]。本研究通過觀察造模后大鼠運(yùn)動功能指數(shù)評分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB評分）記錄大鼠四肢運(yùn)動功能情況，采用尼氏體焦油染色、實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法和免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測受壓節(jié)段脊髓神經(jīng)細(xì)胞功能形態(tài)、脊髓組織中相關(guān)mRNA、蛋白表達(dá)分布情況，旨在從分子水平探討益腎養(yǎng)髓方對慢性脊髓壓迫后受損脊髓神經(jīng)修復(fù)的干預(yù)作用，以期闡明該藥治療CSM的療效，為下一步深入研究作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為益腎養(yǎng)髓方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

本研究采用吸水膨脹凝膠材料，能夠更真實(shí)地模擬脊髓型頸椎病患者脊髓慢性受壓的病理過程。隨后在不同時間點(diǎn)對神經(jīng)元修復(fù)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)脊髓慢性受壓后可能存在一定自我修復(fù)，中醫(yī)藥治療早期能明顯提高脊髓中神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)脊髓神經(jīng)元修復(fù)，這提示對該病早期治療的重要性，也為中醫(yī)藥治療開啟了新思路。

待研究的問題：

中醫(yī)藥治療是如何提高神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)因子表達(dá)，及相關(guān)因子如何調(diào)控下游分子，最終促進(jìn)脊髓神經(jīng)元修復(fù)的機(jī)制有待后續(xù)研究探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 于2019年1月選取SPF級雌性SD大鼠96只，240～250 g/只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2017-0033。大鼠飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫25 ℃左右，光照時間為8：00～20：00。本研究經(jīng)中國食品藥品檢定研究院倫理委員會批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 0.9%氯化鈉注射液、乙醇、碘伏、青霉素，純凈水、PBS、4%多聚甲醛溶液、2%水合氯醛；尼氏染色液（焦油紫法，Solarbio，貨號：G1430），Trizol（Invitrogen，貨號：15596018），通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV（Solarbio，貨號：RP1100），SYBR Green PCR Mix（Solarbio，貨號：SR1110），NGF多克隆抗體（Solarbio，貨號：K001636P）、中性樹膠（Solarbio，貨號：G8590）、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（Solarbio，貨號：C1031）、蘇木素染色液（Solarbio，貨號：G1080）；引物由北京索萊寶科技有限公司設(shè)計(jì)，由擎科生物合成；刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無齒鑷、持針器、彎鉗、直鉗、單關(guān)節(jié)骨剪，購于上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司；不銹鋼高壓鍋、電磁爐、濕盒/孵育盒、電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司，型號：KH-5000E）、電子天平（Mettler公司，AE160型）、離心機(jī)（Eppendorf，型號：5427R）、PCR儀（Thermo，型號：4375786）、組織脫水機(jī)（德國Leica公司，型號：ASP200S）、組織包埋機(jī)（德國Leica公司，型號：EG1150C）、石蠟切片機(jī)（德國Leica公司，型號：RM2245）等；5 ml注射器、三角縫合針、2-0醫(yī)用真絲縫合線、刀片、醫(yī)用紗布、棉球。

1.3 中藥制備 益腎養(yǎng)髓方藥物組成：巴戟天9 g、熟地黃12 g、鹿角霜12 g、白芍12 g、黃芪15 g、桂枝6 g、丹參9 g、鬼箭羽12 g、羌活6 g，購自中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院藥劑科，中藥煎煮后水浴濃縮，用純凈水對濃縮后的藥液進(jìn)行等比稀釋，冷藏備用，水煎煮和濃縮程序按照《中國藥典》2010版規(guī)定執(zhí)行。大鼠灌胃給藥劑量，采用體表面積系數(shù)換算，以成人 70 kg，大鼠200 g，換算系數(shù)6.3計(jì)算[5]，高濃度為16.74 g·kg-1·d-1、中濃度為 8.37 g·kg-1·d-1、低濃度為 4.19 g·kg-1·d-1。

