基于高通量測(cè)序的坡豪湖濕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

羅奉奉，付 躍，李雪鳳，劉鑫泰，高麗霞，覃勇榮,3*

(1.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 河池 546300;2.微生物及植物資源開(kāi)發(fā)利用廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 河池 546300;3.桂西北經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究中心,廣西 河池 546300;4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510000)

濕地是介于陸地生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)之間的過(guò)渡生態(tài)系統(tǒng),兼具陸地和水體的生態(tài)特性,其生物多樣性非常豐富;土壤微生物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要生命體,對(duì)濕地物質(zhì)循環(huán)、水土保持、生物多樣性保護(hù)、生態(tài)凈化等[1-4]起非常重要的作用;濕地的環(huán)境條件變化也會(huì)引起微生物群落多樣性和生態(tài)功能的改變[5-7],因此,土壤微生物作為濕地土壤亞系統(tǒng)變化的預(yù)警和敏感指標(biāo)[8],對(duì)評(píng)估濕地生態(tài)系統(tǒng)資源和功能具有重要意義。

近年來(lái)隨著人為活動(dòng)和環(huán)境變化的影響,眾多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注濕地生態(tài)系統(tǒng)的研究,主要從水文、土壤、氣候、污染物、植被等方面分析與微生物的相互關(guān)系,探索導(dǎo)致濕地生態(tài)穩(wěn)定性變化的主要因素,這些研究認(rèn)為在季節(jié)變化[9]、含水量[10,11]、土壤元素循環(huán)[12,13]、植被演替[14]、耕作方式[15,16]、重金屬污染[17]等因素的影響下,濕地土壤微生物群落多樣性呈現(xiàn)一定的特征性變化。

廣西東蘭坡豪湖國(guó)家濕地公園處在桂西北喀斯特石山地區(qū)的河池市東蘭縣境內(nèi),1992年在紅水河中游的巖灘水電站蓄水封閘后,在東蘭縣長(zhǎng)樂(lè)鎮(zhèn)坡豪境內(nèi)自然形成了湖泊濕地[18]。與其他濕地不同的是,坡豪湖濕地每年受巖灘水電站蓄放水的影響,湖泊周邊土壤常處于不同程度的湖水浸潤(rùn)狀態(tài)。在2014年12月,國(guó)家林業(yè)局正式批準(zhǔn)廣西東蘭坡豪湖國(guó)家濕地公園開(kāi)展試點(diǎn)建設(shè)[19],旨在更好地保護(hù)坡豪湖濕地的生物多樣性。本研究根據(jù)喀斯特石山與紅水河接壤形成的坡豪湖濕地的生境特點(diǎn),結(jié)合Illumina高通量測(cè)序技術(shù)從微生物生態(tài)學(xué)角度探索了坡豪湖濕地土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)變化及其與土壤環(huán)境因子、下游水庫(kù)蓄放水的關(guān)系,分析了細(xì)菌菌群在該濕地生態(tài)系統(tǒng)中的變化特征,旨在為坡豪湖濕地生態(tài)系統(tǒng)資源的保護(hù)管理和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域?yàn)閺V西河池市東蘭坡豪湖國(guó)家濕地公園(24°25′02″～24°27′14″N,107°23′53″～107°32′40″E),屬亞熱帶季風(fēng)氣候,夏長(zhǎng)冬短,雨熱同季,氣候溫和,光照充足,海拔217 m,年平均氣溫為19～21 ℃,年平均降雨量1563 mm；該公園處桂黔滇喀斯特石漠化防治生態(tài)功能區(qū)。

1.2 樣品采集

巖灘水電站蓄放水情況:每年3～9月為放水期,9月～次年3月為蓄水期。選取坡豪湖水陸交替帶(從最高水位向湖中靠近2 m位置)為試驗(yàn)地,在坡豪湖周邊土壤區(qū)域按距離2～3 km選取樣地,共選8個(gè)采樣區(qū),每個(gè)樣地設(shè)置3個(gè)樣方做平行,樣方間隔20 m,樣方大小50 cm×50 cm,按五點(diǎn)取樣法隨機(jī)取樣，混合為1個(gè)土樣,去除土壤中的動(dòng)植物殘?bào)w和碎石等雜物,用直徑5 cm的土鉆采集距土壤表層5～20 cm的土壤,每個(gè)樣地土壤用無(wú)菌自封袋分裝成兩份,置于冰盒當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。一份置于-80 ℃保存,用于土壤細(xì)菌群落分析;另一份自然風(fēng)干,過(guò)100目篩,用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。根據(jù)廣西的氣候特征,于2017年4月開(kāi)始采集土壤樣品,為春季樣；隨后在7月、10月、次年1月分別采集夏、秋、冬季土壤樣品。

