基于UPLC-Q-TOF-MS/MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的壯腰通絡(luò)方延緩腰椎間盤(pán)退行性病變的化學(xué)成分及作用機(jī)制研究

孫凱，朱立國(guó)，2*，魏戌*，銀河，李秋月，秦曉寬，楊博文

本研究創(chuàng)新性：

本研究采用超高效液相色譜法—四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)初步闡明了壯腰通絡(luò)方中包含的化學(xué)成分，并進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法解析了其藥效靶點(diǎn)、生物途徑及作用機(jī)制，為該方深入的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供了參考依據(jù)。

本研究局限性：

壯腰通絡(luò)方中包含的化學(xué)成分十分復(fù)雜，通過(guò)高分辨質(zhì)譜技術(shù)鑒定出的化學(xué)成分仍十分有限，且未明確鑒定出的化學(xué)成分是否均能進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥理作用。此外，盡管開(kāi)展了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)分析，初步闡明了其可能的作用機(jī)制，但未能結(jié)合關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

腰椎間盤(pán)退行性病變（lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD）是導(dǎo)致腰椎退行性疾病發(fā)生的最重要的病理基礎(chǔ)。隨著社會(huì)老齡化的加劇，腰椎退行性疾病已成為嚴(yán)重危害人們生命健康的重大慢性疾病，且患病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1-2]，該類(lèi)疾病具有遷延難愈、復(fù)發(fā)率及致殘率高等臨床特點(diǎn)。研究表明，2013年中國(guó)人群腰背痛所致傷殘損失壽命年為1 634.7萬(wàn)人年，是中國(guó)人群傷殘負(fù)擔(dān)的第一原因，給人們帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[3]。LIDD是該類(lèi)疾病發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，其病理機(jī)制涉及炎癥刺激、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等多種復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，因此，如何有效延緩椎間盤(pán)退變進(jìn)程是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[4-6]。

壯腰通絡(luò)方為首都名中醫(yī)朱立國(guó)教授基于長(zhǎng)期臨床實(shí)踐凝練的有效經(jīng)驗(yàn)方。前期臨床觀察表明其能有效緩解腰椎間盤(pán)突出癥患者腰膝酸軟、疼痛不適等癥狀及改善日常活動(dòng)受限等功能評(píng)分，4周治療有效率達(dá)82.22%，具有較好的安全性[7]。但在完成臨床療效觀察的基礎(chǔ)上，該方潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，且藥物的作用靶點(diǎn)、生物途徑及作用機(jī)制也未闡明。近年來(lái)，超高效液相色譜法—四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC-QTOF-MS/MS）技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)迅猛發(fā)展。UPLC-QTOF-MS/MS為快速鑒定中藥復(fù)方中所包含的已知化學(xué)成分及發(fā)現(xiàn)未知的化合物提供了有力的技術(shù)支撐，目前已廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分檢測(cè)和表征的分析[8-10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在系統(tǒng)闡釋中藥復(fù)方、單味藥靶標(biāo)及作用機(jī)制，解析藥物組合規(guī)律及中藥功效異同，了解疾病和證候的生物學(xué)基礎(chǔ)等方面發(fā)揮了重要作用，尤其是廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方機(jī)制研究，為明確中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的分子作用機(jī)制提供了研究平臺(tái)[11-12]。

因此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，基于“成分—靶點(diǎn)—通路”的網(wǎng)絡(luò)模式，初步揭示壯腰通絡(luò)方的有效成分及其治療LIDD的潛在作用機(jī)制，為該方進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間 2020年。

1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS實(shí)驗(yàn)儀器與試劑藥品

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 液相系統(tǒng)為日本島津超高效液相色譜儀（Shimadzu LC30），質(zhì)譜系統(tǒng)為SCIEX 5600+質(zhì)譜儀（美國(guó)，AB Sciex Instruments，型號(hào)TripleTOF 5600+，Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer），CPA225D電子分析天平〔賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司〕，SC-3160低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），ALC-M Tissue—Organ Bath System（上海奧爾科特生物科技有限公司）等。