1.4 CSM模型建立 采用吸水膨脹材料聚乙烯醇丙烯酰胺互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠（由北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供）壓迫脊髓的方法進(jìn)行造模[4]。術(shù)前采用BBB評分評估大鼠后肢運(yùn)動功能（正常大鼠為滿分21分）。造模：取72只大鼠用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剃除大鼠頸后部皮毛，常規(guī)碘伏消毒、鋪巾，大鼠頸椎后正中做一3～4 cm切口，暴露頸肩部肌群，找到第2胸椎棘突，自下往上正中切開肌肉群向兩側(cè)牽開，沿棘突兩側(cè)剝離棘突上附著肌肉，找到并暴露整個C5～7頸椎骨椎板，剔除C7和T1椎板間黃韌帶和部分椎板，從椎板間隙小心將吸水膨脹材料（1.5 mm×0.7 mm×0.3 mm）植入C5～7椎板下，操作要輕柔以防止腦脊液漏出、脊髓損傷。逐層縫合肌肉、皮膚，肌肉注射青霉素8萬U/只，術(shù)畢。術(shù)后2周評價(jià)大鼠BBB評分[6]，8～14分為造模成功，隨機(jī)分組以保證灌胃前每組CSM模型大鼠脊髓損傷程度的一致性。

假手術(shù)：取24只大鼠采用上述方法暴露C5～7椎板，剔除C7和T1椎板間黃韌帶和部分椎板，小心將同體積吸水膨脹材料植入C5～7椎板下后隨即取出，不造成脊髓壓迫。

術(shù)后將大鼠放入鼠籠，于25 ℃左右室溫喂養(yǎng)。每日早晚人工擠壓膀胱協(xié)助排尿，至形成反射性排尿?yàn)橹梗缬兴劳黾皶r補(bǔ)充。

1.5 分組 假手術(shù)大鼠作為假手術(shù)組（n=24），造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組（n=24）、中藥高濃度組（n=16）、中藥中濃度組（n=16）、中藥低濃度組（n=16）。中藥灌胃的各組按照對應(yīng)濃度進(jìn)行灌胃，藥液濃縮后以1 ml/100 g體積灌胃給藥，模型組及假手術(shù)組灌服等量（1 ml/100 g）0.9%氯化鈉注射液，1次/d。分別于術(shù)后4、6、8、10周，評價(jià)各組大鼠BBB評分。

1.6 脊髓樣本取材 第一次取材于術(shù)后2周從假手術(shù)組和模型組中每組隨機(jī)選取8只大鼠，第二次取材于術(shù)后6周從5組中每組隨機(jī)選取8只大鼠，第三次取材于術(shù)后10周從5組中每組隨機(jī)選取8只大鼠。

每個時間點(diǎn)每組隨機(jī)選取的8只大鼠中，有4只大鼠采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，手術(shù)剪打開大鼠胸腔，暴露心臟，于左心室靠近心尖搏動處插入灌流針頭，注入0.9%氯化鈉溶液250 ml，直到肝臟和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液體澄清，再使用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注，大鼠出現(xiàn)四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬和全身強(qiáng)直現(xiàn)象時停止灌流。取C5～7對應(yīng)脊髓節(jié)段，固定、脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片厚約3 mm，用于尼氏染色和免疫組織化學(xué)法檢測。

每組隨機(jī)選取的另外4只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），處死，取C5～7對應(yīng)脊髓節(jié)段到凍存管后，放置于液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于RT-qPCR檢測。

1.7 尼氏染色 用二甲苯常規(guī)脫蠟15 min，然后梯度乙醇脫水5 min，蒸餾水沖洗3次，5 min/次，然后置于60 ℃溫箱用焦油紫染色10 min，蒸餾水洗凈染料后，分別置于梯度乙醇中脫水，再用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。利用數(shù)字掃描儀進(jìn)行掃描，adimec Q-12A-180Fc相機(jī)拍照，用CaseViewer 2.4軟件放大400倍觀察脊髓前角神經(jīng)元形態(tài)，并計(jì)算視野下尼氏染色陽性的正常脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量。1.8 RT-qPCR 采用RT-qPCR檢測各組大鼠脊髓中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（neurotrophin-3，NT3）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF），以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列信息見表1，將引物離心（轉(zhuǎn)速13 000 rpm，5 min），根據(jù)標(biāo)示量，加入滅菌水至終濃度10 μmol/L，溶解后分裝，-20 ℃以下保存?zhèn)溆?。組織總RNA提取后，在260/280 nm下測定純度和濃度（A260/A280=1.8-2.0）；核酸電泳檢測RNA完整性（28 s、18 s）。根據(jù)通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV合成互補(bǔ)DNA。熒光染料采用SYBR Green PCR Mix。配制總反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共45個循環(huán)。每個指標(biāo)/樣本均做3個技術(shù)重復(fù)，要求3個重復(fù)產(chǎn)生的Ct值偏差不超過0.5。當(dāng)樣本Ct值的偏差超過0.5時，可將明顯偏離的孔扣除后計(jì)算；當(dāng)3個孔Ct值的偏差均超過1.0，樣本數(shù)據(jù)不采用?？瞻卓證t值要大于35，當(dāng)Ct值偏小時，數(shù)據(jù)不采用。樣本擴(kuò)增后的溶解曲線應(yīng)只有一個峰。Roche lightcycler 480輸出原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)出文件。采用2-ΔΔCt計(jì)算樣本各指標(biāo)mRNA表達(dá)水平。

