核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥小體與阿爾茨海默病

馮蕓穎，陳 慧

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院，北京100730

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)系，北京 100005

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，據(jù)估計(jì)，2019年全球患有癡呆癥的總?cè)藬?shù)超過5000萬[1]，其中很大一部分是AD患者，AD已為社會(huì)和家庭帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，對(duì)全球衛(wèi)生保健體系提出嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，亟需有效的預(yù)防及治療措施[2]。AD的主要病理表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能減退，出現(xiàn)癡呆和認(rèn)知、執(zhí)行能力減弱等癥狀。在神經(jīng)病理學(xué)方面，AD的一般特征為大腦皮層和海馬處細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(amyloid β protein，Aβ)的沉積、細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的tau蛋白(一種微管相關(guān)蛋白)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及膽堿能神經(jīng)傳遞缺陷[3]。僅極少數(shù)AD患者(<5%)被確診為遺傳因素致病，而絕大部分偶發(fā)型AD的病因未明，也因此尚無有效的治療方法。目前已研發(fā)出多種治療AD的藥物，其中不乏以Aβ為靶標(biāo)的制劑，但其有效性均不明確，還需要進(jìn)一步的臨床證據(jù)。

越來越多的研究證實(shí)，神經(jīng)炎癥與AD病程發(fā)展有關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)的免疫細(xì)胞主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[4]，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放信號(hào)使周圍其他細(xì)胞被不斷激活，并被募集到蛋白斑塊沉積處，吞噬沉積物并分泌促炎細(xì)胞因子。而在AD的炎癥與組織損傷相關(guān)的細(xì)胞因子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體是關(guān)鍵一環(huán)[5]。NLRP3炎癥小體作為固有免疫應(yīng)答中激活白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β、18的介質(zhì)，在沉積物引起的小膠質(zhì)細(xì)胞增生及蛋白聚集的病理學(xué)方面發(fā)揮重要作用。

NLRP3炎癥小體

炎癥小體是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的免疫信號(hào)蛋白復(fù)合物[6]，一般由模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸蛋白酶caspase- 1組成?；罨难装Y小體水解IL- 1β前體及IL- 18前體，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，參與全身和局部感染、損傷與免疫反應(yīng)[7]。根據(jù)受體蛋白的不同可將炎癥小體進(jìn)行分類。其中，NLRP3受體蛋白的N端為熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)，中間為核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding domain，NBD)，C端為亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeat domain，LRR)，可識(shí)別病原體、微生物毒素、核酸、ATP和結(jié)晶物質(zhì)等多種病原物質(zhì)[8]，因此NLRP3炎癥小體在固有免疫應(yīng)答中的作用靈活且多樣。

NLRP3炎癥小體經(jīng)典途徑靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)NLRP3表達(dá)水平極低，故NLRP3炎癥小體的活化需要預(yù)激活，病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)/損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)結(jié)合PRR，由核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)通路上調(diào)NLRP3及相關(guān)細(xì)胞因子前體的基因表達(dá)[9]。NLRP3配體與NLRP3受體蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，蛋白的NBD結(jié)構(gòu)域通過同型相互作用寡聚，而PYD結(jié)構(gòu)域與ASC蛋白的PYD結(jié)構(gòu)域也通過同型作用募集。多個(gè)組裝的ASC蛋白纖維構(gòu)成ASC蛋白斑塊，而后ASC蛋白的caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain，CARD)通過CARD-CARD相互作用募集效應(yīng)蛋白caspase- 1，使其自我裂解獲得蛋白水解活性[10]，完成炎癥小體的組裝，裂解Gasdermin D蛋白(Gasdermin D，GSDMD)[11]，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。有研究顯示，絲氨酸/蘇氨酸激酶NIMA相關(guān)蛋白激酶7(never in mitosis gene A-related kinase 7，NEK7)在有絲分裂間期參與組裝和激活NLRP3炎癥小體[12]，NEK7與NLRP3的寡聚對(duì)ASC蛋白斑塊的形成和caspase- 1的活化有重要作用[13- 14]。