1.2.2 試劑藥品 色譜純甲醇、質(zhì)譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈、質(zhì)譜級(jí)乙腈〔購(gòu)于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司〕；分析純95%乙醇、分析純甲醇（北京化工廠）；甲酸為質(zhì)譜純（美國(guó)Sigma公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）等。壯腰通絡(luò)方（由杜仲15 g、熟地黃15 g、當(dāng)歸12 g、丹參12 g等9味中藥組成）藥物購(gòu)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，經(jīng)鑒定為合格藥材，飲片質(zhì)量符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版（第十版）有關(guān)規(guī)定[13]。松脂醇二葡萄糖苷（批號(hào)：111537-201706，規(guī)格：20 mg）、地黃苷D（批號(hào)：112063-202001，規(guī)格：20 mg）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201915，規(guī)格：50 mg）、丹參酮ⅡA（批號(hào)：110766-201721，規(guī)格：20 mg）等標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（均符合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）。

1.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 壯腰通絡(luò)方供試品及對(duì)照品溶液制備 按照標(biāo)準(zhǔn)的湯劑提取工藝方法，將壯腰通絡(luò)方的中藥飲片放入容器內(nèi)，加入8倍生藥量去離子水，充分浸泡30 min，大火煮沸后改小火煎煮40 min瀝出藥液至清潔容器，再次加入6倍藥量重的去離子水煎煮40 min濾出藥液，將兩次煎煮獲得的藥液混勻得到最終提取濾液，隨后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至小體積，用去離子水定容至生藥濃度0.1 g/ml，13 000 rpm離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液制備：用精密天平分別稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品5 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇各自溶解、搖勻，定容，得到各標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液母液，根據(jù)需要再用甲醇稀釋為所需濃度。

1.3.2 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC X Bridge? BEH C18 Column 2.5 μm，2.1 mm×50 mm；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水，B為乙腈，洗脫程序見(jiàn)表1。體積流量0.3 ml/min；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用正/負(fù)離子模式（ESI+/-）、IDA模式，掃描范圍m/z 50～1 500，掃描時(shí)間0.2 s，碰撞電壓為35 V，毛細(xì)管電壓為4 500 V（負(fù)離子）和5 500 V（正離子），離子源溫度為400 ℃（負(fù)離子）和550 ℃（正離子），去簇電壓為60 V。氣簾氣流量為25 L/min，Gas1和Gas2氣流量均為50 L/min，氣體均為氮?dú)狻?/p>

表1 梯度洗脫程序信息Table 1 Gradient elution program information

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)供試品中一級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰的比對(duì)，以及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析，對(duì)復(fù)方供試品中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，通過(guò)對(duì)照品對(duì)鑒定的化學(xué)成分進(jìn)一步確定。采用Peakview 2.2軟件采集和處理數(shù)據(jù)，將主要色譜峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量與自建的化學(xué)成分信息庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)各化合物的分子式，結(jié)合對(duì)照品質(zhì)譜碎片信息對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法

1.4.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件 使用的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)或軟件主要包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[14]，PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[15]，SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[16]，GeneCards? Version 5.0：The Human Gene Database（https://www.genecards.org/）[17]，OMIM?-Online Mendelian Inheritance in Man?（https://www.omim.org/）[18]，DisGeNET Database（http://www.disgenet.org/web/DisGeNE）[19]，Uniprot Database（http://www.uniprot.org/）[20]，Metascape（https://metascape.org/gp/index.html），pharmGKB Database（https://www.pharmgkb.org/），STRING 11.0（https://string-db.org/），Venny 2.1在 線 軟 件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），NCBI GEO（Gene Expression Omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），Cytoscape 3.5.1軟件等。

