長(zhǎng)鏈非編碼RNA A-30-P01019163對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞βB2晶體蛋白表達(dá)的調(diào)控及對(duì)顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響

劉勝楠， 李美慧， 李 勵(lì)， 黃 瑋， 張俊潔

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200433

不孕癥在成年育齡人群中的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢(shì)，我國(guó)不孕癥發(fā)病率為7%～10%，病因主要為女方因素、男方因素和不明原因性不孕[1]。女性因素中常見原因包括子宮異常、激素水平異常及排卵障礙。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些生物學(xué)因素與卵巢發(fā)育及排卵障礙密切相關(guān)[2-3]。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道影響卵巢發(fā)育的原因，但是具體分子機(jī)制仍待進(jìn)一步探究。

在影響卵巢發(fā)育的因素中，卵巢中顆粒細(xì)胞因素較為重要。卵泡發(fā)育、排卵過程及黃體形成都需要顆粒細(xì)胞參與，這體現(xiàn)顆粒細(xì)胞在卵巢發(fā)育中的重要性。顆粒細(xì)胞的功能直接影響女性的生殖功能，并與卵泡增殖、分化和凋亡等的 改變密切相關(guān)，直接影響卵泡發(fā)育和卵巢排卵[4-5]。

本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，βB2晶體蛋白(βB2 crystallin，CryBB2)基因全敲雄性小鼠生殖能力降低，可能由生殖細(xì)胞增殖和凋亡紊亂所致。在CryBB2蛋白對(duì)卵巢初步作用研究[7]中發(fā)現(xiàn)，CryBB2表達(dá)于健康人及小鼠的卵巢中，在小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，且CryBB2敲除小鼠的卵巢結(jié)構(gòu)及功能顯著有別于正常同齡小鼠。有研究[8]采用基因芯片、生物信息學(xué)分析及qRT-PCR等方法驗(yàn)證了lncRNA A-30-P01019163(lnc-9163)在CryBB2基因全敲小鼠卵巢組織中表達(dá)下調(diào)。本研究基于課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步探討lnc-9163對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞CryBB2的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 100只C57/B6小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(滬)2017-0002]，飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(軍)2002-011]SPF級(jí)(無特定病原體動(dòng)物級(jí))動(dòng)物房。

1.2 樣品準(zhǔn)備 根據(jù)小鼠的年齡將其分為5組：剛出生、出生后1周、2周、1個(gè)月及3個(gè)月，每組至少4只，腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG，HOR-272，PROSPEC)10 U，腹腔內(nèi)留存48 h。麻醉后頸椎脫臼處死，取其卵巢組織即刻進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞分離與培養(yǎng) 常規(guī)消毒，取雙側(cè)卵巢放入無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于DMEM/F12培養(yǎng)液[含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)、100 U/mL雙抗]中。在光鏡顯微鏡下用25號(hào)針頭刺破卵巢表面的卵泡，使顆粒細(xì)胞釋放于培養(yǎng)液中。300 ×g離心5 min，洗滌2次，棄上清。取DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)液2 mL加入沉淀在離心管底的細(xì)胞團(tuán)中，并制成單細(xì)胞懸液。將收集到的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞懸液接種于含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液的6 cm培養(yǎng)皿中，每2個(gè)卵巢細(xì)胞1個(gè)皿，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后棄培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)液洗1次，用0.25% Tryspin-EDTA胰酶消化細(xì)胞，同等體積含血清培養(yǎng)液終止消化，收集所有培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞液，300 ×g離心5 min，棄上清，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106～1×107個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于24孔板或6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 體內(nèi)過表達(dá) lnc-9163 AAV構(gòu)建及小鼠尾靜脈注射 lnc-9163片段、AAVrh10載體均購(gòu)自維真生物公司，AAVrh10載體過表達(dá)lnc-9163及對(duì)照病毒構(gòu)建、包裝均由上海和元生物有限公司完成。-80°C保存病毒。用無菌PBS稀釋病毒，按照5×109滴度/只經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，3周后開始分選顆粒細(xì)胞(圖1)。