能夠活化NLRP3炎癥小體的刺激物種類多樣、結(jié)構(gòu)不一，故推測(cè)NLRP3炎癥小體不是通過與刺激物直接相互作用從而被激活。目前關(guān)于炎癥小體的激活過程有不同模型理論，其中以鉀離子外流的模型最為普遍[15]，即細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度較低會(huì)激活NLRP3炎癥小體，而抑制細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流可以阻止NLRP3炎癥小體的激活[16]。鈣離子流動(dòng)也是激活NLRP3炎癥小體的關(guān)鍵事件[17]，但有研究發(fā)現(xiàn)了鈣離子非依賴性的NLRP3炎癥小體激活現(xiàn)象[18]。在炎癥小體形成過程中，氯離子外流也會(huì)促進(jìn)ASC的聚合[19]。除以上所述離子流動(dòng)模型外，還有一些模型涉及細(xì)胞器活性。線粒體在氧化磷酸化過程中持續(xù)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，在線粒體對(duì)ROS的清除功能減弱或喪失時(shí)，剩余ROS能夠激活NLRP3炎癥小體[20- 21]?？杀籒LRP3識(shí)別的多種物質(zhì)均能引起細(xì)胞內(nèi)高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans Golgi network，TGN)解體，形成分散的dTGN，從而募集NLRP3在dTGN上組裝形成活化的炎癥小體[22]。結(jié)晶物質(zhì)不直接作用于NLRP3受體蛋白，其通過溶酶體的吞噬作用，誘導(dǎo)溶酶體酸化、溶脹，通過鉀離子外流激活炎癥小體[15]。不同的模型理論中許多途徑相互關(guān)聯(lián)、重疊，也存在矛盾，目前尚不能完善地解釋NLRP3炎癥小體的激活機(jī)制。

NLRP3炎癥小體的其他途徑在以上所述的NLRP3炎癥小體經(jīng)典途徑之外，還存在其他活化途徑。革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在胞質(zhì)中與鼠caspase- 11或人caspase- 4和caspase- 5結(jié)合，引發(fā)NLRP3炎癥小體非經(jīng)典途徑[23]?；罨腸aspase- 4/5裂解GSDMD，誘導(dǎo)泛連接蛋白(pannexin)與P2X7受體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[24]。經(jīng)pannexin通道的鉀離子外流會(huì)激活NLRP3受體蛋白，形成NLRP3炎癥小體。DAMP也可激活或抑制NLRP3炎癥小體非經(jīng)典途徑[25- 26]。NLRP3炎癥小體的非經(jīng)典途徑與經(jīng)典途徑存在相互作用，并且已有綜述對(duì)此進(jìn)行總結(jié)[27]。在人單核細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)LPS能通過TLR4-TRIF-caspase- 8途徑激活NLRP3炎癥小體使IL- 1β成熟，該過程不涉及鉀離子外流和細(xì)胞焦亡，是NLRP3炎癥小體的旁路途徑[28]。

NLRP3炎癥小體的調(diào)節(jié)在預(yù)激活階段，經(jīng)MyD88的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠以非轉(zhuǎn)錄機(jī)制在基礎(chǔ)NLRP3表達(dá)水平上迅速激活炎癥小體，該過程可能與線粒體活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，且研究顯示NLRP3受體蛋白的去泛素化會(huì)促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活[27]。caspase- 8和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)在這一階段也可以調(diào)節(jié)NLRP3蛋白[29]。NLRP3蛋白不同位點(diǎn)的磷酸化可以促進(jìn)或抑制炎癥小體的形成[30- 31]；靜止細(xì)胞中多個(gè)位點(diǎn)被類泛素化的NLRP3處于抑制狀態(tài)，而突變導(dǎo)致的類泛素化缺陷能夠使NLRP3過度激活[32]。其他蛋白質(zhì)組分也能夠在裝配過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，研究顯示通過磷酸化NEK7，NLRP3炎癥小體被中心體蛋白Spata2抑制[33]，表明中心體和炎癥小體之間存在動(dòng)態(tài)相互作用。

同種刺激物可能激活不同炎癥小體，同時(shí)發(fā)揮作用。瘧原蟲產(chǎn)生的瘧色素和DNA會(huì)引起NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)類炎癥小體活化[34]。沙門氏菌可同時(shí)激活NLRP3和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family CARD domain containing 4，NLRC4)，顯微鏡下顯示感染時(shí)NLRP3和NLRC4的共定位現(xiàn)象[35]。目前此類研究大多涉及NLRP3炎癥小體，但尚不清楚這類雙重激活效應(yīng)的具體模式。

