重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)及其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

施寧雪，靳晶豪，陳孝仁*

(揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

自1983年引入經(jīng)典的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)方法以來(lái)，核酸擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)滲入到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域當(dāng)中[1]。普通的PCR技術(shù)需要通過(guò)連續(xù)的溫度變化(變性、退火與延伸)來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增，而這些繁瑣的變化過(guò)程需要借助于如PCR儀這樣精密的循環(huán)儀器，這便將實(shí)驗(yàn)限制在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。自1990年以來(lái)，大量的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到應(yīng)用，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、單鏈置換擴(kuò)增技術(shù)[2]、多重鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)[3]、依賴解旋酶的擴(kuò)增技術(shù)[4]、基于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)以及重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)[5]等，這些等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)與基于PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、不需要特殊儀器且反應(yīng)最佳溫度適中(37～42 ℃)等優(yōu)點(diǎn)。

其中值得注意的一項(xiàng)技術(shù)是RPA (Recombinase polymerase amplification，重組酶聚合酶擴(kuò)增)技術(shù)。它由Piepenburg等[6]于2006年開(kāi)發(fā)，雖引入時(shí)間較晚，但其具有的多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)使得檢測(cè)操作可以在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，而不是僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，因而迅速得到大眾的青睞。2014年，由英國(guó)Twist DX公司推出的商業(yè)化RPA試劑盒使檢測(cè)更加方便，同時(shí)結(jié)合多種探針，擴(kuò)大了RPA技術(shù)的應(yīng)用范圍[7]。本文對(duì)RPA技術(shù)的原理、應(yīng)用及其發(fā)展前景等進(jìn)行綜述。

1 RPA技術(shù)介紹

1.1 反應(yīng)原理

該技術(shù)的反應(yīng)原理如圖1所示。RPA反應(yīng)主要依賴來(lái)源于T4噬菌體的重組酶UvsX和重組酶負(fù)載因子UvsY(輔助蛋白)、單鏈結(jié)合蛋白(Single-stranded DNA-binding protein, SSB) Gp32、鏈置換DNA聚合酶Bsu (BacillussubtilisPol)或Sau (StaphylococcusaureusPol)，然后以T4噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制為原理實(shí)現(xiàn)模板的擴(kuò)增。首先，在ATP (Adenosine triphosphate)的參與下引物與重組酶UvsX形成核蛋白絲復(fù)合物，該復(fù)合物在目標(biāo)雙鏈DNA中雙向掃描尋找同源序列，一旦找到同源序列，重組酶會(huì)將此位置的雙鏈DNA解離，并形成D環(huán)結(jié)構(gòu)；此時(shí)的D環(huán)一側(cè)為雙鏈，發(fā)生鏈置換反應(yīng)，而另一側(cè)為單鏈，由SSB蛋白Gp32穩(wěn)定；然后核蛋白絲復(fù)合物主動(dòng)水解ATP使其構(gòu)象發(fā)生變化，重組酶解離后引物3’端暴露，此時(shí)DNA聚合酶Bsu與引物3’ 端結(jié)合，DNA擴(kuò)增反應(yīng)啟動(dòng)形成新的互補(bǔ)鏈。在這個(gè)反應(yīng)中，正向引物和反向引物分別介導(dǎo)的反應(yīng)過(guò)程是同時(shí)進(jìn)行的，新形成的單鏈與原始鏈互補(bǔ)配對(duì)，形成完整的擴(kuò)增子代。擴(kuò)增子代會(huì)不斷重復(fù)此步驟，擴(kuò)增產(chǎn)物成指數(shù)型增長(zhǎng)，整個(gè)過(guò)程一般在20 min內(nèi)即可完成。反應(yīng)中由于SSB蛋白與UvsX之間存在引物結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，而UvsY輔助蛋白能夠侵入SSB蛋白覆蓋的引物，從而阻止SSB蛋白與引物結(jié)合所發(fā)生的重組現(xiàn)象并可促進(jìn)UvsX與引物的結(jié)合[6,8]。

1.2 引物設(shè)計(jì)原則

(1)與普通PCR相比，RPA反應(yīng)所需引物相對(duì)較長(zhǎng)，一般在30～35 bp，過(guò)短會(huì)影響重組酶的生物活性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性；