1.3 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤含水量(SWC)的測(cè)定采用105 ℃烘干恒重法(HJ 613─2011)；土壤pH值的測(cè)定采用電位法(HJ 962─2018)；土壤有機(jī)質(zhì)含量(SOC)的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法(HJ 615─2011)；土壤全磷(TP)含量的測(cè)定采用堿熔-鉬銻抗分光光度法(HJ 632─2011)；土壤全氮(TN)含量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法(HJ 717─2014)；土壤速效磷(AP)含量的測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法(HJ 704─2014)；土壤速效氮(AN)含量的測(cè)定采用納氏比色分光光度法[20]。

1.4 土壤細(xì)菌16S rDNA的測(cè)序

采集土壤的總DNA用試劑盒(Power SoilTM DNA Isolation Kit, MOBIO, USA)提取，采用細(xì)菌通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對(duì)16S rDNA的V3～V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq高通量測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理,顯著水平確定為P<0.05。將有效序列相似性≥97%的序列劃為同一分類操作單元(OTU)；細(xì)菌的Alpha多樣性分析采用Shannon 指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)、 Chao1指數(shù),覆蓋度(Coverage)則進(jìn)行測(cè)序深度分析;對(duì)于Beta多樣性分析,利用OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,采用Anosim相似性分析探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性;采用RDP Classifier進(jìn)行分類水平統(tǒng)計(jì),用相關(guān)性熱圖進(jìn)行理化指標(biāo)和細(xì)菌群落關(guān)系的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落多樣性分析

2.1.1 序列統(tǒng)計(jì)和細(xì)菌Alpha多樣性分析 經(jīng)高通量測(cè)序，從坡豪湖濕地土壤8個(gè)樣地共獲得基因序列1200836條,平均長(zhǎng)度為439.19 bp。表1顯示了8個(gè)樣地(YD1～YD8)的土壤細(xì)菌在不同季節(jié)的多樣性指數(shù)(Shannon)和豐富度指數(shù)(Chao),由表1可知：土壤細(xì)菌群落多樣性在大部分樣地中以春季最為豐富；而樣地YD1的土壤細(xì)菌多樣性以冬季最豐富,該樣地處于水陸交替帶,鴨跖草、蓮子草密度大,在冬季蓄水期該樣地不會(huì)被淹沒(méi),因此植物生長(zhǎng)旺盛，土壤有機(jī)質(zhì)含量增加,有助于土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖；樣地YD4和YD5的土壤細(xì)菌群落多樣性以夏季最豐富,這2個(gè)樣地均處于農(nóng)田旁,夏季處于放水期但雨水充沛,作物根系分泌旺盛,有機(jī)質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)容易被土壤微生物利用,因此土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐度增加；此外，樣品文庫(kù)的覆蓋率(Coverage)范圍為95.4%～97.2%,能夠反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的真實(shí)情況。

表1 坡豪湖濕地土壤細(xì)菌群落的豐度和多樣性

2.1.2 Beta多樣性分析 為了分析8種不同生境下的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異,在OTU水平上進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖1所示,YD1在四季中(CYD1、XYD1、QYD1、DYD1)距離相近,說(shuō)明土壤OTU組成差異不大,但區(qū)別于其他樣地;夏季的YD2、YD7土壤OTU組成明顯區(qū)別于其他樣本;YD4在冬季的OTU組成區(qū)別于其在另外3個(gè)季節(jié)的;YD5在秋、冬季的土壤OTU組成明顯不同于春、夏季,但QYD5與YD6在秋、冬季的土壤OTU組成相近,DYD5與DYD8的土壤OTU組成也相近。由此說(shuō)明,土壤樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在季節(jié)性差異,且在不同區(qū)域的樣本間也有一定的差異性。