NLRP3炎癥小體與AD

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含有NLRP3炎癥小體組裝所需的全部組件。DAMP通過磷酸化Toll樣受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL- 1β前體、IL- 18前體和NLRP3受體蛋白的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體溶脹破裂[5]，僅此就足以作為激活NLRP3炎癥小體的內(nèi)源性信號(hào)。有研究證實(shí)，Aβ引發(fā)野生型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、ATP的釋放，炎癥小體激活，間接導(dǎo)致IL- 1β分泌增加，P2X7缺失型小鼠則無此現(xiàn)象[36]。IL- 1β通常在健康大腦中維持在低水平，而在有淀粉樣斑塊沉積的小鼠和AD患者中發(fā)現(xiàn)IL- 1β水平有所升高，caspase- 1剪切活性大幅提高[37]是其直接原因。IL- 1β分泌增加也會(huì)繼續(xù)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞合成相關(guān)炎性細(xì)胞因子，并可能導(dǎo)致具有潛在神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子聚集。此外，AD中淀粉樣斑塊釋放神經(jīng)毒性因子募集小膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)放大Aβ的神經(jīng)毒性作用，進(jìn)一步影響周圍組織[38]。近來有研究顯示，相對(duì)分子質(zhì)量較低的Aβ寡聚體也能夠激活NLRP3炎癥小體，表明可能在Aβ蛋白斑塊沉積前被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞就能夠啟動(dòng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫應(yīng)答[39]。根據(jù)基因表達(dá)譜可將活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分為不同亞型。AD小鼠模型中，NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化，對(duì)IL- 1β等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加，削弱吞噬清除Aβ的作用并造成神經(jīng)損傷[40]。在AD小鼠模型(APP/PS1小鼠)中敲除NLRP3受體蛋白或ASC，則淀粉樣斑塊沉積的癥狀得到緩解，說明特異性阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞中的NLRP3可使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型活化，分泌抗炎細(xì)胞因子，最終會(huì)減少細(xì)胞外Aβ蛋白沉積，防止突觸功能障礙和認(rèn)知功能減退[37]。

細(xì)胞內(nèi)tau蛋白沉積不是AD的主要病理特征，因此AD被認(rèn)為是一種繼發(fā)性tau蛋白疾病[41]。而NLRP3炎癥小體在AD疾病中的作用不僅與Aβ有聯(lián)系，還與tau蛋白相關(guān)，Aβ蛋白誘導(dǎo)的tau蛋白病變中也有NLRP3炎癥小體的參與。有證據(jù)表明，NLRP3炎癥小體功能缺失能夠顯著緩解tau蛋白的過度磷酸化，因此可以在一定程度上遏制tau蛋白疾病進(jìn)程。tau蛋白寡聚體或單體也可以激活NLRP3炎癥小體，影響AD致病進(jìn)程[42]。

以NLRP3炎癥小體為靶標(biāo)治療AD

由于NLRP3炎癥小體在AD病程進(jìn)展中起重要作用，以其為靶標(biāo)治療相關(guān)疾病成為研究的一大熱點(diǎn)。目前針對(duì)NLRP3炎癥小體通路及其調(diào)節(jié)機(jī)制，已有多項(xiàng)研究提出潛在抑制靶點(diǎn)，并報(bào)道了相應(yīng)的NLRP3抑制劑，直接或間接抑制炎癥小體組分及相關(guān)信號(hào)通路。

非甾體類抗炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一類不良反應(yīng)很小的抗炎藥物，作用于環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)1和COX2。甲芬那酸是一種常用NSAID，已顯示出選擇性抑制NLRP3炎癥小體的作用，具體機(jī)制與氯離子通道有關(guān)。該藥物能夠完全阻止小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及IL- 1β在AD相關(guān)神經(jīng)炎癥中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，甲芬那酸可以減輕神經(jīng)元培養(yǎng)物中淀粉樣蛋白的毒性作用并緩解注射淀粉樣蛋白單體的大鼠記憶力減退的癥狀[43]。

磺胺類藥物是一類具有廣譜抑菌活性的化學(xué)合成藥，其中有些藥物能夠通過血腦屏障滲入腦脊液，如磺酰胺類似物JC- 124。JC- 124在NLRP3激活步驟中對(duì)多種刺激模式起作用，可以選擇性抑制NLRP3炎癥小體的形成和caspase- 1的活性，被證實(shí)能夠緩解TgCRND8和APP/PS1小鼠的AD癥狀并改善其認(rèn)知功能[44]。

姜黃素是從姜黃根莖中提取出的一種天然疏水性多酚，可對(duì)NLRP3炎癥小體通路造成干擾。姜黃素在體外神經(jīng)元培養(yǎng)物中能夠結(jié)合并破壞Aβ蛋白斑塊，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用[45]。因此，姜黃素類似物也是AD的潛在有效藥物。

黃體酮(progesterone，PG)是一種具有神經(jīng)活性的類固醇，近來有研究表明，PG通過增強(qiáng)自噬作用顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活，起到保護(hù)神經(jīng)的作用[46]。而在小膠質(zhì)細(xì)胞中是否有同樣作用仍待進(jìn)一步研究。

在大鼠淀粉樣蛋白注射模型中也發(fā)現(xiàn)，用P2X7拮抗劑進(jìn)行藥理干預(yù)有效[36]。雖然P2X7受體在不同種類細(xì)胞中具有多樣功能，因而可能存在脫靶效應(yīng)，但在AD中多種細(xì)胞的P2X7受體表達(dá)均有所提高，影響淀粉樣蛋白斑塊的形成，所以該靶點(diǎn)仍有一定的研究價(jià)值。

