懸浮法及酶消化法分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞

趙雅麗，李瑞方，熊麗嬌，曾治平

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科；3.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心贛南分中心，江西 贛州 341000）

脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，AD- SCs）是從脂肪組織中分離得到的一種具有異質(zhì)性的間充質(zhì)干細(xì)胞，它具有多種屬性標(biāo)記，可分化為多種類型的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、軟骨和骨細(xì)胞等［1-2］。ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）相比，更容易獲得，并且在采集時具有相對較低的供區(qū)發(fā)病率。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表明ADSCs對比BMSCs來說是一種更可控的干細(xì)胞來源，在調(diào)節(jié)炎癥方面更具優(yōu)勢［3］，且在促進體內(nèi)外造血方面ADSCs也明顯優(yōu)于BMSCs［4］，ADSCs方便分離的特性和強大的體外增殖能力，也使得ADSCs在再生醫(yī)療領(lǐng)域中非常受歡迎［5-6］。本文就ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定進行研究。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 6周齡的雄性大鼠（由贛南醫(yī)學(xué)院科研動物中心提供），操作前后符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》［7］標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)質(zhì)胎牛血清（四季青無噬菌體內(nèi)毒素），DMEM低糖培養(yǎng)基（Gibco），Trypsin-EDTA（0.25%phenol red），0.2%Ⅰ型膠原酶（Collagenase），磷酸鹽緩沖液（PBS，自配），青霉素?鏈霉素（索萊寶），完全培養(yǎng)基（DMEM低糖完全培養(yǎng)基?初級）、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、茜素紅、油紅O等。BBS-SDC醫(yī)用潔凈工作臺、Thermo CO2培養(yǎng)箱、DK-8D型電熱恒溫水箱、TDZ5-WS臺式低速離心機、BCD-601WDPR低溫冰箱、流式細(xì)胞儀、倒置顯微鏡等（由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研中心提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADSCs提取

1.2.1.1 膠原酶消化提取法 （1）取6周齡雄性大鼠，將大鼠脫頸處死，在無菌條件下取大鼠腹股溝處脂肪組織，用加入雙抗的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）充分漂洗3～4遍，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中，剔除肉眼可見的血管及筋膜組織。（2）將其剪碎，大小最好約1 mm3左右，再用無菌的PBS反復(fù)沖洗，盡可能除去紅細(xì)胞。（3）將其裝入50 mL的試劑瓶中，并加入等量的0.2%Ⅰ型膠原酶，于37℃的恒溫水浴箱中消化50 min，期間間斷搖晃試劑瓶使其消化均勻。（4）加入兩倍體積含有PBS的低糖DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打離散細(xì)胞團，將形成的單細(xì)胞懸液裝入15 mL離心管中1690 r·min-1，離心10 min。（5）除去上層的脂肪和上清液，收集所得到的細(xì)胞沉淀物，加入DMEM培養(yǎng)液吹打細(xì)胞沉淀，并將吹打后的混懸液置入37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.2 懸浮組織塊提取法 （1）第一步同上述膠原酶提取法。（2）將脂肪組織剪成約綠豆大小，用PBS沖洗2～3遍。（3）接種到6 cm的平皿中，每皿放置6～8塊已剪好的脂肪組織，加入6～8 mL的DMEM培養(yǎng)液使組織塊懸浮。（4）輕輕晃勻后置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（5）5～6 d后首次換液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時用胰酶進行1∶3傳代，記為原代P1。

1.2.2 ADSCs傳代 兩種方法傳代方法一致，將提取到的原代ADSCs培養(yǎng)24 h后首次換液，去掉殘存的細(xì)胞碎片及紅細(xì)胞，48 h后再次換液，之后每48～72 h換液1次，獲得純化的ADSCs，總計培養(yǎng)8～10 d后。觀察原代ADSCs密度，一般融合生長達(dá)到90%左右，可進行傳代，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后，進行傳代培養(yǎng)。一般傳代3代進行細(xì)胞鑒定，至5～6代之后可將細(xì)胞進行提取，置入液氮冷凍箱中保存。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 膠原酶消化法培養(yǎng)原代ADSCs 24 h后就有少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭形、三角形或多邊形，多為單細(xì)胞核，首次換液后細(xì)胞生長迅速。7 d后可見細(xì)胞逐漸變圓，三角形逐漸消失，細(xì)胞大多成長梭形。懸浮法48 h后，可見少量形態(tài)以長梭形、圓形為主的細(xì)胞。7 d后可見大量長梭形細(xì)胞。12 d時，細(xì)胞融合達(dá)90%，可見大量類成纖維樣細(xì)胞呈漩渦狀生長，初步判斷所獲得的細(xì)胞為ADSCs（圖1、圖2、圖3、圖4）。