(2)引物的GC含量在30%～70%，避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)與發(fā)卡結(jié)構(gòu)等；

(3)引物5′ 端的前3～5個(gè)核苷酸避免出現(xiàn)連續(xù)的鳥(niǎo)嘌呤，最好是胞嘧啶，能促進(jìn)重組；

(4)引物3′ 端的后3個(gè)核苷酸最好是胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤，有助于提升聚合酶的穩(wěn)定性；

(5)避免出現(xiàn)回文序列和連續(xù)重復(fù)等特殊序列[9,10]。

2 RPA技術(shù)產(chǎn)物的檢測(cè)方式

2.1 瓊脂糖電泳凝膠檢測(cè)法

最初采用此方法檢測(cè)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。除了需要添加重組酶、單鏈結(jié)合蛋白與DNA聚合酶之外，其余成分與普通PCR相同。通常在37 ℃條件下反應(yīng)20 min即可獲得大量目的片段。由于反應(yīng)液中的酶類、蛋白以及擁擠試劑(crowding agents)會(huì)影響目的片段在瓊脂糖凝膠中的遷移[11]，因此首先需要通過(guò)去污劑或DNA純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化處理后方可進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，最后在凝膠成像儀下對(duì)目的條帶進(jìn)行檢測(cè)。雖然該方法操作難度低，且僅需要一對(duì)引物即可完成，但電泳凝膠檢測(cè)延長(zhǎng)了整個(gè)檢測(cè)時(shí)間。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)法

該方法是目前檢測(cè)RPA產(chǎn)物最常見(jiàn)的方法。相比于基礎(chǔ)的RPA反應(yīng)體系，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)法需在RPA擴(kuò)增體系中加入一個(gè)核酸外切酶Ⅲ (Exonuclease Ⅲ，EXO)和exo探針，繼而可通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)模板擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)。探針長(zhǎng)45～52 bp，兩側(cè)分別攜帶一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，中間為無(wú)堿基位點(diǎn)，可以是四氫呋喃(Tetrahydrofuran, THF)或dSpacer，在探針的3′末端有阻斷劑，防止聚合酶從末端延伸。當(dāng)探針完整時(shí)，熒光微弱；當(dāng)無(wú)堿基位點(diǎn)被核酸外切酶切開(kāi)時(shí)，淬滅基團(tuán)被釋放，熒光基團(tuán)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，此時(shí)模板的實(shí)時(shí)擴(kuò)增即被檢測(cè)到[12,13]。

2.3 側(cè)流層析試紙條檢測(cè)法

與其他檢測(cè)方法相比，側(cè)流層析試紙條檢測(cè)法(Lateral flow dipstick-RPA, LFD-RPA)的檢測(cè)儀器小巧，方便攜帶。該方法將免疫技術(shù)、分子雜交技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)以及側(cè)流層析技術(shù)結(jié)合于一體，利用三明治夾心法進(jìn)行檢測(cè)。相比于基礎(chǔ)的RPA反應(yīng)體系，LFD-RPA擴(kuò)增體系中需要加入一個(gè)核酸外切酶Ⅳ (Endonuclease Ⅳ, NFO)、nfo探針和帶有地高辛或生物素標(biāo)記的反向引物。探針長(zhǎng)46～52 bp，5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3′端磷酸化處理，中間有一個(gè)無(wú)堿基位點(diǎn)。首先擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素標(biāo)記，然后與熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針雜交。核酸外切酶Ⅳ切開(kāi)nfo探針的無(wú)堿基位點(diǎn)，產(chǎn)生自由的羥基端與DNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)延伸，形成帶有探針熒光基團(tuán)與生物素的雙標(biāo)記擴(kuò)增子。然后利用側(cè)流層析試紙條對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[12,13]。

試紙條上有一條含有生物素抗體的檢測(cè)線與一條含有固定抗體的對(duì)照線。當(dāng)擴(kuò)增子的熒光基團(tuán)FAM(6-carboxy-fluorescein)與FAM抗體的金標(biāo)物結(jié)合形成免疫復(fù)合物時(shí)，免疫復(fù)合物由于層析作用會(huì)向下擴(kuò)散，首先流經(jīng)檢測(cè)線，擴(kuò)增目的片段中的生物素標(biāo)記會(huì)與檢測(cè)線中的生物素抗體結(jié)合顯色。之后流經(jīng)對(duì)照線，會(huì)與對(duì)照線上的特殊抗體結(jié)合顯色。此反應(yīng)一般在37～39 ℃條件下進(jìn)行，5～15 min就可以完成檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果肉眼直接可判，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[14]。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)法

