外源ABA對非生物脅迫下黃芩抗逆性的影響研究

華智銳，李小玲

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

植物在其生長發(fā)育過程中常遭受各種不良環(huán)境的侵襲，其中干旱、高溫、低溫等逆境是造成植物減產(chǎn)的主要環(huán)境因子，嚴(yán)重影響了植物的產(chǎn)量和品質(zhì)。如何使植物產(chǎn)生抗逆性并獲得一定的產(chǎn)量，是科研工作者亟需解決的關(guān)鍵問題。近年來的研究表明，逆境嚴(yán)重影響了植物的光合作用，減少了有機(jī)物的積累，降低了植物的抗逆性，限制了植物生產(chǎn)力的提高[1]。細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞，膜脂過氧化增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加、離子平衡失調(diào)、代謝紊亂，植物體內(nèi)過氧離子等自由基引發(fā)一系列的傷害。

脫落酸(ABA)是廣泛分布于高等植物中的五大激素之一，參與了植物許多生長發(fā)育過程，特別在逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用，ABA可顯著降低高溫對葉綠體超微結(jié)構(gòu)的破壞，提高葉綠體的熱穩(wěn)定性；ABA可以誘導(dǎo)某些酶的重新合成，從而增加植物的抗冷性、耐澇性和耐鹽性等。因此，ABA被稱為應(yīng)激激素或脅迫激素(Stress hormone)[2]。

黃芩(SctellariabaicalensisGeorigi)別名土金茶根、山茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，黃芩根入藥，性寒、味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、養(yǎng)胎等功效，它是我國常用中藥材之一[3]。近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的不斷發(fā)展，全球范圍內(nèi)對于黃芩這種中藥材的需求量日益增加，野生黃芩資源急劇減少，已經(jīng)不能滿足市場對該藥材的需求。因此，黃芩的人工栽培成為了國內(nèi)對黃芩藥材需求的重要來源，然而黃芩生產(chǎn)中常受到各種非生物因子的脅迫，這給黃芩產(chǎn)量和品質(zhì)造成不同程度的影響。近年來的研究表明，通過外施植物激素ABA可以改善植物的生長特性，進(jìn)而提高植物的抗逆性。目前，有關(guān)外源ABA對非生物脅迫下植物生理特性的影響研究也有不少報(bào)道[4-7]，但主要集中在對單個(gè)逆境的影響方面，而對非生物因子的綜合影響報(bào)道較少。

因此，本研究以商洛道地藥材黃芩為試材，研究外源ABA對非生物脅迫(干旱、高溫、低溫)下黃芩抗逆性的影響，旨在尋找一種簡單、易行的解決黃芩抗逆境的生產(chǎn)方法，對于擴(kuò)大人工黃芩的栽培規(guī)模具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用黃芩幼苗于2018年4月初購自洛南藥材種植基地；ABA和PEG購自西安晶博有限公司，含量≥99.5%，分析純試劑AR級。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)培養(yǎng) 將黃芩幼苗移栽至塑料花盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每盆9株。戶外溫度下培養(yǎng)1個(gè)月左右，期間定時(shí)澆水和松土以保持土壤濕潤。1月后選取生長一致(高度一致)的幼苗用于試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)對照和15個(gè)處理，共同對照：CK1(蒸餾水、常溫對照)，脅迫對照分別為CK2(20%PEG-6000對照)、CK3(4 ℃低溫對照)、CK4(40 ℃高溫對照)。

15個(gè)處理分別為T1:10 μmol/L ABA+20%PEG-6000；T2:25 μmol/L ABA+20%PEG-6000；T3:50 μmol/L ABA+20%PEG-6000；T4:100 μmol/L ABA+20%PEG-6000；T5:150 μmol/L ABA+20%PEG-6000；T6:10 μmol/L ABA+4 ℃低溫；T7:25 μmol/L ABA+4 ℃低溫；T8:50 μmol/L ABA+4 ℃低溫；T9:100 μmol/L ABA+4 ℃低溫；T10:150 μmol/L ABA+4 ℃低溫；T11:10 μmol/L ABA+40 ℃高溫；T12:25 μmol/L ABA+40 ℃高溫；T13:50 μmol/L ABA+40 ℃高溫；T14:100 μmol/L ABA+40 ℃高溫；T15:150 μmol/L ABA+40 ℃高溫。

按照上述4個(gè)對照和15個(gè)處理，用面噴施的方式噴施不同濃度的ABA處理1周后，分別剪取每株黃芩相同部位的成熟葉片。剪下適量的葉片，用自來水洗凈，然后用蒸餾水沖洗，將主要葉脈除去，剪碎葉片，用于測定保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性、葉綠素含量、丙二醛(MDA)含量和相對電導(dǎo)率。