圖1 膠原酶法培養(yǎng)第3天的ADSCs（400×）

圖2 懸浮法傳代培養(yǎng)第3天的ADSCs（400×）

圖3 膠原酶消化法培養(yǎng)第7天的ADSCs（400×）

圖4 懸浮法傳代培養(yǎng)第7天的ADSCs（400×）

2.2 細(xì)胞生長曲線 膠原酶法獲得的細(xì)胞在接種的1～3 d緩慢增長，4～7 d進入快速增長期，之后細(xì)胞增長進入平臺期，整體生長曲線成“S”形。懸浮法所得細(xì)胞在第3 d進入生長暴增期，第7 d進入生長平臺期，生長曲線也大體呈“S”形（圖5）。

圖5 酶消化法與懸浮法的ADSCs生長曲線圖

2.3 干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力

2.3.1 干細(xì)胞成骨分化能力 分別取酶消化法及懸浮法培養(yǎng)的第3代ADSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（完全培養(yǎng)基＋50μg·mL-1L-抗壞血酸＋10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉＋0.1μmol·L-1地塞米松）培養(yǎng)，每2 d換液1次。ADSCs成骨誘導(dǎo)7 d左右，懸浮法及酶消化法均可見細(xì)胞體積逐漸增大，呈重疊生長，且形態(tài)慢慢變?yōu)槎噙呅?。誘導(dǎo)3周左右，吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，4℃下用70%乙醇固定1 h，室溫下用2%的茜素紅染色10 min，倒置顯微鏡下觀察，兩種方法所誘導(dǎo)的茜素紅染色無明顯差異（圖6）。

圖6 兩種培養(yǎng)法SDSCs成骨分化誘導(dǎo)能力（茜素紅染色，400×）

2.3.2 干細(xì)胞成脂分化能力 取酶消化法及懸浮法培養(yǎng)的第3代ADSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液（完全培養(yǎng)基＋200μmol·L-1吲哚美辛＋0.5 mmol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤＋1μmol·L-1地塞米松＋10μg·mL-1胰島素）培養(yǎng)，每2 d換液1次。成脂誘導(dǎo)7 d左右，細(xì)胞體積增大，逐漸變圓，細(xì)胞核周圍可見少量小脂滴，并隨著時間的推移不斷融合。培養(yǎng)3周后，吸出培養(yǎng)基，用PBS液沖洗3次，室溫下加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，再用PBS沖洗3次，加入油紅O染液，室溫避光染色30 min，PBS沖洗3次，倒置顯微鏡下觀察。懸浮法及酶消化法的油紅O染色無明顯差異（圖7）。

圖7 兩種培養(yǎng)法SDSCs成脂分化誘導(dǎo)能力（油紅O染色，400×）

3 討論

ADSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的一個亞群，可以比較便利的從脂肪組織中獲取，并具有許多與MSCs相同的特性及功能。ADSCs能在體外擴增，并快速繁殖，具有向多種細(xì)胞系分化的能力，例如分化為脂肪、骨、軟骨和肌源性等細(xì)胞。此外，ADSCs還可分化為心肌、平滑肌、內(nèi)皮、上皮、肝和神經(jīng)源性等細(xì)胞［8-9］。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞治療的興起，ADSCs將在美容、康復(fù)等領(lǐng)域擁有巨大的潛能。ADSCs有很多提取方法，劉琴等［10］對其分離提取方法進行總結(jié)，主要有酶消化法、組織塊貼壁法、酶消化法結(jié)合組織塊貼壁法、懸浮培養(yǎng)法及機械分離方法（渦旋離心法、吸附柱法、超聲處理法）等。本文使用了酶消化法及懸浮組織塊培養(yǎng)法作對比，比較了兩種方法的優(yōu)缺勢，得出結(jié)論：兩種方法均成功獲取大鼠的ADSCs。但與酶消化法相比，懸浮組織塊法具有一定的優(yōu)勢：①操作更為簡單，酶消化法需要更為精細(xì)處理所分離的脂肪組織，而懸浮組織塊法只需將其處理成綠豆大小即可。②價格較為低廉，懸浮法無需膠原蛋白酶進一步處理，而改用胰蛋白酶，此舉大大降低了實驗成本。③此法可克服膠原酶消化法過度消化的問題。④此法可提升脂肪組織利用率。⑤懸浮組織塊法接種簡單，只需輕輕晃動培養(yǎng)皿即可成功接種。但是在采用懸浮組織塊法分離培離ADSCs時有兩點注意的事項：①一個約6 cm的培養(yǎng)皿需要加入5～6 mL的培養(yǎng)液讓脂肪組織塊充分懸浮起來。②成功培養(yǎng)出ADSCs的關(guān)鍵是每皿中放適量的脂肪組織塊，如一個6 cm培養(yǎng)皿接種6～8塊4～5 mm3大小的組織塊即可，接種過多或過少實驗均不易成功?？偟膩碚f懸浮組織塊法對比酶消化法操作更簡便，價格更低廉，更具有可行性，但懸浮組織塊法更易遭受污染，需較嚴(yán)格把控組織塊接種量、培養(yǎng)液的使用及更換。本次實驗對比了酶消化法及懸浮組織塊法的優(yōu)缺勢，得出結(jié)論：對于獲取大鼠的ADSCs來說，我們可優(yōu)先考慮懸浮組織塊培養(yǎng)法。