鴨坦布蘇病毒熒光定量RT-PCR 方法的建立及應(yīng)用

王巧萍，嚴(yán)紅亞，李 珂，朱鶴然，元正菊，常志順，張以芳，信愛國

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南昆明 650224）

鴨坦布蘇病毒病是一種由鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV）引起的傳染病。它于1955 年被發(fā)現(xiàn)，2010 年傳入我國，且在我國東南部地區(qū)大范圍擴(kuò)散，造成了至少數(shù)十億的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。該病主要危害鴨和鵝，以產(chǎn)蛋量持續(xù)下降為主要特征[3]，降至低谷后由于機(jī)體康復(fù)而慢慢恢復(fù)，但種蛋的受精率和孵化率受到極大影響[4]。病鴨還表現(xiàn)為不愛下水、采食量下降，種鴨在恢復(fù)后期大多出現(xiàn)換羽現(xiàn)象[5]。感染鴨剖檢最明顯的病變主要見于卵巢，可見卵泡充血、出血、變性和萎縮，發(fā)生卵黃性腹膜炎[6]，輸卵管覆蓋黏液等，肺和脾臟腫大出血[7]；部分病例可見肝臟表面有針尖狀白色壞死點、出血、淋巴細(xì)胞滲出和增生[8]；腦組織水腫、出血、呈樹枝狀充血，偶見胰腺出血和壞死，心臟內(nèi)膜出血；部分患病鴨盲腸內(nèi)容物呈綠色或黑色，有的可見霉斑附著[9]。本病病程較長，嚴(yán)重者可出現(xiàn)死亡，但死亡率較低[10]。

該病在我國大多數(shù)養(yǎng)鴨地區(qū)均造成了一定經(jīng)濟(jì)損失，因此建立一種快速而靈敏的檢測方法極為重要。其臨床診斷主要是觀察癥狀及制作病理切片，但是通過觀察很難與其他引起相似癥狀的疾病做區(qū)分，而制作病理切片耗時較長，因此需要將臨床診斷與實驗室診斷相結(jié)合。目前可用于DTMUV 的實驗室診斷方法有病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷等。病原學(xué)診斷中的病毒分離鑒定耗時長，技術(shù)難度大[11]，對試驗人員安全有一定程度威脅；血清學(xué)檢測耗時費力，在臨床診斷方面局限性較大，病毒分離鑒定和血清學(xué)診斷的敏感性和特異性都較差；普通RT-PCR 檢測費時較多，過程中包含變性、退火、延伸等階段，較為復(fù)雜，且敏感性較低，而qRT-PCR 技術(shù)具有高通量、花費時間少等優(yōu)點[12]，是一種成熟的核酸擴(kuò)增技術(shù)，自問世以來在病毒檢測上發(fā)揮著極大作用[13-14]。

DTMUV 基因組包含一個開放閱讀框（ORF），編碼3 種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM/M、E）和7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。其中NS5 蛋白具有RNA 依賴的RNA 聚合酶活性，而且是黃病毒中最保守的非結(jié)構(gòu)蛋白，因此試驗基于DTMUV 的保守基因NS5建立了MGB 探針qRT-PCR 檢測方法，可從病料中快速檢測出DTMUV，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、花費時間少等優(yōu)點，為該病的防控和診斷提供了可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 DTMUV YN2019 株BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)毒，由本研究所分離并保存；新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、Ⅰ型和Ⅲ型鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus，DHV）、傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV），均由本研究所保存；H5、H7 和H9 亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）滅活抗原，購自華南農(nóng)大生物藥品有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 病毒RNAiso Plus試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；pEASY?-T1 Cloning Kit、Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒，購自北京全式金公司生物技術(shù)有限公司；One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time），購 自TaKaRa 公司；LightCycler 96 Real-time RT-PCR 擴(kuò)增儀，購自Roche Diagnostics 公司。

1.2 引物、探針設(shè)計與合成

根據(jù)已發(fā)表的DMTUVNS5基因序列（登錄號：KJ958533），采用VectorNTI 8.0 序列分析軟件做對比分析，利用Primer 5.0 軟件自主設(shè)計了2對針對NS5基因的檢測引物和1 條MGB 探針。RT-PCR 檢測引物同時用于制備標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒，在探針的5'和3'端分別標(biāo)記FAM 熒光報告基團(tuán)和MGB 非熒光淬滅基團(tuán)。引物序列見表1，所有引物均由碩擎生物科技有限公司合成，并稀釋成工作濃度（10 pmol/L）置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 DTMUV 引物信息