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)法利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)，將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，從而進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。通過(guò)探針與標(biāo)記產(chǎn)物的特異性結(jié)合，用比色免疫分析法進(jìn)行分析。該技術(shù)綜合了RPA和ELISA兩種技術(shù)的特點(diǎn)，不僅在特異性、靈敏度方面表現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，還操作簡(jiǎn)單，不需要熱循環(huán)與產(chǎn)物純化等過(guò)程[13]，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，適用于資源匱乏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.5 PCR檢測(cè)法

DNA提取時(shí)間較長(zhǎng)，而且有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增抑制劑影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在RPA-PCR檢測(cè)法中，RPA引物能夠直接從簡(jiǎn)單處理過(guò)的植物中擴(kuò)增靶標(biāo)和一些側(cè)翼區(qū)域，再利用PCR引物直接從RPA反應(yīng)中以指數(shù)形式擴(kuò)增目標(biāo)。該方法可以降低反應(yīng)速率，促進(jìn)靶標(biāo)的擴(kuò)增[15]。

3 RPA技術(shù)的應(yīng)用

隨著RPA技術(shù)的發(fā)展，在食品安全監(jiān)測(cè)、人畜病害防治、植物病害診斷等方面開(kāi)始采用RPA技術(shù)進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，出現(xiàn)了大量的應(yīng)用報(bào)道。

3.1 在食品安全方面的應(yīng)用

Lutz等[16]最早將RPA與離心微流控盒相結(jié)合，用于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)耐藥基因(mecA)的全自動(dòng)分析，引起食品安全研究者的注意。此后該技術(shù)不斷應(yīng)用于食源性病毒、食源性致病菌、轉(zhuǎn)基因植物等方面的檢測(cè)，為食品安全領(lǐng)域的檢測(cè)提供了新的思路。

3.1.1 食源性病毒的檢測(cè) 食源性病毒指的是以食物為載體，導(dǎo)致人類疾病的病毒，包括以糞-口途徑傳播的病毒或者是以畜產(chǎn)品為載體傳播的病毒。只要有微量的食源性病毒即可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。PCR技術(shù)可以檢測(cè)出此類病毒，但由于耗時(shí)較長(zhǎng)、需要特殊的儀器設(shè)備等不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，而RPA技術(shù)的出現(xiàn)則解決了這一難題，使檢測(cè)該類病毒變得更快、更便捷且準(zhǔn)確性高。Liu等[17]將口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的3D基因作為RPA的靶標(biāo)序列，運(yùn)用側(cè)流層析RT-RPA技術(shù)在15 min內(nèi)通過(guò)手心加熱成功檢測(cè)出該病毒，靈敏度與實(shí)時(shí)RT-PCR相同，并且與經(jīng)典豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2和偽狂犬病病毒等無(wú)交叉感染。Gao等[18]以豬肝為研究對(duì)象，建立了用于檢測(cè)基因型4的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Quantitative real-time reverse transcription combining recombinase polymerase amplification assay, qRT-RPA)方法，與qRT-PCR相比，兩者檢測(cè)限相同，然而后者耗時(shí)60 min，前者只需 3 min，且前者回收率比后者高，為室外HEV的檢測(cè)提供了快速方法。在樣品制備和處理步驟中存在或可能引入了許多物質(zhì)(例如抑制劑)，會(huì)干擾核酸擴(kuò)增，當(dāng)RPA反應(yīng)體系中這些物質(zhì)較多時(shí)反應(yīng)會(huì)被強(qiáng)烈抑制。針對(duì)此問(wèn)題，Ahmed等[19]優(yōu)化了反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)，檢測(cè)出H5N1禽流感病毒；Moore等[20]也利用RT-RPA檢測(cè)出諾如病毒Gll.4。

