貓細小病毒VP2 基因克隆與生物信息學分析

姜 偉，郭明佳，吳樹康

（龍口市動物疫病預防控制中心，山東省龍口市 265701）

貓細小病毒（feline parvovirus，F(xiàn)PV）又被稱為貓泛白細胞減少癥病毒（feline panleukopenia virus），是一種可以感染貓科、浣熊科及鼬科等多種動物的急性、致死性烈性傳染病病原[1]。該病原主要通過帶毒的糞便、尿液及口腔分泌物傳播，可以導致感染動物出現(xiàn)體溫升高、嘔吐、腹瀉及白細胞數(shù)量嚴重減少等多種臨床癥狀，且小型貓科動物對其易感性最高[2]。

FPV 屬于細小病毒科（Paroviridae）細小病毒屬（Parvovrius），是無囊膜的單股正鏈DNA 病毒，其基因組主要有兩個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，其中右側ORF 編碼重要的病毒結構蛋白——VP1 和VP2[3]。FPV 衣殼主要由VP2 結構蛋白組成，其含量可高達90%。同時，VP2 結構蛋白也是FPV 的主要抗原蛋白及受體結合蛋白，可以有效刺激機體產(chǎn)生針對FPV 的中和抗體并影響其致病性、宿主范圍及血凝活性等多種生物學特性[4-5]。

因此，本研究通過對龍口市動物疫病預防控制中心分離保存的FPV 毒株（SD-01）VP2基因進行克隆及生物信息學分析，了解VP2 蛋白的分子特點及變異規(guī)律，以期為后續(xù)疫苗及診斷試劑盒研發(fā)提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

全基因組DNA 提取試劑盒（D1800）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（D1100），購自于北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α 感受態(tài)細胞（9057）、pMD18-T（6011），購自于寶生物工程（大連）有限公司；EasyTaqDNA Polymerase（AP111）酶，購自于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 毒株

FPV 毒株（SD-01）由龍口市動物疫病預防控制中心從2021 年5 月山東省龍口市采集病料中分離鑒定及保存。

1.3 主要方法

1.3.1 引物設計與合成 參照GeneBank 中公布的FPV 全基因組序列（登錄號MT614366），使用Primer 5.0 軟件設計1 對引物用于擴增SD-01 毒株的VP2基因及其兩端非編碼區(qū)（上游引物序列：5'-aagtaaaaagagacaatcttgcacca-3'；下游引物序列：5'-catacttactatgtttttatg-3'），預期擴增目的片段大小約為1 755 bp。引物序列送至上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2VP2基因克隆及序列分析 參考說明書使用全基因組DNA 提取試劑盒提取SD-01 毒株的全基因組DNA，然后以此為模板使用1.3.1 中設計的引物進行PCR 擴增。PCR 反應體系：EasyTaqDNA Polymerase 25.0 μL，上、下游引物各2.5 μL，DNA 模板2.0 μL，DEPC 水補足50.0 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用1.0%的瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，并使用膠回收試劑盒回收PCR 陽性產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將回收的擴增片段與pMD18-T 載體連接。連接體系：5.0 μL Solution、4.5 μL 膠回收產(chǎn)物、0.5 μL pMD18-T 載體，16 ℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉化至DH5α 感受態(tài)細胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單個菌落培養(yǎng)并進行菌液鑒定。將菌液鑒定陽性的樣品送至上海生工生物工程有限公司進行測序，并參考NCBI 上公布的FPVVP2基因序列，以犬細小病毒（CPV）毒株作為對照，使用DNAstar 及Mega 5.0[6]軟件進行同源性分析并構建發(fā)育進化樹。參考序列詳情見表1。

表1 NCBI 上公布的參考毒株VP2 基因序列信息

1.3.3VP2基因生物信息學分析 使用多種軟件對FPVVP2基因進行生物信息學分析，具體軟件見表2。

表2 本研究所使用的生物信息學工具

2 結果與分析

2.1 VP2 基因擴增與克隆

以1.3.2 中提取的SD-01 株DNA 為模板，1.3.1 中設計的序列為引物，成功擴增出片段大小為1 755 bp 的PCR 產(chǎn)物，與預期結果一致。將PCR 產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T 載體上，進行菌液鑒定后送至生物公司進行測序，并將測序結果進行BLAST 比對。比對結果顯示，擴增出的PCR產(chǎn)物為FPVVP2基因，并成功構建了重組質(zhì)粒，將其命名為pMD18-T-FPV SD-01-VP2。

