宮頸脫落細胞蠟塊在宮頸病變初篩中的作用

朱 勇， 高 浩， 賀其志， 美麗古麗·莫合買提， 王 凱， 郭曉青

(1. 石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832003； 2. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院婦科，上海 200092；3. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院病理科，上海 200092； 4. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院轉化醫(yī)學中心，上海 200092)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌。據(jù)統(tǒng)計，2013年全球新發(fā)宮頸癌病例約52.8萬，發(fā)展中國家約占其中的70%，每年大約27.5萬名婦女死于宮頸癌。宮頸癌有較長的癌前病變期，因此初篩在早期診斷和治療宮頸癌前病變、改善宮頸癌預后方面具有極其重要的臨床價值。宮頸癌的篩查方法歷經(jīng)變革，目前HR-HPV(high risk human papilloma virus, HR-HPV)聯(lián)合宮頸脫落細胞學檢測(thinprep cytology test, TCT)是較為公認的初篩方式[3-4]。

TCT技術是應用于婦女宮頸癌篩查的一項先進技術，然而，TCT也存在一些弊端，諸如價格較貴、保存期短(只有21d)、檢測多個指標需要重復制片等。細胞蠟塊具有價格低廉、操作簡便、可長期保存、制片便捷等優(yōu)勢，研究認為細胞蠟塊是行之有效的篩查、診斷手段，尤其應用于胸腹水的病理學診斷。國外研究發(fā)現(xiàn)，同時檢測宮頸脫落細胞中Ki-67和P16INK4的表達，對CIN2/3的敏感性和特異性分別為91.9%和82.1%，對CIN3及以上病變的敏感性和特異性分別為96.4%和76.9%，該方法能夠提高宮頸癌前病變的檢出率并縮短人員培訓周期，適宜用于宮頸癌的大人群初篩[7-8]。

本課題擬首先探索將細胞蠟塊制片技術應用于宮頸脫落細胞的臨床可行性、摸索其相關實驗條件；其次，探索細胞蠟塊制片對比現(xiàn)行TCT制片病理診斷的可行性；最后，對比細胞蠟塊制片與TCT制片IHC檢測Ki-67、P16INK4的差異，綜合評估宮頸脫落細胞蠟塊制片用于宮頸病變初篩的臨床可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月—2017年11月在同濟大學附屬第一婦嬰保健院進行宮頸TCT檢查，并有宮頸活組織病理診斷的宮頸TCT樣本共120例，分別為未見上皮內病變或惡性細胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)、低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)、高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)及鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of cervix， SCC)組，每組各30例，TCT與宮頸活組織樣本均由2名高年資病理醫(yī)師確診?；颊吣挲g24～67歲，平均(40.55±0.93)歲，排除其他惡性腫瘤疾病史，臨床及病理資料完整。

1.2 主要材料及試劑

蘇木精及伊紅(H-E)染料購自上海威奧生物科技有限公司，兔單克隆抗體Ki-67購自美國Abcam公司，兔單克隆抗體P16INK4購自美國Proteintech公司，抗體稀釋液及聚合HRP標記抗兔IgG購自上海威奧生物科技有限公司，DAB顯色劑購自美國Cell Signaling公司。

1.3 方法

1.3.1 宮頸脫落細胞的收集 窺器暴露宮頸外口，使用TCT宮頸刷外緣抵住宮頸口，順時針旋轉5～7周，采集宮頸移行帶脫落細胞，保存液瓶身標注患者姓名、樣本采集日期。

1.3.2 TCT制片及巴氏染色 使用ThinPrep2000全自動細胞檢測儀(美國)制作白片，制片后剩余TCT樣本常溫保存，于1周內進行細胞蠟塊的制作。白片使用蘇木精染色20min，自來水沖洗至水色變清(約10s)，1%鹽酸乙醇分化2s，70%、80%、95%乙醇逐級脫水各1min，橙黃G6浸3min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各1min；EA50液浸5min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各1min；無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各1min，即刻中性樹脂封片。