3.1.2 食源性致病菌的檢測(cè) 食源性致病菌是指以食品為傳播媒介，可以引起食物中毒的致病性細(xì)菌，直接或間接污染食品及水源，人經(jīng)口可感染，從而導(dǎo)致食物中毒。食源性致病菌的樣品處理通常需要冗長(zhǎng)的富集步驟，對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的致病菌而言，需要的時(shí)間更長(zhǎng)，而RPA技術(shù)能夠快速檢測(cè)出致病菌，提高了檢測(cè)效率。Hice等[21]使用磁性離子液能夠快速濃縮和提取沙門(mén)氏菌(Salmonella)，為RPA檢測(cè)提供了致病菌的富集方法。Li等[22]基于LFD-RPA，利用沙門(mén)氏菌特有的fimY基因[23]作為靶基因，在短時(shí)間內(nèi)能夠用肉眼直接觀察到檢測(cè)結(jié)果。Wang等[24]通過(guò)改進(jìn)LFD-RPA系統(tǒng)，在基因組上設(shè)計(jì)引物對(duì)，檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，能消除引物二聚體的假陽(yáng)性信號(hào)，為檢測(cè)其他病原體提供了方法。Maestu等[25]首先利用免疫磁分離技術(shù)進(jìn)行樣品的預(yù)處理，然后用qRPA (Real-time recombinase polymerase amplification)來(lái)檢測(cè)李斯特菌，該方法既可以從復(fù)雜的食品基質(zhì)中分離和濃縮出不同的病原體，去除抑制性化合物，也可以降低背景微生物的發(fā)生率。Hu等[26]基于LFD-RPA技術(shù)能夠快速檢測(cè)出生牛乳樣品中的大腸桿菌(Escherichiacoli) O157∶H7，具有很高的靈敏度。除此之外，RPA技術(shù)還可用于副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[27]、金黃色葡萄球菌[28]、克羅諾桿菌(Cronobacter)[29]、布魯氏菌(Brucella)[30]、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)[31]等的檢測(cè)。

3.1.3 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè) 目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)正快速應(yīng)用于作物遺傳育種，導(dǎo)致越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因植物和食品流向市場(chǎng)，快速識(shí)別轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品需要合適的檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)憑借自身優(yōu)勢(shì)被優(yōu)先選用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。Wang等[32]以GTS 40-3-2大豆為研究對(duì)象，開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單可視、基于體熱孵育的RPA檢測(cè)技術(shù)，利用NaOH方法提取大豆DNA后，再用手心溫度進(jìn)行孵育，然后加入熒光染料，最后在紫外線工具照射下即能目測(cè)熒光結(jié)果。Xu等[33]根據(jù)花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶基因(NOS)終止子的調(diào)控序列，設(shè)計(jì)了兩組RPA引物，并建立了用于轉(zhuǎn)基因作物篩選和檢測(cè)的實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)方法。Li等[34]應(yīng)用熒光RPA技術(shù)，研發(fā)出了轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的快速檢測(cè)方法，根據(jù)Bt11外源插入DNA以及插入位點(diǎn)旁側(cè)序列設(shè)計(jì)RPA引物及探針，可以特異性區(qū)分出轉(zhuǎn)基因玉米品系。此外，RPA檢測(cè)方法也用于轉(zhuǎn)基因水稻[35]、大豆[36]、棉花[37]等的檢測(cè)。

3.1.4 其他方面的檢測(cè) 除了上述類型的應(yīng)用之外，其他與食品相關(guān)的檢測(cè)也運(yùn)用了RPA技術(shù)。如：Santiago等[36]還將ELISA技術(shù)與RPA技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用于過(guò)敏源(如榛子、花生、大豆、番茄和玉米)的檢測(cè)。Jauset等[38]以羽扇豆過(guò)敏源β-粘連蛋白為研究對(duì)象，創(chuàng)新建立了適體重組酶聚合酶擴(kuò)增(Aptamer-recombinase polymerase amplification, Apta-RPA)的檢測(cè)方法，使用針對(duì)β-粘連蛋白的第二種適體(β-conglutin binding aptamer II, β-CBAII)，利用適體親和力和特異性，將β-CBAII用于快速檢測(cè)β-粘連蛋白，為檢測(cè)食品中過(guò)敏源提供了新的思路。Cao等[39]使用SYBR Green I熒光染料與RPA技術(shù)，在37 ℃的條件下，可以有效、快速地識(shí)別出摻入羊肉和牛肉的1%豬肉，并且結(jié)果可視化，可用于肉類摻假的檢測(cè)。