1.4.2 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析壯腰通絡(luò)方化學(xué)成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析獲得壯腰通絡(luò)方化學(xué)成分，并結(jié)合文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)最終確認(rèn)。隨后逐一查詢(xún)化合物的SMILE結(jié)構(gòu)，在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)配體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)成分作用靶點(diǎn)，與TCMSP中收集的化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)照，最終確定藥物潛在靶點(diǎn)全稱(chēng)，隨后通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白名稱(chēng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，選擇物種為“Homo Sapiens”，獲得唯一的Unipot ID號(hào)，去除重復(fù)后即得到每個(gè)藥物及成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4.3 LIDD疾病靶點(diǎn)獲取 LIDD疾病靶點(diǎn)的收集來(lái)源于GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)、pharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)這些數(shù)據(jù)庫(kù)收集挖掘疾病靶點(diǎn)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲得唯一的Unipot ID號(hào)，即得到LIDD疾病靶點(diǎn)。

1.4.4 壯腰通絡(luò)方治療LIDD的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取 在獲得藥物成分及其靶點(diǎn)后，通過(guò)Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建中藥—活性成分—藥物靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)，通過(guò)軟件將中藥預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得壯腰通絡(luò)方治療LIDD的交集靶點(diǎn)。

1.4.5 靶點(diǎn)蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析（protein-protein interaction analysis，PPI） 將獲得的共有靶點(diǎn)上傳至在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇類(lèi)型為“Homo Sapiens”，設(shè)置參數(shù)評(píng)分值>0.4，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，同時(shí)去掉PPI網(wǎng)絡(luò)中的孤立蛋白，導(dǎo)出PPI分析結(jié)果，并提取其網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)蛋白。

1.4.6 靶點(diǎn)基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG） 通路富集分析通過(guò)Metascape在線軟件中Geneenrichment富集分析對(duì)獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析，主要包括生物過(guò)程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、細(xì)胞成分（cellularcomponent，CC）三個(gè)類(lèi)別，獲得富集分析的結(jié)果（P<0.05）。然后通過(guò)Cytoscape 3.5.1軟件中的“ClueGO”插件對(duì)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，獲得顯著富集的信號(hào)通路（P<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的壯腰通絡(luò)方化學(xué)成分 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)復(fù)方供試液及對(duì)照品溶液進(jìn)行了正離子、負(fù)離子全掃描，獲得正、負(fù)離子模式下的總離子色譜圖，見(jiàn)圖1。根據(jù)色譜信息（色譜峰保留時(shí)間、紫外吸收特征等）和質(zhì)譜信息（精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片等）與對(duì)照品比對(duì)，并結(jié)合文獻(xiàn)分析，共鑒定出壯腰通絡(luò)方中129種化學(xué)成分，其中正離子模式下獲得98種，負(fù)離子模式下獲得31種。化學(xué)成分包括丹酚酸A、丹酚酸B、阿魏酸、芥子酸、大黃酚等多種酚酸類(lèi)化合物，丹參酮ⅡA、去氫丹參酮ⅡA、異丹參酮Ⅱ等多種醌類(lèi)化合物，洋川芎內(nèi)酯K、洋川芎內(nèi)酯N等多種苯酞內(nèi)酯類(lèi)化合物，具體見(jiàn)表2。

圖1 壯腰通絡(luò)方總離子流Figure 1 Total ion flow of Zhuangyaotongluo decoction

表2 壯腰通絡(luò)復(fù)方化學(xué)成分鑒定結(jié)果Table 2 Chemical constituents identified in Zhuangyaotongluo decoction

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.2 LIDD疾病靶點(diǎn)獲取 通過(guò)GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)、pharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得LIDD疾病靶點(diǎn)1 123個(gè)、2個(gè)、5個(gè)、5個(gè)、1 868個(gè)，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化去重后獲得2 873個(gè)，即為L(zhǎng)IDD相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