1.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備

將保存的DTMUV 細(xì)胞毒、NDV、Ⅰ型和Ⅲ型DHV、AIV 滅活抗原（H5、H7、H9 亞型）分別取200 μL，用病毒RNAiso Plus 試劑提取核酸。然后用DTMUV-uF/uR 引物對DTMUV 核酸進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50.0 μL：Prime Script 1step Enzyme Mix 2.0 μL，2×1 step Buffer（Dye plus）25.0 μL，DTMUV-uF/uR 各1.0 μL，total RNA 2.0 μL，RNase-free ddH2O 19.0 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行35 個循環(huán)；72 ℃ 15 min，最后4 ℃冷卻。RT-PCR 結(jié)束后，取5.0 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，然后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行初步鑒定。

對凝膠電泳產(chǎn)物按照DNA 凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收純化，然后按照pEASY?-T1 Cloning Kit 說明書將擴(kuò)增片段連接至pEASY?-T1克隆載體；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，挑選平板上的單個克隆菌落置于7 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）中進(jìn)行過夜擴(kuò)大培養(yǎng)。菌液經(jīng)PCR 鑒定為陽性的克隆送擎科生物科技有限公司測序，挑選測序正確的質(zhì)粒按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR 鑒定為陽性的質(zhì)粒DNA 用核酸定量儀測定其濃度。

1.4 qRT-PCR 方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

按照TaKaRa 公司One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time）說明書，進(jìn)行qRTPCR 體系配置及擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer II 10.0 μL，TaKaRa ExTaqHS（5 U/μL）0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μL，DTMUV-qF/qR（10 pmol/L）各0.4 μL，DTMUV-qP 0.3 μL，RNA 2.0 μL，最后用RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足到20.0 μL。擴(kuò)增程序：42 ℃5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個循環(huán)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：將1.3 中制作好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品測定濃度后，通過10 倍連續(xù)梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)模板，共設(shè)置108～102copies/μL 7 個濃度梯度，同時設(shè)立空白對照，試驗進(jìn)行3 次平行重復(fù)，建立DTMUV qRT-PCR 檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 MGB 探針法qRT-PCR 引物特異性驗證

為探明MGB 探針法qRT-PCR 的引物是否有非特異性擴(kuò)增及產(chǎn)物是否單一，將DTMUV 核酸用剔除MGB 探針后的SYBR Green I 染料法進(jìn)行擴(kuò)增，并比較兩種情況下的熔解曲線。MGB 探針法qRT-PCR 按照1.4 中的步驟進(jìn)行。

SYBR Green I 染料法qRT-PCR 具體如下：將DTMUV RNA 按照Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒說明書，進(jìn)行以下20.0 μL 反轉(zhuǎn)錄體系配置：Random Primer（0.1 μg/μL）1.0 μL，2×TS Reaction Mix 10.0 μL，gDNA Remover 1.0 μL，RNase-Free ddH2O 4.0 μL，Trans Script RI/RT Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA 3.0 μL。反轉(zhuǎn)錄于普通PCR儀中進(jìn)行，程序為25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后4 ℃冷卻。

用反轉(zhuǎn)錄好的cDNA 配置SYBR Green I 20.0 μL體 系：DTMUV-qF/qR（10 pmol/L）各0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR Super Mix 10.0 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL，最后加入cDNA 2.0 μL。qRT-PCR 程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s；54 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)。在LightCycler 96 qRT-PCR擴(kuò)增儀中開展擴(kuò)增。

1.6 qRT-PCR 和普通RT-PCR 敏感性試驗

對1.3 中制備的DTMUV 陽性質(zhì)粒測定濃度后，用RNase-Free ddH2O 進(jìn)行10 倍梯度倍比稀釋（100～10-7copies/μL），按1.4 中的步驟和體系進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，以確定其最低檢出量；普通RTPCR 用DTMUV YN2019 株提取的RNA 進(jìn)行梯度稀釋，按1.3 中的程序進(jìn)行，結(jié)束后進(jìn)行核酸電泳查看結(jié)果。

1.7 qRT-PCR 特異性試驗

對DTMUV YN2019 株、I 型和III 型DHV、NDV、AIV 滅活抗原（H5、H7、H9 亞型）提取的核酸樣品，進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，以驗證其特異性。

1.8 重復(fù)性試驗

將DTMUV 陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍梯度稀釋為7 個濃度梯度（108～102copies/μL），用建立的qRT-PCR 方法檢測，每個濃度重復(fù)3 次。在試驗的第1、3 和5 天重復(fù)檢測3 次為批間重復(fù)試驗，在同一天的早、中、晚3 個時段重復(fù)檢測3 次為批內(nèi)重復(fù)試驗。根據(jù)Cq 值計算批內(nèi)和批間的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以驗證其重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品檢測