3.2 在人畜病害方面的應(yīng)用

自Euler等[40]用RPA檢測(cè)出土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)后，該技術(shù)漸漸廣泛應(yīng)用于導(dǎo)致人畜病害的病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等方面的檢測(cè)，有力地推動(dòng)了人畜病原體的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工作。

3.2.1 病毒的檢測(cè) 病毒病的暴發(fā)會(huì)對(duì)人畜造成巨大的傷害，因此在造成損失前檢測(cè)出這些病毒至關(guān)重要。RPA技術(shù)可用于多種病毒的即時(shí)檢測(cè)且無(wú)交叉感染。Zhang等[41]首次建立了登革熱病毒(Dengue virus, DENV)的RT-LFD-RPA檢測(cè)法，能同時(shí)檢測(cè)4種血清型的登革熱病毒，具有較好的重復(fù)性，檢測(cè)限都低于10拷貝/反應(yīng)。Li等[42]使用引物和exo探針快速實(shí)時(shí)檢測(cè)了反芻獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)，與實(shí)時(shí)RT-PCR的靈敏度相同，與PPR的4個(gè)譜系都沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性較高。Kong等[43]通過(guò)生物傳感器集成的可穿戴微流控設(shè)備，用手腕溫度可進(jìn)行人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)DNA的RPA擴(kuò)增，再借助手機(jī)的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，在24 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，適用于有限環(huán)境資源中的HIV即時(shí)檢測(cè)。Nybond等[44]將等溫?cái)U(kuò)增人腺病毒(Human adeno virus，HADV) DNA與紙基垂直微流控裝置(Paper-based vertical flow microarray，VFM)結(jié)合，能減少分析物在轉(zhuǎn)移過(guò)程中受到的阻礙，接著利用功能化金納米粒子對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行比色檢測(cè)，且該裝置能夠重復(fù)利用，適用于即時(shí)診斷。劉文俊等[45]首次建立了動(dòng)物A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)的LFD-RPA檢測(cè)方法,該方法不依賴任何儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單、快速，可為基層實(shí)驗(yàn)室臨床快速檢測(cè)和流行病學(xué)研究提供幫助。目前RPA技術(shù)還適用于猴痘病毒(Monkeypox virus)[46]、新城疫病毒(Newcastle disease virus)[47]、鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus)[48]、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus)[49]、犬細(xì)小病毒(Canine parvo virus)[50]等的檢測(cè)。

3.2.2 細(xì)菌的檢測(cè) RPA技術(shù)與其他多種方法結(jié)合，可更好地實(shí)現(xiàn)樣品的處理和信號(hào)擴(kuò)增，有效減少實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。Higgins等[51]通過(guò)結(jié)合內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照模板，利用雙重RPA能檢測(cè)出肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)，并成功展示了雙重RPA測(cè)定法的臨床診斷實(shí)用性。Chen等[52]開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)尿液中銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)等的碟式RPA芯片，可同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)樣本，加快了尿路感染病原菌的診斷。由于疊氮溴化丙錠可以穿過(guò)死亡細(xì)菌細(xì)胞膜并在強(qiáng)光下與DNA結(jié)合，Chen等[53]用疊氮溴化丙錠RPA法，消除了從死細(xì)胞中提取的DNA對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，在20 min內(nèi)能夠檢測(cè)到化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)和無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)。Saxena等[54]對(duì)鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiamallei)進(jìn)行了LFD-RPA檢測(cè)，具有較高的靈敏度，對(duì)于早期及時(shí)控制、治療人類和動(dòng)物疾病至關(guān)重要。除此之外，RPA也成功運(yùn)用于鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)[55]、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)[56]、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)[57]、潰瘍分枝桿菌(Mycobacteriumulcerans)[58]、胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis)[59]等的檢測(cè)。