1.2.3 生理指標(biāo)的測定 葉綠素含量的測定參照張志良等[8]的分光光度法；MDA含量的測定參照張志良等[8]的硫代巴比妥酸法；SOD活性測定參照李合生[9]的氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法；POD活性測定參照李合生[9]的愈創(chuàng)木酚法；CAT活性測定參照李合生[9]的紫外吸收法；質(zhì)膜透性的測定參照高俊風(fēng)[10]的相對電導(dǎo)率法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理每次測定重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為3次測定值的平均值。采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片葉綠素含量的影響

由圖1可知，逆境處理對照中黃芩幼苗葉片葉綠素含量與CK1(蒸餾水、常溫對照)葉綠素含量相比，均存在顯著性差異(P<0.05)，分別比CK1降低了0.11、1.35和0.20 mg/g，說明干旱、低溫和高溫脅迫均降低了黃芩幼苗葉片中葉綠素的含量。當(dāng)噴施外源物質(zhì)ABA后，與3種脅迫的對照組相比，黃芩幼苗葉片中葉綠素含量均有所提升，且以25 μmol/L ABA處理的黃芩幼苗葉片中葉綠素含量提升幅度最大，其葉綠素含量分別為CK2、CK3和CK4的1.33、6.45和1.40倍，說明適宜濃度的ABA能明顯緩解干旱、低溫和高溫對黃芩的傷害。

2.2 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片MDA含量的影響

由圖2可知，逆境處理對照中黃芩葉片的MDA含量與CK1(蒸餾水、常溫對照)相比，均存在顯著性差異(P<0.05)，分別比CK1增加了2.36、3.91、3.06 nmol/g。說明干旱、低溫和高溫脅迫引起了膜脂過氧化作用，促進(jìn)了MDA的積累。葉面噴施不同濃度的外源物質(zhì)ABA后，不同脅迫處理下MDA含量均呈現(xiàn)出先降后升的趨勢，但總體低于脅迫對照，說明外源物質(zhì)ABA能顯著抑制MDA的生成，且以25 μmol/L ABA處理的黃芩幼苗葉片中MDA含量下降幅度最大，分別比干旱、低溫和高溫脅迫對照下降了9.29、11.99和10.06 nmol/g，表明在干旱、低溫和高溫脅迫下，噴施不同濃度的ABA能有效地緩解黃芩幼苗MDA的積累。

圖2 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片MDA含量的影響

2.3 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片3種保護(hù)酶活性的影響

由圖3、圖4和圖5可知，干旱與高溫脅迫對照中黃芩幼苗葉片中SOD、POD、和CAT活性，與CK1(蒸餾水、常溫對照)相比，均存在顯著性差異(P<0.05)，SOD活性分別比CK1提高了18.40和23.73 U/g；POD活性分別比CK1提高了2.70和4.26 U/(g·min)；CAT活性分別比CK1提高了0.80和0.94 U/(g·min),低溫脅迫處理的對照中黃芩幼苗葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性在低溫脅迫后明顯降低，與CK1(蒸餾水對照)相比存在顯著性差異(P<0.05)，分別比CK1下降了18.06 U/g、6.94 U/(g·min)和2.29 U/(g·min)，可能是低溫導(dǎo)致酶活性降低的緣故。當(dāng)噴施外源物質(zhì)ABA后，黃芩幼苗葉片中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均高于3種脅迫處理的對照，其中以25 μmol/L ABA處理的黃芩幼苗葉片中保護(hù)酶的活性最高，SOD活性分別是CK2、CK3和CK4的1.13倍、1.16倍和1.09倍；POD活性分別是CK2、CK3和CK4的1.69倍、2.00倍和1.44倍；CAT活性分別是CK2、CK3和CK4的1.40倍、2.79倍和1.46倍。說明逆境條件下噴施外源物質(zhì)ABA后能顯著提高黃芩幼苗葉片中的保護(hù)酶活性，降低干旱、低溫和高溫脅迫對黃芩的傷害。

圖3 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片SOD活性的影響

圖4 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片POD活性的影響

圖5 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片CAT活性的影響

2.4 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片相對電導(dǎo)率的影響

由圖6可知，逆境對照中的黃芩幼苗葉片中電導(dǎo)率比CK1(蒸餾水對照)顯著增加，均存在顯著性差異(P<0.05)，說明干旱、低溫和高溫脅迫破壞了膜結(jié)構(gòu)及其功能，增大了質(zhì)膜的透性。當(dāng)噴施外源物質(zhì)ABA后，與3種脅迫對照相比，相對電導(dǎo)率均有所下降，且在25 μmol/L時(shí)達(dá)到最小，分別比干旱對照、低溫對照和高溫對照下降了3.62、4.00和3.10個(gè)百分點(diǎn)。這說明外源物質(zhì)ABA能顯著降低膜脂過氧化作用，減少細(xì)胞內(nèi)容物的外滲，緩解逆境對植物的傷害。