從云南不同地區(qū)的養(yǎng)鴨場收集20 份有產(chǎn)蛋下降臨床疑似癥狀的樣品，將每份樣品取約5.0 g 剪碎；加入與樣品體積比為1:4 的PBS（pH7.2），用研缽研磨，反復(fù)凍融3 次并低速離心；取上清提取總RNA 并按照1.4 中的qRT-PCR 方法進(jìn)行檢測，以確定其臨床適用性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

經(jīng)核酸定量儀測定可知，DTMUV 陽性質(zhì)粒濃度為355.85 ng/μL，根據(jù)公式計算得出拷貝數(shù)為3×109copies/μL。先 用RNase-Free ddH2O 將 其稀釋至1×109copies/μL，再進(jìn)行連續(xù)10 倍倍比稀釋，使其濃度為108～102copies/μL。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為x軸，以Cq 值為y軸，繪制回歸方程，可得到DTMUV qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖）1，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，擴(kuò)增效率E=1.93，回歸方程為y=-3.513 3x+32.125，具有良好的線性關(guān)系。

圖1 qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 MGB 探針法qRT-PCR 引物特異性驗證

將同一核酸樣品通過MGB 探針法與無MGB探針的SYBR Green I 染料法擴(kuò)增，比較兩者的熔解曲線。結(jié)果顯示：SYBR Green I 染料法擴(kuò)增的熔解曲線出現(xiàn)尖峰狀的單一曲線（圖2），說明產(chǎn)物單一，無非特異性反應(yīng)；而MGB 探針法的熔解曲線則不出現(xiàn)單一峰值，總體呈現(xiàn)波浪狀（圖3）。

圖2 SYBR Green I 染料法熔解曲線的單一尖峰

圖3 MGB 探針法的波浪狀熔解曲線

2.3 qRT-PCR 和普通RT-PCR 敏感性試驗

對制備的DTMUV 陽性質(zhì)粒（濃度為355.85 ng/μL）連續(xù)10 倍稀釋至100～10-78 個稀釋度，進(jìn)行qRT-PCR 檢測。結(jié)果顯示，最低檢出量為10-7稀釋度，即3×102copies/μL（圖4）。經(jīng)測定，DTMUV YN2019 株核酸濃度為32.4 ng/μL，普通RT-PCR 可檢出的最低稀釋度為10-3，因此普通RT-PCR 最低檢出量為32.4 pg/μL（圖5），即2.8×106copies/μL，說明qRT-PCR 的靈敏度比普通RT-PCR 高出約10 000 倍。

圖4 qRT-PCR 檢測DTMUV 不同稀釋度質(zhì)粒的敏感性試驗結(jié)果

圖5 不同稀釋度DTMUV YN2019 株普通RT-PCR 檢測結(jié)果

2.4 特異性試驗

擴(kuò)增曲線（圖6）顯示，使用建立的qRT-PCR方法僅對DTMUV 能擴(kuò)增出特異性曲線，而對其他禽源病毒（DHV、AIV、NDV、IBDV）檢測結(jié)果均為陰性。

圖6 qRT-PCR 檢測DTMUV 特異性試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗

表2 qRT-PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測

對云南不同地區(qū)養(yǎng)鴨場收集的20 份臨床疑似樣品提取RNA，采用qRT-PCR 方法進(jìn)行檢測，結(jié)果測定為陽性的有12 份，其陽性率為60%，而普通RT-PCR 的陽性率僅為50%，兩者符合率為90%（表3），說明qRT-PCR 檢出率更高，更適合于臨床樣品檢測。

表3 臨床樣品檢測結(jié)果

3 分析與討論

本試驗針對DTMUVNS5基因設(shè)計了特異性引物和MGB 探針，建立了DTMUV 的qRT-PCR檢測方法。用普通RT-PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行T-A 克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒，并用其制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線；用SYBR Green I 染料法驗證了MGB 探針法引物是否會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，對qRT-PCR 檢測方法的特異性、敏感性、重復(fù)性進(jìn)行了驗證，并將其應(yīng)用于臨床樣品檢測。