表1 目的基因及內(nèi)參基因的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene and internal reference gene

1.9 免疫組織化學(xué)法檢測NGF 脊髓前角區(qū)蛋白表達(dá)及分布情況取大鼠脊髓切片，脫蠟，脫苯，入水，抗原高壓修復(fù)，孵育，加30 μl NGF一抗，37 ℃孵育90 min，清洗，加二抗，37 ℃孵育30 min，清洗，加DAB顯色劑后，在顯微鏡下控制染色深淺，水洗，襯染，藍(lán)化，脫水，透明，封片。利用數(shù)字掃描儀進(jìn)行掃描，adimec Q-12A-180Fc相機(jī)拍照，用CaseViewer 2.4軟件放大400倍觀察脊髓前角區(qū)域。使用IPP 6.0圖像分析軟件對圖像進(jìn)行分析，測定組織中顯示棕色的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均吸光度值。每個樣本分別統(tǒng)計(jì)5個視野，結(jié)果取均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Tukey法[7-8]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 術(shù)后2周，即灌胃前，5組BBB評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組之間的BBB評分兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后4周，即灌胃2周后，5組BBB評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組之間的BBB評分兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后6周，即灌胃4周后，5組BBB評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組BBB評分低于中藥高濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組分別與中藥中、低濃度組BBB評分比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥高濃度組BBB評分高于中藥中、低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥中濃度組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后8周，即灌胃6周后，5組BBB評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組BBB評分低于中藥高濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組分別與中藥中、低濃度組BBB評分比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥高濃度組BBB評分高于中藥中、低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥中濃度組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后10周，即灌胃8周后，5組BBB評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組BBB評分低于中藥高、中濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥高濃度組BBB評分高于中藥中、低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥中濃度組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 五組大鼠肢體運(yùn)動功能指數(shù)評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale scores of motor function of the five groups of rats

表2 五組大鼠肢體運(yùn)動功能指數(shù)評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale scores of motor function of the five groups of rats

注：a表示與假手術(shù)組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與中藥高濃度組比較，P<0.05

組別 術(shù)前 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后6周 術(shù)后8周 術(shù)后10周假手術(shù)組 21.00±0.00（n=24） 20.07±0.00（n=24） 21.00±0.00（n=16） 21.00±0.00（n=16） 21.00±0.00（n=8） 21.00±0.00（n=8）a模型組 21.00±0.00（n=24） 10.78±1.43（n=24）a 11.05±4.52（n=16）a 12.33±1.42（n=16）a 13.46±1.66（n=8）a 15.52±1.05（n=8）a中藥高濃度組 21.00±0.00（n=16） 10.21±1.72（n=16）a 12.25±1.78（n=16）a 15.15±1.36（n=16）ab 17.62±1.49（n=8）ab 19.33±1.18（n=8）ab中藥中濃度組 21.00±0.00（n=16） 10.57±1.64（n=16）a 11.94±1.52（n=16）a 13.51±1.25（n=16）ac 15.25±1.64（n=8）ac 17.46±1.23（n=8）abc中藥低濃度組 21.00±0.00（n=16） 10.39±1.67（n=16）a 11.68±1.15（n=16）a 13.39±1.46（n=16）ac 14.34±1.39（n=8）ac 16.90±1.35（n=8）ac F值 216.40 152.60 122.60 38.38 31.58 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2 尼氏染色 染色切片中可見顆粒狀的小神經(jīng)元和斑塊狀脊髓運(yùn)動神經(jīng)元中的尼氏體嗜堿性物質(zhì)被染成淺紫色，散在均勻分布于核周細(xì)胞質(zhì)及樹突內(nèi)，而軸突內(nèi)缺失。脊髓前角中正常運(yùn)動神經(jīng)元胞體較大且成多邊形，尼氏體數(shù)目較多，代謝合成旺盛，通過尼氏染色可清晰反映其數(shù)量和細(xì)胞功能。術(shù)后2周，即灌胃前，假手術(shù)組脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元形態(tài)正常，無損傷，可見大量虎斑狀尼氏體，豐富飽滿；模型組脊髓前角神經(jīng)元細(xì)小，細(xì)胞形態(tài)由多極形狀變?yōu)閳A形，分布稀疏，并形成較多空洞，細(xì)胞內(nèi)尼氏體溶解減少甚至消失；在術(shù)后6周、10周時，中藥高、中濃度組脊髓前角神經(jīng)元雖有一定程度損傷，但細(xì)胞形態(tài)豐滿、可見細(xì)胞內(nèi)虎斑狀尼氏體；中藥低濃度組脊髓前角可見少量空泡，神經(jīng)元細(xì)胞分布略稀疏，單個細(xì)胞內(nèi)尼氏體數(shù)目比中藥高、中濃度組含量少，見圖1。