1.3.3 細胞蠟塊制作 收集TCT保存液剩余標本約10mL于50mL離心管中，離心半徑10cm，3000r/min，離心15min；小心棄上清液，加入10%中性緩沖福爾馬林固定液10倍于沉淀物的量，用吸管輕輕吹打，靜置、固定12h。再次3000r/min離心15min，棄上清液，刮匙將沉淀刮至擦鏡紙上，取另一張擦鏡紙小心吸除多余液體后，將沉淀物集中于擦鏡紙中，折疊包裹放入包埋盒中；脫水(方案1： 分別置于50%、60%、70%、80%、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ各20min、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各10min；方案2： 分別置于50%、60%、70%、80%、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各30min)；吸水紙吸干乙醇后置于50℃二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5min，浸臘Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1h，常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。

1.3.4 細胞蠟塊切片及H-E染色 將細胞蠟塊均行常規(guī)3μm組織切片并H-E染色。常規(guī)脫蠟、水化，蘇木精染色10min，自來水沖洗3遍、流水沖洗5min，3%酸乙醇浸洗分化3s，流水洗15min，單蒸水浸2min，70%、80%、90%乙醇各脫水2min，伊紅(醇溶性)浸3s，95%乙醇Ⅲ、95%乙醇Ⅳ脫水各5min、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各脫水5min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明5min，即刻中性樹脂封片。

1.3.5 IHC檢測細胞蠟塊制片和TCT制片中Ki-67及P16INK4的表達 采用EnVision二步法檢測。常規(guī)脫蠟，放入pH值為6.0的改進型檸檬酸鈉抗原修復液，盒裝水浴鍋中加熱18min抗原修復(TCT制片不需要以上步驟，直接入95%乙醇固定5min后自來水沖洗3min)。3%H2O2避光滅活10min，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5min；分別滴加相應抗體，4℃孵育過夜。PBS漂洗3次，每次5min，聚合HRP標記抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水，透明、封片。

1.4 結果判讀

1.4.1 H-E部分 組織學診斷參考WHO(2014)女性生殖器官腫瘤分類標準。

1.4.2 IHC部分 Ki-67、P16INK4表達情況采用半定量法判定。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野，觀察染色陽性細胞比例。以胞質中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。Ki-67、P16INK4免疫組化結果判讀： 計數(shù)5個高倍視野或500個細胞。根據(jù)陽性范圍占整個切片的百分比判讀染色結果。將染色范圍分為0%(陰性-)，1%～25%(弱陽性+)，26%～50%(中度陽性++)，>50%(強陽性+++)。已知小腸組織、宮頸癌石蠟切片分別作為Ki-67、P16INK4的陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。由兩位病理專家雙盲閱片并評分，兩位專家意見不一致時請第三位病理專家閱片，最終判定免疫組化結果。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包分析。對Ki-67、P16INK4蛋白表達采用陽性率(%)進行描述，組間Ki-67和P16INK4表達陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，采用兩相關樣本率的χ2檢驗比較兩種檢測方法的陽性率是否不同。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸脫落細胞蠟塊制作流程的優(yōu)化方案

將收集的120例TCT保存液標本(此為經(jīng)由臨床常規(guī)TCT制片診斷后剩余液基保存液再次制片)依次進行TCT、細胞蠟塊制片，結果有111例完成滿意的TCT制片，制片成功率約為92.5%(111/120)；109例成功完成細胞蠟塊制片，制片成功率約為90.8%(109/120)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.218，P>0.05)。在細胞蠟塊制片中，本研究發(fā)現(xiàn)將離心后的細胞沉淀物在10%中性緩沖甲醛固定液中固定12h更易于組織回收、石蠟包埋；細胞脫水時間控制在50%、60%、70%、80%、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ各20min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各10min，可保持正常細胞形態(tài)及結構，避免胞質的萎縮(圖1A)；用90%乙醇可滿意去除含血宮頸細胞沉淀物中的紅細胞，減少鏡下觀察的混雜因素(圖1B)。

圖1 宮頸脫落細胞蠟塊制片在不同條件下H-E染色Fig.1 Representative diagrams of H-E staining in cervical exfoliated cell wax block under different conditionsA: 含血較少；B： 含血較多(標尺： 25μm)

2.2 TCT制片及宮頸脫落細胞蠟塊制片H-E染色的鏡下特點比較

TCT制片具有細胞片背景干凈，細胞平鋪，細胞結構清晰等特點；宮頸脫落細胞蠟塊制片，細胞相對豐富、分布均勻，細胞結構清晰，核質分明，顏色鮮艷，保持了宮頸脫落細胞的病理學特征，見圖2。