圖1 過表達(dá)lnc-9163小鼠模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

1.5 過表達(dá)和干擾lnc-9163人卵巢顆粒細(xì)胞株KGN構(gòu)建 慢病毒載體pLenR、lnc-9163干擾序列購(gòu)自中喬新州公司，慢病毒核心元件質(zhì)粒構(gòu)建也由該公司完成，KGN、293T細(xì)胞由海軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物教研室饋贈(zèng)。按照流程制備好過表達(dá)和干擾lnc-9163病毒以及對(duì)照病毒，將病毒加入KGN細(xì)胞中，培養(yǎng)7 d后根據(jù)載體上的真核抗性篩選細(xì)胞。

1.6 反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol試劑提取小鼠卵巢組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。采用熒光定量PCR儀(Rchoe公司)，試劑盒為SYBR-Green PCR Kit(TaKaRa公司)。反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s循環(huán)40次。采用GADPH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取小鼠卵巢組織總蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，調(diào)整為2.5 g/L，按比例加入十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液(5×)，105 ℃加熱10 min變性，每孔上樣20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入兔抗lnc-9163多克隆抗體(Abcam公司，ab121884，稀釋比例1∶500)，4 ℃孵育過夜，加入1∶10 000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊多克隆抗體， KPL公司)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白細(xì)胞周期相關(guān)蛋白D1(cyclin D1,1∶1 000, ab16663, Abcam公司)，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA, 1∶1 000, ab92552, Abcam公司)、凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)切割體(1∶1 000, ab13847, Abcam公司)、多聚ADP核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1, PARP1)切割體(1∶1 000, ab32064, Abcam公司)。

1.8 5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè) 將各組的顆粒細(xì)胞按照1×104密度接種于小皿中培養(yǎng)備用。按照1∶1 000用培養(yǎng)液稀釋EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C10310-1，廣州銳博生物有限公司)中EdU試劑，在-20 ℃保存，每個(gè)小皿加入100 μL稀釋的EdU試劑，孵育2 h，用甲醇-丙酮液固定細(xì)胞10 min，PBS清洗3～4次，每次5 min。加入500 μL 2 g/L甘氨酸，孵育5 min，PBS清洗2次，每次5 min。加入1 000 μL含0.5% Triton X-100的PBS，孵育10 min，PBS清洗2次，每次5 min。按照試劑盒說明書配制Apollo顯色液，加入500 μL，避光孵育30 min，PBS清洗2次，每次5 min；加入用PBS稀釋的DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色液(1∶1 000稀釋)孵育1 min，PBS清洗1次，避光保存。顯微鏡下觀察熒光染色情況。

1.9 Annexin Ⅴ-PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè) Annexin V-PI試劑盒購(gòu)自Thermo公司(V13242)。將待檢測(cè)細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化約5 min，輕柔吹打至細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)移至EP管中，900 ×g離心3 min，棄上清，加入PBS清洗3次，每次清洗后2 000 ×g離心3 min。加入500 μL結(jié)合緩沖液，輕柔吹打，充分混勻；加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC吹打混勻，靜置1 min；加入5 μL PI，吹打混勻后，于室溫、避光條件下反應(yīng)15 min。流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各通道染色細(xì)胞所占百分比。

1.10 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 TUNEL凋亡試劑購(gòu)自銳博生物有限公司(C11012-1)。將各組顆粒細(xì)胞按照1×104密度種植于小皿中培養(yǎng)備用。用甲醇-丙酮溶液(1∶1體積混合)固定細(xì)胞10 min，加入1 000 μL含0.5% Triton X-100的PBS，孵育10 min，加入可以覆蓋培養(yǎng)皿底部的末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)緩沖液，室溫下反應(yīng)5 min；加入100 μL TdT酶，37 ℃孵育1 h。然后加入適量37 ℃預(yù)熱的洗滌液于37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。按照說明書配制TUNEL反應(yīng)混合液，加入100 μL，室溫下反應(yīng)30 min，用檸檬酸鈉緩沖溶液(SSC，20倍去離子水按1∶10稀釋)終止反應(yīng)(室溫放置10 min)。PBS洗滌3次，每次5 min，用PBS稀釋的DAPI染色液(1∶1 000稀釋)孵育1 min，PBS清洗1次，避光保存，觀察熒光染色情況。