3.2.3 寄生蟲(chóng)的檢測(cè) 由于大多數(shù)寄生蟲(chóng)體積較小，甚至用顯微鏡觀察都不夠清晰，而利用不同的探針、引物設(shè)計(jì)，RPA技術(shù)能準(zhǔn)確檢測(cè)出這些寄生蟲(chóng)。Cui等[60]利用LFD-RPA成功檢測(cè)到犬類血液中的吉氏巴貝斯蟲(chóng)(Babesiagibsoni)，靈敏度是常規(guī)PCR的20倍。Crannell等[61]開(kāi)發(fā)了多重RPA方法，從糞便樣品中提取寄生蟲(chóng)的DNA后，能夠同時(shí)檢測(cè)出賈第鞭毛蟲(chóng)(Giardia)、隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)和阿米巴蟲(chóng)(Entamoeba)，也可以通過(guò)重新設(shè)計(jì)引物和探針序列檢測(cè)出其他多種靶標(biāo)寄生蟲(chóng)。Lalremruata等[62]通過(guò)RT-RPA檢測(cè)到低密度的惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)，與LAMP和普通PCR相比，具有高度準(zhǔn)確性和靈敏度，對(duì)于防止該類疾病的傳播具有重要意義。Gunaratna等[63]在提取杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmaniadonovani) DNA時(shí)加入了磁珠，隨后與RPA檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。RPA不僅能檢測(cè)以上寄生蟲(chóng)，還應(yīng)用于日本血吸蟲(chóng)(Schistosomajaponicum)[64]、弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)[65]、呂氏泰勒蟲(chóng)(Theilerialuwenshuni)[66]、克魯氏錐蟲(chóng)(Trypanosomacruzi)[67]等的檢測(cè)。

此外，RPA技術(shù)還應(yīng)用于立克次體[68]、支原體[69]、癌癥[70]、等位基因[71]等方面疾病的快速檢測(cè)。

3.3 RPA技術(shù)在植物病害診斷方面的應(yīng)用

自Zhang等[72]首次應(yīng)用RPA檢測(cè)李痘病毒(Plum pox virus, PPV)以來(lái)，該技術(shù)獲得了植物病害研究者的關(guān)注，將其用于病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲(chóng)等病原物的檢測(cè)，促進(jìn)了植物病害診斷工作的順利開(kāi)展。

3.3.1 植物病毒的檢測(cè) 常規(guī)的植物病毒病診斷主要依賴病害癥狀的觀察和核酸、血清學(xué)等技術(shù)手段?，F(xiàn)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、PCR等核酸方法可以檢測(cè)植物RNA和DNA病毒，與這些方法相比，RPA檢測(cè)法無(wú)需高溫變性，且僅需兩個(gè)引物即可完成擴(kuò)增，檢測(cè)更方便。Jiao等[73]應(yīng)用RT-RPA技術(shù)快速檢測(cè)出辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)，此方法特異性高，不與馬鈴薯Y病毒、番茄斑點(diǎn)枯萎病毒和煙草脈帶花葉病毒等相關(guān)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，并且其靈敏度比常規(guī)RT-PCR方法高約10倍。Ivanov等[74]通過(guò)調(diào)整底物濃度、組分混合順序和反應(yīng)溫度等，成功檢測(cè)出馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX)，且靈敏度是傳統(tǒng)側(cè)流層析技術(shù)的260倍，也適用于多種RNA病毒的檢測(cè)。Kumar等[75]從粗提取液中有效檢測(cè)出柑橘黃化花葉病毒(Citrus yellow mosaic virus, CYMV)，建立了檢測(cè)該病毒的免疫捕獲RPA方法，該方法可作為檢疫和芽接過(guò)程中的有效病毒檢測(cè)技術(shù)。Wang等[76]通過(guò)RPA和金納米粒子(AuNP)探針相結(jié)合的可視化DNA診斷方法，在20 min內(nèi)能夠檢測(cè)到番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)，提供了高度敏感和穩(wěn)定的DNA診斷技術(shù)。此外，RPA技術(shù)還用于檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus)[77]、菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus)[78]、櫻桃病毒(Cherry virus A)[79]、香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus)[80]、蘋(píng)果莖溝病毒(Apple stem pitting virus)[81]等。