圖2 宮頸脫落細胞蠟塊制片對比TCT制片H-E染色不同級別宮頸病變(標尺： 25μm)Fig.2 Representative diagrams of H-E staining in different levels of cervical lesions observed by cervical exfoliated cell wax block in comparison with TCT

2.3 TCT制片和宮頸脫落細胞蠟塊制片滿意度及診斷符合率

成功制備成宮頸脫落細胞蠟塊的109例標本中，2名病理科醫(yī)師閱片判斷制片的滿意度，不同宮頸病變組別中使用不同制片方式的閱片滿意度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同宮頸病變組別中使用不同制片方式的病理診斷符合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4 TCT制片及宮頸脫落細胞蠟塊制片中Ki-67、P16INK4表達

TCT制片中，Ki-67在NILM、LSIL、HSIL、SCC中的陽性表達率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ki-67陽性表達率在NILM、LSIL、HSIL、SCC之間存在差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表1 109例宮頸脫落細胞蠟塊制片對比TCT制片滿意度及病理診斷符合率

宮頸脫落細胞蠟塊制片中，Ki-67在NILM、LSIL、HSIL、SCC中的陽性表達率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，Ki-67陽性表達率在NILM、LSIL、HSIL、SCC之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 宮頸脫落細胞蠟塊制片組與TCT制片組Ki-67表達情況

對比TCT和宮頸脫落細胞蠟塊制片方式，IHC檢測Ki-67的表達陽性率，采用四格表資料的Fisher精確概率法，差異無統(tǒng)計學意義。因此，Ki-67在TCT組和宮頸脫落細胞蠟塊組中表達對宮頸病變的檢出率差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

圖3 宮頸脫落細胞蠟塊制片對比TCT制片IHC檢測不同級別宮頸病變Ki-67及P16INK4(標尺： 25μm)Fig.3 Representative diagram of IHC for Ki-67and P16INK4 in different levels of cervical lesions detected by cervical exfoliated cell wax block in comparison with TCT

通過免疫組化EnVision兩步法分別檢測TCT制片及宮頸脫落細胞蠟塊制片中P16INK4的表達情況。P16INK4陽性表達定位于胞質/核中，陽性表達呈淺棕、深棕色。

TCT制片中，P16INK4在NILM、LSIL、HSIL、SCC中的陽性表達率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；P16INK4陽性表達率在NILM、LSIL、HSIL、SCC之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3、圖3。

宮頸脫落細胞蠟塊制片中，P16INK4在NILM、LSIL、HSIL、SCC中的陽性表達率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；P16INK4陽性表達率在NILM、LSIL、HSIL、SCC之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3、圖3。

對比TCT和宮頸脫落細胞蠟塊制片方式，IHC檢測P16INK4的表達陽性率，采用四格表資料的Fisher精確概率法，結果P16INK4在TCT組和宮頸脫落細胞蠟塊組中表達對宮頸病變的檢出率差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 宮頸脫落細胞蠟塊制片組與TCT制片組P16INK4表達情況

3 討 論

HR-HPV持續(xù)感染是目前較為公認的宮頸癌病因，由此開發(fā)的HR-HPV疫苗作為宮頸癌的一級預防已在全球多個國家和地區(qū)應用[10]。然而HR-HPV疫苗存在價格昂貴、接種人群有限、不能涵蓋所有HR-HPV且遠期臨床效果不確定等局限[11]。鑒于宮頸癌的發(fā)生會經(jīng)歷較長的癌前病變階段，目前宮頸癌的預防仍以早期診斷和治療宮頸癌前病變的二級預防為主要手段。