2 結(jié) 果

2.1 不同周齡小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中l(wèi)nc-9163的表達(dá) 結(jié)果(圖2)顯示：隨著小鼠周齡增長(zhǎng)，lnc-9163表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，提示lnc-9163可能參與小鼠卵巢發(fā)育過程。

圖2 不同周齡小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中l(wèi)nc-9163的表達(dá)

2.2 lnc-9163過表達(dá)后小鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)CryBB2表達(dá) 通過尾靜脈注射腺病毒方式獲得過表達(dá)lnc-9163的卵巢組織，分選出顆粒細(xì)胞后，qRT-PCR(圖3A)顯示卵巢組織顆粒細(xì)胞中l(wèi)nc-9163表達(dá)增加，提示構(gòu)建過表達(dá)小鼠成功。對(duì)收集的顆粒細(xì)胞采用qRT-PCR(圖3B)和Western 印跡法(圖3C)檢測(cè)CryBB2蛋白表達(dá)，結(jié)果均顯示過表達(dá)組CryBB2表達(dá)水平較對(duì)照組提高了約4倍(P<0.01)。

圖3 卵巢顆粒細(xì)胞過表達(dá)后及CryBB2檢測(cè)

2.3 KGN過表達(dá)及干擾lnc-9163后檢測(cè)CryBB2表達(dá) qRT-PCR(圖4A)顯示過表達(dá)lnc-9163的穩(wěn)定KGN構(gòu)建成功。qRT-PCR(圖4B)和Western 印跡(圖4C)均顯示，lnc-9163過表達(dá)組的CryBB2表達(dá)水平較對(duì)照組提高了近3倍(P<0.05)。針對(duì)lnc-9163片段中3段位點(diǎn)，利用GeneMed軟件設(shè)計(jì)3對(duì)干擾引物序列，并通過pLenR構(gòu)建3種序列，篩選出成功干擾的序列及相應(yīng)細(xì)胞。結(jié)果(圖5A～5C)顯示，干擾lnc-9163后CryBB2 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 過表達(dá)lnc-9163人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN建立及CryBB2表達(dá)檢測(cè)

圖5 干擾lnc-9163的KGN建立及CryBB2表達(dá)檢測(cè)

2.4 lnc-9163促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖 過表達(dá)lnc-9163的KGN細(xì)胞中EdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞在每個(gè)20倍視野下約191個(gè)，而對(duì)照組僅112個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6A、6B)。Western檢測(cè)(圖6C)顯示，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白細(xì)胞周期相關(guān)蛋白D1及增殖細(xì)胞核抗原在過表達(dá)lnc-9163的KGN細(xì)胞中表達(dá)增加(P<0.01)，在干擾lnc-9163的KGN細(xì)胞中表達(dá)減少(P<0.01)。

圖6 lnc-9163促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖

2.5 lnc-9163促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡 TUNEL檢測(cè)結(jié)果(圖7A、7B)顯示，過表達(dá)lnc-9163的顆粒細(xì)胞凋亡增多，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western印跡法檢測(cè)(圖7C)顯示，caspase-3切割體及PARP1切割體在過表達(dá)lnc-9163的顆粒細(xì)胞中表達(dá)均增加(P<0.05)，在干擾lnc-9163的顆粒細(xì)胞中表達(dá)均減少(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖7D)顯示，細(xì)胞中AnnexinⅤ-PI標(biāo)記的凋亡細(xì)胞所占比例與Western印跡法檢測(cè)結(jié)果一致。