2.3 壯腰通絡(luò)方—活性成分—藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)映射 通過(guò)Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析的壯腰通絡(luò)方—活性成分—藥物靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)過(guò)篩選共獲得壯腰通絡(luò)方中9味藥物包含的129種化學(xué)成分，其對(duì)應(yīng)的藥物成分靶點(diǎn)共203個(gè)，見(jiàn)圖2；通過(guò)軟件對(duì)LIDD疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得96個(gè)壯腰通絡(luò)方治療LIDD的作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖2 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析的壯腰通絡(luò)方—活性成分—藥物靶點(diǎn)可視化圖Figure 2 Visualization of Zhuangyaotongluo decoction—active ingredients—action targets based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

圖3 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的壯腰通絡(luò)方活性成分靶點(diǎn)——疾病靶點(diǎn)韋恩圖Figure 3 Venn diagram of active ingredient targets of Zhuangyaotongluo decoction based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將獲得的96個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0在線數(shù)據(jù)庫(kù)形成PPI互作網(wǎng)絡(luò)，獲得相應(yīng)的相互作用信息，見(jiàn)圖4，并根據(jù)Count值提取了網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，主要包括絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、胰島素蛋白（INS）、白介素6（IL-6）、原癌基因蛋白（FOS）、胱天蛋白酶3（CASP3）等，列舉了排名前30的關(guān)鍵蛋白，見(jiàn)圖5。

圖4 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析的壯腰通絡(luò)方治療LIDD的PPIFigure 4 PPI network of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

圖5 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析的壯腰通絡(luò)方治療LIDD的PPI關(guān)鍵靶點(diǎn)（排名前30）Figure 5 The key targets of PPI network of Zhuangyaotongluo decoction in the treatment of LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis（top 30）

2.5 GO生物功能注釋 通過(guò)Metascape在線軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行了分析，共確定了1 022條BP信息，主要包括平滑肌的適應(yīng)性、對(duì)發(fā)熱的積極調(diào)節(jié)、發(fā)熱的調(diào)節(jié)、前列腺增生、發(fā)熱生成等；28條CC信息，主要包括過(guò)氧物酶體、微生物、細(xì)胞膜上的膜筏、膜微域、膜區(qū)等；51條MF信息，主要包括一氧化二氮合成酶調(diào)節(jié)器的活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄輔助因子的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活劑結(jié)合、核受體活動(dòng)、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合等。見(jiàn)圖6。

圖6 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析的壯腰通絡(luò)方治療LIDD的GO富集分析（排名前10）Figure 6 GO enrichment analysis of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis in terms of information regarding biological process，cellular components and molecular function（top 10）

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共確定了98條相關(guān)信號(hào)通路，其條目中主要包括的信號(hào)通路為：HIF-1 signaling pathway，JAK-STAT signaling pathway，Relaxin signaling pathway，p53 signaling pathway，MAPK signaling pathway，F(xiàn)c epsilon RI signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，TNF signaling pathway，AMPK signaling pathway等（P<0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析的壯腰通絡(luò)方治療LIDD的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG analysis of signaling pathways of Zhuangyaotongluo decoction for LIDD based on UPLC-Q-TOF-MS analysis