宮頸脫落細胞學病檢作為宮頸癌“三階梯”篩查中的第一階段，是臨床最常用的宮頸癌初篩方法。本研究在探索宮頸脫落細胞蠟塊制作方法的過程中發(fā)現(xiàn)，石蠟與細胞塊較易分離，導致切片時細胞塊破裂，這將影響制片和閱片效果。本研究反復摸索實驗條件，發(fā)現(xiàn)用10%中性緩沖福爾馬林將細胞沉淀固定的方法，可以避免細胞塊松散，極大的提高了石蠟包埋及切片制作的成功率。再者，本研究起初將宮頸組織的脫水條件應用于宮頸脫落細胞蠟塊，發(fā)現(xiàn)細胞蠟塊的細胞漿萎縮過度，細胞變形明顯，極大的影響了病理診斷。本研究嘗試摸索針對細胞蠟塊不同的脫水條件，發(fā)現(xiàn)脫水方案1可以更好地保持宮頸脫落細胞的形態(tài)，更易于鏡下觀察細胞結構，從而提高病理醫(yī)師閱片滿意度。第三，宮頸病變尤其是高級別宮頸病變和宮頸癌極易接觸性出血，本研究發(fā)現(xiàn)含血的宮頸脫落細胞在制作細胞蠟塊時存在細胞不易成團、蠟塊制作困難、切片后觀察細胞分散、背景渾濁等弊端。本研究利用高濃度的乙醇溶液可破壞紅細胞的原理[12]，使用90%乙醇溶液處理含血較多的宮頸脫落細胞，處理后細胞蠟塊制作成功率提高、鏡下觀察細胞背景清晰、病理閱片滿意度顯著提高。

20世紀90年代問世的TCT，是宮頸脫落細胞學檢查的新技術，自1998年起，美國食品藥物管理局FDA批準將TCT用于年齡在25歲以上婦女的宮頸癌初篩。廣泛應用的TCT克服了既往巴氏涂片的缺點，單層細胞平鋪，細胞結構清晰，背景干凈，使宮頸病變的檢出率進一步提高。但與此同時，TCT制作過程中材料成本較高，在推廣中帶來了一定的不利因素；再者，宮頸脫落細胞在TCT液基保存液中保存天數(shù)較短僅約21d，也是其應用的限制因素。國外有相關報道，細胞蠟塊技術可以提高細胞病理學診斷的敏感性和特異性[13]。將TCT剩余標本制成細胞蠟塊，便可以避免不能長期保存的不利因素，同時能觀察到更多刷取的脫落細胞，即使較少量的脫落細胞亦可離心出較多量的沉淀物，實現(xiàn)組織學的重構，可實現(xiàn)反復、連續(xù)切片，便于行特殊染色及基因檢測，為細胞學診斷提供更多的診斷依據(jù)。本實驗中，宮頸脫落細胞蠟塊制片較TCT制片在病理科醫(yī)師閱片滿意度中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在診斷符合率中亦差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

然而，TCT診斷基于宮頸脫落細胞的形態(tài)學特征，并未從更微觀的分子水平評估、鑒別不同級別的宮頸病變，并且在診斷過程中由于容易受到病理科醫(yī)師主觀影響而產(chǎn)生偏倚。有學者認為，Ki-67和P16INK4陽性率的升高與宮頸病變嚴重程度相關性顯著，通過IHC雙染有助于提高細胞學診斷的敏感度[14]，更有益于科學實施婦女宮頸病變的臨床管理。本實驗中發(fā)現(xiàn)Ki-67及P16INK4在NILM、LSIL、HSIL、SCC中的陽性表達率呈遞增趨勢，在各組中的表達具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)，與既往研究結果一致。對比宮頸脫落細胞蠟塊制片與TCT制片，IHC檢測不同級別宮頸病變Ki-67及P16INK4表達均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

綜上所述，首先本實驗探索出了一套宮頸脫落細胞蠟塊的制作方法及條件： 使用10%中性緩沖福爾馬林固定細胞塊；嚴格控制細胞脫水時間；使用90%乙醇去除宮頸脫落細胞中的紅細胞。其次，采用上述細胞蠟塊制片方法在病理醫(yī)師閱片滿意度及診斷符合率上均不差于TCT制片。最后，宮頸脫落細胞蠟塊制片對比TCT制片IHC檢測Ki-67及P16INK4表達陽性率在不同級別宮頸病變中無統(tǒng)計學差異?；谏鲜鲅芯拷Y果，本研究認為宮頸脫落細胞蠟塊制片用于宮頸病變初篩的技術方法具有臨床可行性，結合其優(yōu)勢可考慮替代TCT制片在臨床推廣。