圖7 lnc-9163促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡

3 討 論

本研究通過設(shè)計(jì)lnc-9163過表達(dá)以及干擾序列，從體內(nèi)和體外不同模型，分別構(gòu)建了過表達(dá)和干擾lnc-9163顆粒細(xì)胞。過表達(dá)和干擾lnc-9163顆粒細(xì)胞中CryBB2表達(dá)水平也發(fā)生改變，且兩者存在正向調(diào)節(jié)關(guān)系。同時(shí)，lnc-9163可能促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡。結(jié)合前期研究[6]結(jié)果，即CryBB2全敲小鼠的睪丸生殖細(xì)胞增殖和凋亡增多，lnc-9163可能在顆粒細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控CryBB2分子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和凋亡過程。

自從在晶狀體外組織發(fā)現(xiàn)CryBB2的表達(dá)以來，多項(xiàng)研究[9-11]報(bào)道了CryBB2在不同組織中的不同作用。CryBB2可能參與卵巢顆粒細(xì)胞的發(fā)育過程，但對(duì)其調(diào)控機(jī)制仍然未知。前期研究[8]認(rèn)為，lnc-9163可通過P2rx7-Ca2+通道- CryBB2軸來調(diào)控CryBB2基因表達(dá)。因此，本研究探究lnc-9163生物學(xué)功能及與CryBB2表達(dá)的關(guān)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠卵巢周齡增加，lnc-9163在顆粒細(xì)胞中表達(dá)增加，這提示lnc-9163可能參與了卵巢發(fā)育過程。過表達(dá)或者干擾lnc-9163后的顆粒細(xì)胞內(nèi)CryBB2蛋白表達(dá)同向改變，也提示lnc-9163與CryBB2可能存在軸向調(diào)控機(jī)制。結(jié)合CryBB2在體內(nèi)生殖細(xì)胞表達(dá)的時(shí)相，推測(cè)lnc-9163可以調(diào)控CryBB2基因的表達(dá)，但是具體調(diào)控機(jī)制仍待后續(xù)深入研究。

越來越多的研究關(guān)注lncRNA在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用，例如Xiong等[12]報(bào)道了lncRNA-Meg3-p53-p66Shc軸可以影響卵巢顆粒細(xì)胞增殖；Kimura等[13]報(bào)道了lncRNA-Amhr2可以通過影響抗苗勒管激素(AMH)的分泌來影響卵巢顆粒細(xì)胞功能。LncRNA與卵巢功能密切相關(guān)，本研究也提示lnc-9163與卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，過表達(dá)lnc-9163可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)生。凋亡和增殖的發(fā)生并不是相反的，也有可能是同向改變，取決于基因?qū)Φ蛲龌蛟鲋诚嚓P(guān)基因的直接作用及所處的組織環(huán)境。Dedera等[14]報(bào)道，E2A-PBX1可以在淋巴結(jié)中同時(shí)促進(jìn)增殖和凋亡；Sakao等[15]認(rèn)為在血管密集的區(qū)域存在凋亡后增殖加快的現(xiàn)象，這是機(jī)體的一種自我保護(hù)，為了維持整體細(xì)胞數(shù)目的平衡。由此推測(cè)lnc-9163可能通過影響CryBB2來促進(jìn)凋亡發(fā)生，而加快的細(xì)胞增殖由顆粒細(xì)胞較強(qiáng)的增殖能力有關(guān)或?yàn)榈蛲龊蟠鷥斝栽鲋场Ｈ欢?，相關(guān)結(jié)論仍需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)lnc-9163在卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育中逐漸升高，參與調(diào)控CryBB2蛋白表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，與凋亡發(fā)生密切相關(guān)。本研究為探索CryBB2分子體內(nèi)調(diào)控機(jī)制以及女性不孕不育分子機(jī)制提供研究思路。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。