組織蛋白酶B是caspase- 11的上游激活物，組織蛋白酶B的抑制劑CA074Me在AD小鼠模型中顯示出一定的治療效果[47]，但也有證據(jù)表明組織蛋白酶B在淀粉樣蛋白降解中有作用[48]，因此需進(jìn)一步研究該靶點(diǎn)的可行性。

阻滯IL- 1、IL- 18信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性抗體已經(jīng)在美國獲準(zhǔn)用于多種炎癥性疾病治療[49]，靶向該位點(diǎn)的AD治療也取得一定進(jìn)展[50]。但研究發(fā)現(xiàn)，IL- 1 1型受體(interleukin- 1 receptor 1，IL- 1R1)基因敲除小鼠出現(xiàn)認(rèn)知缺陷，提示抑制IL- 1R1可能對(duì)AD產(chǎn)生負(fù)面影響[51]。

目前對(duì)NLRP3炎癥小體組成蛋白直接進(jìn)行抑制的有效藥物比較有限，藥物設(shè)計(jì)多采用抑制NEK7[52]、阻斷結(jié)構(gòu)域相互作用位點(diǎn)、改變NLRP3泛素化狀態(tài)[53]、改變蛋白磷酸化水平[54]等幾條主要思路，且對(duì)于治療AD的有效性尚不明確，需要結(jié)合AD動(dòng)物模型繼續(xù)研究。

總結(jié)與展望

NLRP3炎癥小體在固有免疫中起重要作用，并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在嚙齒動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NLRP3炎癥小體在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞甚至神經(jīng)元中均存在[55]，因此參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞不僅局限于小膠質(zhì)細(xì)胞。已有大量證據(jù)將NLRP3炎癥小體與AD的發(fā)病機(jī)制及病程進(jìn)展聯(lián)系起來，提示其作為AD治療靶點(diǎn)的可能。NLRP3炎癥小體通路及AD相關(guān)藥物靶點(diǎn)見圖1。

NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3；DAMPs：損傷相關(guān)分子模式；PAMPs：病原相關(guān)分子模式；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子κB；FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白；ROS：活性氧；ASC：凋亡相關(guān)微粒蛋白；PYD：熱蛋白結(jié)構(gòu)域；NBD：核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域；LRR：亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域；CARD：caspase募集結(jié)構(gòu)域；IL：白細(xì)胞介素；GSDMD：Gasdermin D蛋白；①：NLRP3炎癥小體經(jīng)典途徑；②：NLRP3炎癥小體非經(jīng)典途徑；③：NLRP3炎癥小體旁路途徑NLRP3：nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3；DAMPs：damage-associated molecular patterns；PAMPs：pathogen-associated molecular patterns；NF-κB：nuclear factor-κB；FADD：Fas-associated protein with death domain；ROS：reactive oxygen species；ASC：apoptosis-associated speck-like protein containing CARD；PYD：pyrin domain；NBD：nucleotide-binding domain；LRR：leucine-rich repeat；CARD：caspase activation and recruitment domain；IL：interleukin；GSDMD：Gasdermin D；①：the canonical activation of NLRP3 inflammasome；②：the non-canonical activation of NLRP3 inflammasome；③：the alternative activation of NLRP3 inflammasome圖1 NLRP3炎癥小體通路及阿爾茲海默病相關(guān)藥物靶點(diǎn)示意圖Fig 1 NLRP3 inflammasome pathways and relevant drug targets for Alzheimer’s disease

實(shí)際上，炎癥反應(yīng)對(duì)于AD的進(jìn)展具有雙重作用，并取決于特定的局部生理或病理環(huán)境。因此，控制NLRP3炎癥小體、保持中樞系統(tǒng)免疫細(xì)胞在適當(dāng)?shù)幕罨綇亩S持固有免疫應(yīng)答的平衡狀態(tài)對(duì)AD患者是有益的。盡管我們對(duì)于NLRP3炎癥小體通路的探索已取得很大進(jìn)展，但其在AD中的確切機(jī)制有待更深入的研究。NLRP3炎癥小體通路涉及廣泛，其組分存在其他旁路調(diào)節(jié)功能，若以該通路靶向治療AD，在一些靶點(diǎn)可能會(huì)出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，還需要對(duì)治療藥物及方式進(jìn)行全面評(píng)估。此外，由于NLRP3炎癥小體在全身免疫系統(tǒng)的固有免疫應(yīng)答中均扮演重要角色，以NLRP3炎癥小體為靶標(biāo)對(duì)AD進(jìn)行治療時(shí)不僅要考慮癥狀的治療效果，還要考慮抑制炎癥小體功能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)外免疫狀態(tài)的影響，因此，以靶向給藥、研發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性抑制劑等方式進(jìn)行更加精準(zhǔn)的局部調(diào)控是未來研究方向的重點(diǎn)。