圖6 ABA對非生物脅迫下黃芩葉片相對電導(dǎo)率的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

ABA作為信號分子參與植物體內(nèi)中鈣離子和氫離子等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對植物適應(yīng)干旱、低溫、高溫等逆境發(fā)揮著重要作用。ABA可以提高植物的抗逆性[11]，減輕植物受逆境的迫害。本試驗(yàn)主要通過噴施不同濃度的ABA作用在黃芩幼苗，表現(xiàn)出了明顯的逆境緩解效應(yīng)。

葉綠素是一類與光合作用相關(guān)的色素，葉綠素含量的下降是引起光合速率下降的主要原因[12]。干旱、低溫和高溫脅迫后，葉綠素的含量均低于蒸餾水對照(CK1),說明干旱、低溫、高溫逆境降低了黃芩的光合速率。經(jīng)過不同濃度的ABA噴施之后，葉綠素的含量均有所提升，噴施25 μmol/L ABA效果最佳，可以顯著提高黃芩幼苗的葉綠素含量，提高黃芩的光合速率。

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一[13]，通過測定MDA的含量可以了解膜脂過氧化的程度，從而間接測定膜系統(tǒng)損傷程度和植物的抗逆性,所以黃芩葉片在干旱脅迫、低溫脅迫和高溫脅迫下的MDA含量高低可以反映黃芩幼苗生物膜的損傷程度。在3種逆境脅迫后，MDA的含量均高于蒸餾水、常溫對照(CK1)，但經(jīng)過噴施ABA后，MDA的含量均有所降低，表明ABA能緩解膜脂過氧化的過程，降低丙二醛的含量。其中,噴施25 μmol/L ABA效果最佳，能緩解干旱、低溫、高溫脅迫所造成的迫害。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體中，它與植物的衰老和抗逆性密切相關(guān)[14-15]。SOD作為機(jī)體內(nèi)一種天然存在的超氧自由基清除因子，它可以與超氧物陰離子自由基(·O2-)發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，通過氧化氫酶(CAT)將產(chǎn)生的H2O2分解為O2和H2O，以避免H2O2積累對細(xì)胞的氧化破壞作用。過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用和生長素的氧化等都密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)清除H2O2的CAT、POD和清除·O2-的SOD的協(xié)同作用，共同防御活性氧或其他過氧化自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，保證細(xì)胞的正常機(jī)能。Wang等[16]研究表明，干旱脅迫下獼猴桃葉面噴施外源ABA，其CTA和POD活性分別上升了27.24%和26.51%。本試驗(yàn)在干旱、低溫、高溫脅迫下，噴施ABA能明顯提高黃芩幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性，且均高于各自的脅迫對照組。其中噴施25 μmol/L ABA效果最佳。

相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)[17]。逆境脅迫環(huán)境下，植物的膜脂結(jié)構(gòu)會(huì)破壞，使膜脂通透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水溶性物質(zhì)外滲而使電導(dǎo)率增大[18-22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在干旱脅迫、低溫脅迫和高溫脅迫下，經(jīng)噴施不同濃度ABA處理后，均可顯著降低黃芩幼苗的相對電導(dǎo)率。這可能是由于ABA可以穩(wěn)定細(xì)胞膜上的大分子的結(jié)構(gòu)，保持了酶活性，從而穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)。

3.2 結(jié)論

ABA作為一種“脅迫激素”在感受脅迫信號時(shí)，能提高作物的抗逆性并起到重要作用。本試驗(yàn)通過研究外施ABA對干旱、低溫、高溫脅迫下黃芩的抗逆性的影響，其結(jié)果表明，噴施ABA 25 μmol/L ABA可抑制MDA含量和膜透性的增加，提高植物細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性和葉綠素的含量，增強(qiáng)植物抗逆性。

本試驗(yàn)結(jié)果為黃芩的耐旱、低溫、高溫性研究提供了參考，為利用ABA作為化控措施以緩解黃芩逆境脅迫提供理論依據(jù)。盡管本研究開展了不同濃度ABA對黃芩幼苗在干旱、低溫、高溫逆境中生理生化指標(biāo)的影響，但本試驗(yàn)僅對黃芩盆栽苗的抗逆性開展了相關(guān)的研究，而對于大田栽培中黃芩苗的抗逆性還有待進(jìn)一步研究。