圖1 不同時間點(diǎn)各組大鼠脊髓前角尼氏染色（×400，n=4）Figure 1 Nissl's staining results of anterior horn of spinal cord in rats at different time points

術(shù)后2周，假手術(shù)組正常神經(jīng)元數(shù)目多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后6周，5組正常神經(jīng)元數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組正常神經(jīng)元數(shù)目多于模型組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；假手術(shù)組正常神經(jīng)元數(shù)目與中藥高濃度組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組正常神經(jīng)元數(shù)目少于中藥高濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組正常神經(jīng)元數(shù)目分別與中藥中、低濃度組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥高濃度組正常神經(jīng)元數(shù)目多于中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥高濃度組正常神經(jīng)元數(shù)目與中藥低濃度組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥中濃度組正常神經(jīng)元數(shù)目與中藥低濃度組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后10周，5組正常神經(jīng)元數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中假手術(shù)組正常神經(jīng)元數(shù)目多于模型組、中藥低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；假手術(shù)組正常神經(jīng)元數(shù)目與中藥高、中濃度組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組正常神經(jīng)元數(shù)目少于中藥高濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組正常神經(jīng)元數(shù)目分別與中藥中、低濃度組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥高濃度組正常神經(jīng)元數(shù)目與中藥中、低濃度組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中藥中濃度組正常神經(jīng)元數(shù)目與中藥低濃度組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 五組大鼠脊髓前角神經(jīng)元數(shù)目比較（±s，n=4）Table 3 The number of healthy neurons positive for Nissl's stain in the anterior horn of the spinalcord of the five groups of rats

表3 五組大鼠脊髓前角神經(jīng)元數(shù)目比較（±s，n=4）Table 3 The number of healthy neurons positive for Nissl's stain in the anterior horn of the spinalcord of the five groups of rats

注：a表示與假手術(shù)組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與中藥高濃度組比較，P<0.05；d表示t值；-表示無相關(guān)數(shù)據(jù)

組別 術(shù)后2周 術(shù)后6周 術(shù)后10周假手術(shù)組 16.50±2.27 15.00±1.65 16.25±2.10模型組 8.75±2.59a 9.00±2.24a 10.25±1.37a中藥高濃度組 - 13.75±1.89b 14.51±2.17b中藥中濃度組 - 11.00±2.66a 12.75±2.03中藥低濃度組 - 10.00±1.55ac 10.75±1.79a F（t）值 4.501d 6.193 6.954 P值 0.004 0.004 0.002

2.3 RT-qPCR結(jié)果 術(shù)后2周，即灌胃前，假手術(shù)組與模型組的NGF、NT3、GDNF的mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后6周，5組NGF mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥高濃度組NGF mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組、模型組和中藥低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。5組NT3 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥高濃度組NT3 mRNA表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。5組GDNF mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥高濃度組GDNF mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組、模型組和中藥中、低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后10周，5組NGF、NT3、GDNF的mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 五組大鼠NGF、NT3、GDNF的mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=4）Table 4 Comparison of mRNA of NGF，NT3 and GDNF of the five groups of rats

表4 五組大鼠NGF、NT3、GDNF的mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=4）Table 4 Comparison of mRNA of NGF，NT3 and GDNF of the five groups of rats

注：a表示與假手術(shù)組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與中藥高濃度組比較，P<0.05；d表示t值；-表示無相關(guān)數(shù)據(jù)