圖中樣地名稱的首字母C、X、Q、D分別表示春季、夏季、秋季、冬季，下同。

2.2 細(xì)菌群落的物種組成分析

坡豪湖濕地土壤樣品的4105個(gè)OTUs分屬于38個(gè)門、92個(gè)綱、198個(gè)目、367個(gè)科、625個(gè)屬。由圖2可以看出，在門分類水平上,4個(gè)季節(jié)的土壤細(xì)菌群落組成有一定的相似性,但細(xì)菌類別占比有所差異,其中,變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)具有較高的占比,分別占26.83%～28.72%、15.85%～23.85%、13.80%～18.20%和13.31%～17.68%；而硝化螺菌門(Nitrospirae)和厚壁菌門(Firmicutes)所占比例分別只有5.28%～6.69%和3.02%～5.26%。變形菌門是坡豪湖濕地土壤的優(yōu)勢(shì)類群,在四季占比變化不大；綠彎菌門在春、夏季的占比(22.95%～23.84%)高于秋、冬季(15.86%～17.99%)；厚壁菌門在秋、冬季的占比(4.54%～5.26%)高于春、夏季(3.01%～3.12%)，說(shuō)明季節(jié)變化對(duì)這兩個(gè)細(xì)菌門的影響較大。

圖2 坡豪湖濕地土壤細(xì)菌在門水平上的分類

為了進(jìn)一步分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在四季中的變化差異,在屬分類學(xué)水平上進(jìn)行分析,除平均豐度低于1%的部分合并為others外,共檢測(cè)出29個(gè)屬,如圖3所示。酸桿菌門下的1個(gè)綱(norank c_Acidobacteria)的相對(duì)豐度最高,占比在冬季最大(12.64%);綠彎菌門的1個(gè)厭氧繩菌科(norank f_Anaerolineaceae)和玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)在春、夏季的占比大于秋、冬季;厚壁菌門下的芽孢桿菌屬(Bacillus)在秋、冬季的占比(3.34%～2.92%)大于春、夏季(1.50%～1.60%);變形菌門下α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的黃色桿菌科(norank f_Xanthobacteraceae)在冬季的占比明顯增大。

圖3 坡豪湖濕地土壤細(xì)菌在屬水平上的分類

對(duì)豐富度較高的6個(gè)細(xì)菌門類群進(jìn)行季節(jié)性變化的比較分析,結(jié)果如圖4所示。在春季,綠彎菌門(Chloroflexi)在YD5為優(yōu)勢(shì)菌群,相對(duì)豐度為31.22%,也高于其在其他季節(jié)中的相對(duì)豐度；該樣地處于農(nóng)莊附近,地勢(shì)較高,受水庫(kù)蓄放水的影響較小,主要受季節(jié)性水位變化的影響,春季雨水頻繁,形成潮間帶區(qū),加之人為活動(dòng)，影響了土壤的有機(jī)質(zhì)含量,使得綠彎菌門的相對(duì)豐度較高。在夏季,變形菌門(Proteobacteria)在YD4、YD8為優(yōu)勢(shì)菌群,相對(duì)豐度分別為35.12%、39.06%;綠彎菌門在YD2、YD6為優(yōu)勢(shì)菌群,在夏季的相對(duì)豐度最大,分別為30.11%、28.52%。在秋季,酸桿菌門(Acidobacteria)在YD4、YD5的相對(duì)豐度最大,分別達(dá)20.65%、19.14%;厚壁菌門(Firmicutes)在YD2、YD8的相對(duì)豐度變化至最大,在YD2中從春季的1.45%升高到秋季的6.82%,在YD8中從夏季的2.34%升高到秋季的9.11%。在冬季,酸桿菌門在YD2、YD3的相對(duì)豐度最大,分別為23.48%和23.09%,為這兩個(gè)樣地的主要優(yōu)勢(shì)菌群;放線菌門(Actinobacteria)在YD5的相對(duì)豐度隨季節(jié)變化而增大,在冬季最大,為23.29%；厚壁菌門在YD6的相對(duì)豐度以夏季最低,為0.96%,到冬季升至8.26%。