SYBR Green I 是一種可與所有ds DNA 雙螺旋小溝區(qū)域非特異性結(jié)合、具有綠色激發(fā)波長的染料，其在游離狀態(tài)下僅發(fā)出微弱熒光，但是與雙鏈DNA 結(jié)合后熒光信號將會大大增強(qiáng)[15]。實際上其通過熒光信號直觀反映了模板數(shù)量：在反應(yīng)最初雙鏈DNA 產(chǎn)生的量少，SYBR Green I 染料與之結(jié)合也較少，因此收集到的熒光信號較弱；由于積累效應(yīng)，在某一時刻雙鏈DNA 量可達(dá)最高值，染料與之大量結(jié)合并發(fā)出熒光信號；雙鏈DNA 逐漸消耗染料，在兩者的量都減少的同時熒光信號也逐漸變?nèi)?，兩者的反?yīng)在整個核酸擴(kuò)增過程中大體上呈現(xiàn)正態(tài)分布。由于SYBR Green I 染料法的非特異性，在臨床上產(chǎn)生假陽性的概率極大，所以通常需要繪制熔解曲線來確定反應(yīng)產(chǎn)物。

MGB 探針診斷技術(shù)基本原理是堿基互補(bǔ)配對原則。通過在探針5'端標(biāo)記FAM 熒光報告基團(tuán)，在3'端標(biāo)記MGB 非熒光淬滅基團(tuán)，利用Taq酶的5'—3'聚合酶活性和3'—5'外切酶活性，根據(jù)能量共振轉(zhuǎn)移原理，當(dāng)整個MGB 探針完整存在時，熒光信號被外切核酸酶3'端淬滅基團(tuán)吸收，不能發(fā)出熒光，只有探針和目的基因特異性結(jié)合時，即探針被分解后，5'熒光物質(zhì)便會游離出來發(fā)出熒光，熒光檢測系統(tǒng)接收到熒光信號，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)熒光信號的累積，PCR 產(chǎn)物形成量與熒光信號的累積和收集處于完全同步狀態(tài)[16]，即探針法根據(jù)熒光信號值的變化可以實時檢測每一輪擴(kuò)增過程中循環(huán)產(chǎn)物的變化量，所以探針法的熔解曲線并不是單一的尖峰狀，而是波浪形，其無法證明引物的特異性，所以結(jié)合SYBR Green I 染料法證明了試驗中的MGB 探針法的產(chǎn)物單一，熔解曲線單一，且無非特異性擴(kuò)增。

用標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系顯著，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，擴(kuò)增效率E=1.93，回歸方程為y=-3.513 3x+32.125；普通RT-PCR 重復(fù)性良好，qRT-PCR 批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性的變異系數(shù)為0.08%～0.49%，均小于0.5%，說明兩者的重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好。有國內(nèi)學(xué)者[17-20]報道建立的TaqMan 探針法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均大于0.5%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率E均小于1.93，這表明本試驗建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較前人的好，且該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性也更好。

特異性檢測結(jié)果顯示該方法只能檢出DTMUV，對于NDV、I 型和III 型DHV、IBDV、H5/H7/H9 亞型AIV 滅活抗原則均不能檢出，表明其特異性良好；于春梅等[21]建立的SYBR Green I染料法需要設(shè)立內(nèi)參基因β-actin，而且存在反轉(zhuǎn)錄過程，過程中增加了核酸和引物被污染的概率；且SYBR Green 染料既能與特異性產(chǎn)物結(jié)合，也能與非特異性產(chǎn)物結(jié)合[22]，其假陽性高于MGB 探針法，故MGB 探針法的特異性也更強(qiáng)。

本試驗建立的qRT-PCR 可檢測的最低限度為3×102copies/μL，普通RT-PCR 的敏感性為2.8×106copies/μL，說明qRT-PCR 的敏感性是普通RT-PCR 的約10 000 倍；應(yīng)用該方法檢測20 份相同的臨床樣品，qRT-PCR 檢出12 份為陽性，其陽性率為60%，而普通RT-PCR 只檢出10 份為陽性，其陽性率為50%，說明qRT-PCR 的檢出率更高，更適合于臨床樣品檢測；在150 min 內(nèi)qRTPCR 能夠完成所有檢測過程，而普通RT-PCR 則需要240 min 才能完成，萬春和等[23]建立的SYBR Green I 染料法整個過程也需花費240 min，以上數(shù)據(jù)說明本試驗建立的qRT-PCR 花費時間更短，檢出率更高，敏感性更強(qiáng)。

綜上所述，本試驗針對DTMUV 保守基因NS5建立的MGB探針qRT-PCR具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，耗時少，適用于臨床樣品檢測，可為DTMUV 的臨床檢測和監(jiān)控提供技術(shù)手段。