組別 NGF mRNA NT3 mRNA GDNF mRNA術(shù)后2周 術(shù)后6周 術(shù)后10周 術(shù)后2周 術(shù)后6周 術(shù)后10周 術(shù)后2周 術(shù)后6周 術(shù)后10周假手術(shù)組 1.00±0.15 0.94±0.15 0.88±0.28 1.00±0.18 1.01±0.12 0.68±0.18 1.00±0.17 0.60±0.05 0.36±0.17模型組 0.96±0.23 3.75±1.12 1.04±0.14 1.01±0.30 0.93±0.14 0.83±0.26 1.06±0.59 2.42±0.24 0.68±0.59中藥高濃度組 - 5.38±1.83ab 1.20±0.39 - 1.36±0.09b 0.83±0.08 - 6.32±2.89ab 0.51±0.17中藥中濃度組 - 2.59±0.79 0.84±0.23 - 1.17±0.21 0.64±0.18 - 2.09±0.66c 0.31±0.13中藥低濃度組 - 2.42±0.74c 1.13±0.24 - 1.11±0.10 0.58±0.07 - 1.41±0.55c 0.78±0.79 F（t）值 0.272d 7.274 1.231 0.052d 4.196 1.550 0.164d 8.021 0.649 P值 0.797 0.005 0.349 0.961 0.030 0.250 0.876 0.004 0.639

2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果 術(shù)后2、6、10周的假手術(shù)組和模型組中脊髓前角神經(jīng)元NGF染色程度較淺，呈彌漫性稀疏分布；中藥高、中濃度組大鼠的脊髓前角神經(jīng)元NGF染色較明顯，細(xì)胞形態(tài)完整，見圖2。大鼠術(shù)后2周時，即灌胃前，假手術(shù)組與模型組的大鼠脊髓前角神經(jīng)元NGF平均積分光密度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后6周，5組NGF平均積分光密度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥高濃度組NGF平均積分光密度值高于假手術(shù)組和模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后第10周，5組NGF平均積分光密度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表5。

圖2 不同時間點(diǎn)各組大鼠脊髓前角NGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400，n=4）Figure 2 Immunohistochemistry results of NGF in the anterior horn of spinal cord of rats at different time points

表5 五組大鼠NGF平均積分光密度值比較（±s，n=4）Table 5 Comparison of mean integrated optical density of NGF of the five groups of rats

表5 五組大鼠NGF平均積分光密度值比較（±s，n=4）Table 5 Comparison of mean integrated optical density of NGF of the five groups of rats

注：a表示與假手術(shù)組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示t值；-表示無相關(guān)數(shù)據(jù)

組別 術(shù)后2周 術(shù)后6周 術(shù)后10周假手術(shù)組 0.23±0.09 0.19±0.05 0.18±0.08模型組 0.25±0.13 0.31±0.07 0.23±0.06中藥高濃度組 - 0.51±0.11ab 0.30±0.09中藥中濃度組 - 0.35±0.09 0.24±0.10中藥低濃度組 - 0.25±0.07 0.21±0.12 F（t）值 0.253c 9.058 0.927 P值 0.809 0.001 0.474

3 討論

結(jié)合古籍及現(xiàn)代醫(yī)家對CSM的認(rèn)識，該病當(dāng)從“痹證”和“痿證”辨證論治[9]，根本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，肝腎不足、氣血虧虛為本，外邪侵襲、經(jīng)絡(luò)不通、風(fēng)寒濕邪客居于經(jīng)脈為標(biāo)[10-12]。益腎養(yǎng)髓方由巴戟天、熟地、丹參、鬼箭羽等9味藥物組成，其中巴戟天補(bǔ)腎溫陽、強(qiáng)筋壯骨，熟地補(bǔ)血滋陰、益精填髓，二者合而為君；丹參、鬼箭羽等活血通經(jīng)、通絡(luò)止痛、暢督脈經(jīng)氣，使藥力達(dá)于頸部。從CSM“本虛標(biāo)痹”的病機(jī)出發(fā)，共奏補(bǔ)肝益腎、活血通經(jīng)之效。

本研究動物行為學(xué)評價(jià)結(jié)果顯示，益腎養(yǎng)髓方能較好的改善大鼠四肢運(yùn)動功能，增加步態(tài)動作協(xié)調(diào)性，在灌胃4周時療效開始顯現(xiàn)，在灌胃8周后效果更為明顯，且中藥高濃度組的改善效果最為顯著。尼氏體由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體組成，其功能是合成更新細(xì)胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類的神經(jīng)調(diào)質(zhì)。代謝功能旺盛的神經(jīng)元中尼氏體特別豐富，當(dāng)神經(jīng)元受到損傷或過度疲勞時，尼氏體可減少、解體甚至消失。在損傷或疲勞恢復(fù)過程中，尼氏體又重新出現(xiàn)、增多，并可至正常水平，故尼氏體可作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)志[13-15]。本研究尼氏焦油紫染色結(jié)果顯示，中藥高、中濃度組可以有效增加脊髓前角正常神經(jīng)元的數(shù)量，同時提高神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)尼氏體數(shù)量，提示中藥能增強(qiáng)細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)合成的能力，與動物行為學(xué)結(jié)果一致。動物行為學(xué)和尼氏焦油紫染色結(jié)果均提示高、中濃度的益腎養(yǎng)髓方能起到保護(hù)脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞、改善運(yùn)動功能的作用。