圖4 坡豪湖濕地土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在四季的變化比較

2.3 細(xì)菌群落與土壤因子的相關(guān)性分析

由表2可知,坡豪湖濕地土壤呈弱堿性,季節(jié)性差別較大,在YD1、YD3、YD8中變化顯著(P<0.05)。SPSS 26.0 ANOVA分析表明,土壤理化指標(biāo)對(duì)不同季節(jié)和不同地勢(shì)區(qū)域的樣地有明顯響應(yīng)。從季節(jié)性層面看,SWC在秋、冬季顯著大于春、夏季(P<0.05),因?yàn)榍锒臼窍掠嗡畮?kù)蓄水期,大部分樣地水位提升;TP含量在YD4內(nèi)部季節(jié)波動(dòng)性較大,可能與其處于農(nóng)田附近,受人為因素干擾有關(guān)；大部分樣地的TP含量在夏季低,因?yàn)橄募緸榉潘?加上降雨量增加，導(dǎo)致磷素流失;TN含量在冬季最高,且顯著高于夏季的(P<0.05);多數(shù)樣地的AP含量在秋季高,但YD4的AP含量在春季顯著高于其他季節(jié)的(P<0.05),YD8的AP含量在冬季顯著高于其他季節(jié)的(P<0.05);夏季在YD2中的AN含量遠(yuǎn)超其他樣地的(P<0.05),達(dá)34.43 mg/kg;多數(shù)樣地的SOM含量在冬季高,在夏季低,因?yàn)樾钏谑褂袡C(jī)質(zhì)積累[21],但在YD6中的SOM含量在春夏季較高。

表2 坡豪湖濕地土壤理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果(表3、圖5、圖6)顯示：SMC為主要影響因子,與多種細(xì)菌顯著相關(guān),其中與放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)均呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，其中SMC與放線菌門呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.605，與綠彎菌門呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.695;pH、TN、SOM、AP也與一些細(xì)菌群落呈顯著相關(guān),其中pH與硝化刺菌門(Nitrospinae)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與厚壁菌門(Firmicutes)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);TN與擬桿菌門(Bacteroidetes)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與綠彎菌門呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);SOM與螺旋體菌門(Saccharibacteria)呈顯著負(fù)相關(guān);AP與放線菌門呈顯著正相關(guān);TP、AN與細(xì)菌群落無(wú)顯著相關(guān)性。

圖5 坡豪湖濕地土壤細(xì)菌門分類群落與土壤化學(xué)指標(biāo)的冗余分析結(jié)果

“*”表示0.01

3 討論與結(jié)論

在濕地生態(tài)系統(tǒng)中,微生物群落的多樣性和相對(duì)豐度受溫度、時(shí)間、空間和理化因子的多重影響。在分析微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子間的相關(guān)性時(shí),很難將某個(gè)環(huán)境因子獨(dú)立分開(kāi),因?yàn)槲⑸锶郝涞淖兓c多種因子耦合作用相關(guān)[22]。坡豪湖常年受下游電站蓄放水的影響,季節(jié)性蓄放水形成水分的反復(fù)遷移影響了濕地土壤的理化環(huán)境,繼而對(duì)細(xì)菌群落的組成造成一定的影響。從細(xì)菌的多樣性和豐富度結(jié)果看,本研究區(qū)的8個(gè)樣地中土壤樣本,春夏季為水庫(kù)放水期,部分湖邊土壤水位下降,但也有些區(qū)域地勢(shì)低洼,加上春季雨水密集,形成長(zhǎng)時(shí)間季節(jié)性淹水,如YD6在春季有機(jī)質(zhì)含量最高,這與土壤的通透性較差、有機(jī)質(zhì)積累有關(guān),導(dǎo)致細(xì)菌多樣性和豐富度較大。本研究發(fā)現(xiàn),秋冬季的SOM含量較春夏季高,可能由秋冬季受蓄水期的影響所致。水分是影響土壤性質(zhì)的最主要因子[10,23-24],樣地水位高程不同導(dǎo)致土壤含水量、pH值、有機(jī)質(zhì)含量等有明顯的差異。細(xì)菌群落變化在水位影響較明顯的樣地中呈現(xiàn)差別,主要集中在靠近農(nóng)田區(qū)域的YD4、YD5樣地,雖然其部分區(qū)域地勢(shì)較高,受蓄放水的影響較小,但也受人類活動(dòng)的干擾,因此其土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度在夏季和秋季較大;YD2、YD8為桑樹(shù)種植區(qū)域,受蓄放水和耕作的影響,其土壤細(xì)菌群落的多樣性在春季最大;YD3為湖中島,蓄放水使小島邊際的水位常處于動(dòng)態(tài)變化,導(dǎo)致春夏季的土壤細(xì)菌多樣性大于秋冬季,這與LIGI等[25]、XU等[26]、AMAUD等[27]的研究結(jié)果“在濕地生態(tài)系統(tǒng)中，處于不同水文條件下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在著顯著差異”一致。