3 討論

中藥復(fù)方的化學(xué)成分十分復(fù)雜，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，因此，在臨床療效確切的基礎(chǔ)上，解析復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及闡明其作用機(jī)制一直是中醫(yī)藥研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)，也是促進(jìn)中藥新藥研發(fā)及推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化面臨的艱巨挑戰(zhàn)[21-22]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者將UPLC-Q/TOF-MS/MS技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法有機(jī)結(jié)合起來(lái)，尤其在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中更為顯著[23-24]。UPLC-Q/TOF-MS/MS技術(shù)的應(yīng)用，為全面、精準(zhǔn)、快速地闡明復(fù)方及其包含的化學(xué)成分提供了強(qiáng)有力的保障。LI等[25]對(duì)高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥成分分析、代謝物分析、藥動(dòng)學(xué)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，發(fā)現(xiàn)其中50%的文獻(xiàn)涉及中藥化學(xué)成分分析，表明該領(lǐng)域目前研究最多。而以網(wǎng)絡(luò)化、系統(tǒng)化為特征的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究與中醫(yī)藥整體觀念不謀而合，其廣泛應(yīng)用于包括中藥靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、活性化合物篩選、中藥方劑網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制等中醫(yī)藥領(lǐng)域研究中，在探索復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[26-27]。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法，分析臨床有效方劑壯腰通絡(luò)方的化學(xué)成分并探討其延緩LIDD的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，壯腰通絡(luò)方具有多種藥物包含同一個(gè)成分，不同成分存在相同靶點(diǎn)及多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)。在質(zhì)譜技術(shù)分析獲得的129個(gè)化學(xué)成分中，如果按照口服生物利用度≥30%、類(lèi)藥性指數(shù)≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，符合要求的化學(xué)成分僅38個(gè)。因此，既往的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析僅依靠這兩個(gè)參數(shù)的篩選，是否會(huì)因?yàn)楹Y選參數(shù)閾值過(guò)高而將可能發(fā)揮藥效作用的化學(xué)成分過(guò)濾掉，這些化學(xué)成分是否均能順利進(jìn)入胃腸道吸收或者成為入血成分，仍有待于進(jìn)一步深入研究。另外，在本研究分析獲得的有效成分中，桃葉珊瑚苷、丹酚酸B等化學(xué)成分已通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠有效延緩椎間盤(pán)退變，其與炎癥抑制、免疫調(diào)節(jié)等作用機(jī)制密切相關(guān)[28-29]，壯腰通絡(luò)方中的其他化學(xué)成分也包含抗炎、止痛、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、延緩衰老等藥理功效[30-31]。這些均可以作為今后體內(nèi)外干預(yù)試驗(yàn)中重點(diǎn)關(guān)注的化學(xué)成分。

從PPI蛋白相互作用關(guān)系的結(jié)果來(lái)看，關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程，其參與介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路在椎間盤(pán)退變中發(fā)揮重要作用[32]。IL-6作為IL家族中最重要的炎性細(xì)胞因子，是椎間盤(pán)退變過(guò)程中炎癥發(fā)生和參與的重要遞質(zhì)，值得在研究中密切關(guān)注[33]。從GO富集分析和KEGG通路富集分析來(lái)看，涉及的生物學(xué)過(guò)程主要包括對(duì)miRNA基因沉默中涉及的miRNA產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞組成主要包括細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞器膜等；分子功能主要包括RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活劑結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG信號(hào)通路主要集中在炎癥、血管生成、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化因子等相關(guān)信號(hào)通路。WU等[34]采用HIF-1alpha敲除小鼠模型證實(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）通過(guò)HIF-1α/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路對(duì)髓核細(xì)胞存活和細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用，在椎間盤(pán)退變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CHEN等[35]采用人和大鼠中的髓核組織標(biāo)本證明了IL-21參與了椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程，其可通過(guò)STAT信號(hào)通路刺激TNF-α，從而加重椎間盤(pán)退變。Janus激酶（JAK）/轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)通路是一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過(guò)程?？傊?，壯腰通絡(luò)方可能是通過(guò)介導(dǎo)這些關(guān)鍵信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮治療作用的，有待于未來(lái)進(jìn)一步結(jié)合關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)初步闡明了壯腰通絡(luò)方中包含的化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從多個(gè)角度探索了其延緩LIDD的潛在分子機(jī)制，明確了其藥效關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路，為該方進(jìn)一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供了參考依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：孫凱負(fù)責(zé)文章撰寫(xiě)與修改；秦曉寬、楊博文進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作及制圖；銀河、李秋月指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作，負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)核對(duì)；朱立國(guó)、魏戌負(fù)責(zé)研究的設(shè)計(jì)與可行性分析，對(duì)文章進(jìn)行質(zhì)量把控及審校，整體負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。