NGF、NT3、GDNF是促進(jìn)脊髓修復(fù)較為經(jīng)典的神經(jīng)營養(yǎng)因子，中藥增加神經(jīng)元數(shù)量可能與促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌有關(guān)。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子中目前研究最明確的分子之一，當(dāng)神經(jīng)元受到機(jī)械刺激、缺血缺氧時，NGF增加并作用于含有相關(guān)受體的神經(jīng)元細(xì)胞，使脊髓損傷后的神經(jīng)再生、組織重塑和功能恢復(fù)[16]，對于延緩神經(jīng)退行性病變，或者刺激脊髓損傷患者運(yùn)動神經(jīng)的生長，其效果尤為顯著，已有研究證實(shí)NGF是治療受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生的有效藥物[17]。NT3與NGF的氨基酸序列類似，其能作用于皮質(zhì)脊髓束，促進(jìn)細(xì)胞軸突生長，提高運(yùn)動行走的能力，且不會刺激感覺神經(jīng)元產(chǎn)生疼痛相關(guān)反應(yīng)[18-20]。GDNF是很強(qiáng)的膽堿能運(yùn)動神經(jīng)營養(yǎng)因子，其能促進(jìn)神經(jīng)元的軸突生長，減少神經(jīng)元凋亡。在用損傷誘導(dǎo)的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元退變模型中，用GDNF治療可防止50%神經(jīng)元的丟失，且使運(yùn)動神經(jīng)元體積增大，起到支持神經(jīng)元存活的作用[21-23]。眾多研究報(bào)道中藥復(fù)方或中藥單體可以提高NGF、NT3、GDNF水平，達(dá)到促進(jìn)脊髓神經(jīng)修復(fù)的作用[24-28]。本研究RT-qPCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，造模后第2周到第10周，模型組、假手術(shù)組NGF的mRNA表達(dá)處于較低水平，其中第4周模型組比假手術(shù)組水平稍高，但不顯著。在益腎養(yǎng)髓方灌胃4周時，中藥高濃度組能顯著提高脊髓中NGF的mRNA表達(dá)水平，同時也能促進(jìn)的NGF蛋白表達(dá)增加，特別是脊髓前角中大神經(jīng)元更為顯著。但在灌胃8周時，NGF的mRNA表達(dá)又回落到較低水平，NT3和GDNF的mRNA表達(dá)情況也與NGF類似。這提示大鼠自身針對外界的機(jī)械損傷有一定程度的自我修復(fù)作用，但并不明顯，中藥干預(yù)后能顯著增加神經(jīng)元的自我修復(fù)功能，刺激神經(jīng)元生長，進(jìn)而緩解慢性壓迫脊髓造成的病變；在中藥干預(yù)后期，中藥組NGF、NT3、GDNF的mRNA表達(dá)降低，并與假手術(shù)組趨于一致，這可能是脊髓內(nèi)的修復(fù)過程基本完成，大鼠運(yùn)動功能和神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)已有較大改善，故脊髓中相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子的需求和合成有所降低，也間接提示脊髓型頸椎病早期治療干預(yù)的意義較大。

綜上所述，益腎養(yǎng)髓方可明顯改善CSM模型大鼠的四肢運(yùn)動功能，增加脊髓前角中正常功能運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)量。同時顯著增加脊髓中NGF、NT3、GDNF的mRNA表達(dá)水平，以及脊髓前角神經(jīng)元中NGF的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用。

作者貢獻(xiàn)：陳忻、朱立國進(jìn)行研究思路設(shè)計(jì)并對文章負(fù)責(zé)；唐彬進(jìn)行研究實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文；銀河進(jìn)行研究的質(zhì)量控制及審校；楊博文、金哲峰、秦曉寬、劉志偉、魏戌、孫凱、齊寶玉參與動物實(shí)驗(yàn)實(shí)施評估、技術(shù)操作和資料收集。

本文無利益沖突。