3.3.2 植物病原細(xì)菌的檢測(cè) 經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員能夠通過(guò)觀察植物細(xì)菌病害的典型癥狀來(lái)診斷植物病害，并通過(guò)在專門(mén)的培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)來(lái)鑒定病原物，該方法大多數(shù)時(shí)候是準(zhǔn)確的，但是耗時(shí)較長(zhǎng)。與之相比，RPA技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出病原物，并且整體檢測(cè)成本較低。Scherer等[82]利用RPA技術(shù)檢測(cè)出導(dǎo)致番茄細(xì)菌斑點(diǎn)病的多種病原菌(Xanthomonasgardneri,X.euvesicatoria,X.perforans和X.vesicatoria)。基于柑橘黃龍病菌(Candidatusliberibacterasiaticus,CaLas)的16S rRNA基因，Ghosh等[83]優(yōu)化了反應(yīng)溫度和時(shí)間，建立了一種靈敏可靠的黃龍病LFD-RPA技術(shù)。Lau等[84]以丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)感染的植物樣品為研究對(duì)象，基于固相載體可逆化固定法，從植物樣品中提取總基因組DNA，通過(guò)RPA快速等溫?cái)U(kuò)增靶病原體DNA序列，隨后與金納米顆粒DNA標(biāo)簽雜交，再使用鏈霉親和素包被的磁珠富集產(chǎn)物，最后用差分脈沖伏安法進(jìn)行基于金納米顆粒的電化學(xué)評(píng)估，能夠靈敏地檢測(cè)到植物病原菌DNA，比傳統(tǒng)的PCR、電泳凝膠檢測(cè)法靈敏10000倍。Ahmed等[85]直接利用被感染的植物材料，而無(wú)需進(jìn)行DNA的分離，通過(guò)LFD-RPA技術(shù)檢測(cè)出26種果膠桿菌(Pectobacteriumspecies)和12種非果膠桿菌，未出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，表現(xiàn)出較高的特異性。

3.3.3 植物病原真菌的檢測(cè) RPA技術(shù)具有高度特異性，可以克服植物病原真菌檢測(cè)中樣品交叉污染造成的影響。Lau等[86]以被感染的番茄和擬南芥為研究對(duì)象，通過(guò)在納米金顆粒表面涂覆拉曼報(bào)告子和DNA探針，制備了表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-enhanced raman scattering, SERS)納米粒子，隨后與RPA技術(shù)結(jié)合，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)且靈敏度高的即時(shí)單管RPA/SERS測(cè)定法，用于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等真菌的多重檢測(cè)。Burkhardt等[87]應(yīng)用RPA技術(shù)檢測(cè)出菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)，在200多種染病草莓上進(jìn)行了驗(yàn)證，為草莓和土壤中的菜豆殼球孢檢測(cè)提供了新的方法。Austin等利用凍干試劑檢測(cè)了橡樹(shù)疫霉(Phytophthoraramorum)。Yu等[88]利用LFD-RPA技術(shù)快速檢測(cè)辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)，可以在5 min內(nèi)獲得可擴(kuò)增的DNA，該測(cè)定法有望作為診斷試劑盒得到進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，用于現(xiàn)場(chǎng)或資源有限的實(shí)驗(yàn)室的病樣檢測(cè)。Dai等[89]使用一對(duì)引物PSYPT-F和PSYPT-R擴(kuò)增大豆疫霉(Phytophthorasojae)Yptl基因的特定片段，通過(guò)對(duì)多種卵菌和真菌的測(cè)試，驗(yàn)證了該方法具有較高的特異性。Mustafa等[15]將RPA與PCR技術(shù)藕聯(lián)，通過(guò)放大疫霉屬中高度保守的atp9～nad9序列間的間隔子，成功檢測(cè)出草莓疫霉(Phytophthorafragariae)。RPA技術(shù)不僅能夠檢測(cè)以上病菌，還能檢測(cè)出油菜莖基潰瘍菌(Leptosphaeriamaculans)[91]、草坪草根部感染的真菌(例如Gaeumannomycesavenae,Magnaporthiopsispoae和Ophiosphaerellakorrae)[92]、冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)[93]、致病疫霉(Phytophthorainfestans)[94]等。