在本研究的樣地中,土壤主要的細(xì)菌群落有變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、酸桿菌門、硝化螺菌門和厚壁菌門。其中變形菌門為相對(duì)豐度最高的類群,這與很多濕地土壤細(xì)菌群落研究[28-30]的結(jié)果一致,其中YD4和YD8在夏季變形菌門的相對(duì)豐度最大,這可能因?yàn)樽冃尉T與碳利用呈正相關(guān)[31],這兩個(gè)區(qū)域?yàn)榉N植區(qū),根系利用有機(jī)質(zhì)活躍,加上耕作機(jī)械擾動(dòng)促進(jìn)變形菌門的碳礦化速率增大,促進(jìn)了作物的生長(zhǎng)。在屬水平的物種組成中,綠彎菌門部分屬的相對(duì)豐度在春夏季增大,究其原因，雖然春夏季為放水期,但春夏季雨水頻繁,使部分地勢(shì)處于水陸交替帶,而光合自養(yǎng)微生物綠彎菌門常處于泥灘帶,能提供大量的生產(chǎn)力[32],這也間接說(shuō)明水分在樣地中對(duì)綠彎菌門菌群的影響較大；厚壁菌門的芽孢桿菌屬在秋冬季的相對(duì)豐度大于春夏季,其中在YD2、YD6、YD8中從春季到冬季豐度呈明顯的增大趨勢(shì),可能與其形成可逆性強(qiáng)的芽孢有關(guān),WANG等[32]在對(duì)海洋沉積物、淡水和潮間帶沉積物微生物群落的研究中發(fā)現(xiàn)厚壁菌門的芽孢桿菌綱豐度較高,其產(chǎn)芽孢具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),土壤水分對(duì)綠彎菌門和放線菌門具有極顯著的影響,綠彎菌門的相對(duì)豐度在YD5中春季最高,在YD2和YD6中夏季較高,因?yàn)檫@3類樣地受季節(jié)性蓄放水的影響較大,這與物種組成的研究結(jié)果一致,再次證明綠彎菌門的相對(duì)豐度與土壤的水分含量相關(guān)。放線菌門的相對(duì)豐度在YD5中冬季增大,而該樣地在冬季的土壤含水量較高，這與放線菌適于在干燥、高溫環(huán)境下生長(zhǎng)[33]相悖,因此其豐度增大可能還與該區(qū)域的人為因素影響有關(guān),生活污水及垃圾的排放和堆積致使放線菌門菌群數(shù)量增加,有研究發(fā)現(xiàn)在污染石油、多環(huán)芳烴(PAHs)及有機(jī)物等環(huán)境中放線菌門的相對(duì)豐度增加[34-36],與其降解污染物的能力相關(guān)[37,38]。酸桿菌門的相對(duì)豐度在YD2、YD3中冬季升至最大,因?yàn)檫@2個(gè)樣地受人為耕作和牲畜因素的干擾,土壤有機(jī)質(zhì)容易被分解,這與相關(guān)研究[39-41]的結(jié)果“酸桿菌門喜歡低營(yíng)養(yǎng)組環(huán)境”一致。有研究認(rèn)為土壤酸桿菌門的豐度與pH值成反比[31]；但Zhang等[44]認(rèn)為大多數(shù)細(xì)菌門的相對(duì)豐度在近中性土壤中高于在酸性或堿性土壤中,其中酸桿菌門也屬優(yōu)勢(shì)菌門,本研究結(jié)果則與其一致。由此看出,環(huán)境因素對(duì)濕地土壤微生物分布的影響很大,因坡豪湖濕地受水庫(kù)的影響,其土壤細(xì)菌多樣性呈季節(jié)性變化，維系物質(zhì)循環(huán),但同時(shí)湖邊部分區(qū)域受耕作或污染因素的干擾,使得一些菌群的組成變化與人類活動(dòng)因素相關(guān)。因此從保護(hù)濕地的生態(tài)功能考慮,應(yīng)盡量控制和減少人為不利干擾的影響,以改善土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和土壤結(jié)構(gòu)。