3.3.4 植物線蟲(chóng)的檢測(cè) 利用經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲(chóng)的種類對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平要求較高，而同工酶表型分析和常規(guī)分子鑒定通常需要使用先進(jìn)的儀器和軟件，因而使得線蟲(chóng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)具有一定難度。目前RPA技術(shù)逐漸用于檢測(cè)線蟲(chóng)，但相關(guān)報(bào)道較少。Chi等[95]通過(guò)LFD-RPA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynejavanica)的純化基因組DNA的檢測(cè)限為1 pg，其靈敏度約是常規(guī)PCR檢測(cè)的10倍。Cha等[96]從松木中快速提取出松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)基因組DNA，然后利用帶有光學(xué)傳感器的電池固定式恒溫裝置，獲取來(lái)自RPA反應(yīng)的熒光吸收，在25 min內(nèi)可完成檢測(cè)。RPA技術(shù)有望為線蟲(chóng)提供一種高效快捷的檢測(cè)方法。

4 RPA的技術(shù)特點(diǎn)

與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，作為一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，RPA具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)反應(yīng)可以在恒溫條件下進(jìn)行。與普通PCR不同，RPA技術(shù)利用了生物酶的活性，不需要經(jīng)過(guò)一系列的高溫變化過(guò)程，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程可以在37～42 ℃的恒溫條件下進(jìn)行。

(2)耗時(shí)短。與其他多種擴(kuò)增技術(shù)相比，RPA的顯著特點(diǎn)就是可以在5～20 min內(nèi)完成檢測(cè)。

(3)操作簡(jiǎn)單。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的各類RPA試劑盒便于操作。例如，RPA TwistAmp?Basic 試劑盒的基礎(chǔ)反應(yīng)體系含有DNA擴(kuò)增所需的各類試劑，只需要加入引物與模板即可進(jìn)行檢測(cè)[97]。RPA技術(shù)有多種檢測(cè)方式，如在上述體系中加入探針就可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量RPA，在RPA TwistAmp?Basic RT中添加逆轉(zhuǎn)錄酶，也可以對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。

(4)靈敏度高。在不需純化和富集樣品的條件下，RPA可以檢測(cè)低至幾個(gè)拷貝的核酸模板。

除了以上幾種優(yōu)點(diǎn)外，RPA技術(shù)也具有以下幾種缺點(diǎn)：

(1)RPA產(chǎn)物在使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)時(shí)首先需要純化，否則易造成拖帶。

(2)RPA產(chǎn)物在使用側(cè)流試紙條進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需先將產(chǎn)物稀釋從而使層析效果更佳，也能避免非特異帶影響。

(3)目前沒(méi)有專門(mén)設(shè)計(jì)RPA引物和探針的軟件。

(4)由于RPA反應(yīng)的最適溫度在37～42 ℃，若是同時(shí)進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)，沒(méi)有辦法準(zhǔn)確控制每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的起點(diǎn)[98]。

5 展望

RPA技術(shù)作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)，在公共衛(wèi)生的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、植物病害診斷等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。所有的等溫?cái)U(kuò)增方法都存在著3個(gè)重要的步驟，即樣品制備、擴(kuò)增和檢測(cè)，當(dāng)然RPA技術(shù)也不例外。由于該技術(shù)問(wèn)世才10多年，體系尚不夠成熟，在上述3個(gè)環(huán)節(jié)中都存在諸多不足，有待進(jìn)一步改進(jìn)。首先，在樣品制備方面可以關(guān)注在樣品制備中能否做到濃縮以及進(jìn)一步的樣品純化，使得實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化、結(jié)果準(zhǔn)確。其次，RPA技術(shù)的一個(gè)大難題就是引物的設(shè)計(jì)，目前沒(méi)有專門(mén)的引物設(shè)計(jì)軟件，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中用到的引物可能還是傳統(tǒng)PCR中所使用的，可能會(huì)帶來(lái)實(shí)驗(yàn)的誤差[99]。最后，在RPA的檢測(cè)技術(shù)方面，目前已經(jīng)有傳統(tǒng)的電泳凝膠法、實(shí)時(shí)熒光定量、側(cè)流層析等多種方法可以使用，在未來(lái)是否可以將RPA技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合用于檢測(cè)，或是開(kāi)發(fā)其他材料使檢測(cè)成本更低，這也有待進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。相信隨著對(duì)RPA技術(shù)的深入研究，日趨成熟的RPA技術(shù)未來(lái)一定能夠更好地發(fā)揮它的作用。