2.2 VP2 蛋白氨基酸同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析

從GeneBank 中下載已公布的國內(nèi)FPV 毒株序列及部分國外代表株序列（表1），使用DNAstar 和Mega 5.0 軟件，對SD-01 株及其他FPV 毒株的VP2 蛋白進行氨基酸同源性分析并構建系統(tǒng)進化樹。氨基酸同源性比對結果顯示，SD-01 株VP2 蛋白與其他FPV 株VP2 蛋白相比，氨基酸同源性為99.0%～100%，與CPV 參考序列VP2 蛋白的氨基酸同源性為97.9%～98.1%（圖2）。氨基酸序列進化樹結果顯示，SD-01 株VP2基因與其他FPV 毒株的VP2基因處于同一個大分支，且與葡萄牙分離株PT09 的親緣關系最為相近（圖3）。

圖1 FPV SD-01 株VP2 基因PCR 擴增結果

圖2 SD-01 株VP2 基因氨基酸同源性分析結果

圖3 SD-01 株VP2 基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3 VP2 蛋白基本理化性質(zhì)

使用在線軟件Prot-Param 對SD-01 株VP2蛋白的基本理化性質(zhì)進行預測[5]。結果顯示：VP2 蛋白共由584 個氨基酸組成，其分子式為C2884H4357N785O882S17，共含有8 925 個原子，理論相對分子質(zhì)量為64 683.07 u；含有56 個負電荷氨基酸殘基，44 個正電荷氨基酸殘基，理論等電點為5.44；理論的不穩(wěn)定系數(shù)為27.80，屬于穩(wěn)定蛋白。蛋白的親疏水性預測結果為-0.508，表明VP2 蛋白可能為親水性蛋白。

2.4 VP2 蛋白結構分析

使用在線軟件SignalP-5.0 和TMHMM Server v.2.0，預測SD-01 株VP2 蛋白信號肽和跨膜區(qū)域，發(fā)現(xiàn)信號肽預測值為0.002（圖4），表明VP2 蛋白無信號肽區(qū)域，推測其可能為非分泌型蛋白?？缒^(qū)預測結果（圖5）顯示，VP2 蛋白可能為非跨膜蛋白，且主要定位于膜外區(qū)域。

圖4 SD-01 株VP2 蛋白信號肽預測結果

圖5 SD-01 株VP2 蛋白跨膜區(qū)預測結果

應用SOPMA 軟件和SWISS-Model 數(shù)據(jù)庫，對SD-01 株VP2 蛋白的二級結構和三級結構進行預測。結果（圖6）顯示，VP2 蛋白二級結構中含有51 個α 螺旋（藍色）、143 個延伸鏈（紅色）、25 個β 轉角（綠色）和365 個無特定結構的卷曲（橘色），分別占二級結構的8.7%、24.5%、4.3%和62.5%。SWISS-Model 同源建模結果（圖7）顯示，VP2 蛋白三級結構中，以無規(guī)則卷曲為主，該結果與二級結構預測結果相一致。

圖6 SD-01 株VP2 蛋白二級結構預測結果

圖7 SD-01 株VP2 蛋白三級結構預測結果

2.5 VP2 蛋白亞細胞定位預測

使用在線軟件TargetP 1.1 和PSORT II Prediction，對FPV SD-01 株VP2 蛋白的亞細胞定位進行預測。結果顯示：VP2 蛋白不含有線粒體導肽（mTP）或分泌通道信號肽（SP）；VP2 蛋白定位在細胞質(zhì)和細胞核中的概率較高，分別為47.8%和26.1%；定位在線粒體、細胞質(zhì)膜和細胞骨架的可能較低，分別為17.4%、4.3%和4.3%。同時，VP2 蛋白的C 端含有一個過氧化物酶靶向信號，可能會被過氧化物酶識別從而發(fā)揮其生物學功能。

2.6 VP2 蛋白B 細胞抗原表位分析

采用在線軟件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0，對VP2 蛋白的B 細胞抗原表位進行預測，并結合蛋白的二級結構、表面可及性及抗原指數(shù)性等因素，預測VP2 蛋白可能存11 個氨基酸數(shù)目大于7 的抗原表位，分別為4～56、86～99、156～167、213～239、270～279、294～315、322～328、337～445、507～520、551～562 和574～580，抗原趨勢最高值為0.681，是位于第18位氨基酸殘基精氨酸上（表3、圖8）。

表3 SD-01 株VP2 蛋白B 細胞抗原表位預測結果

圖8 SD-01 株VP2 蛋白的B 細胞抗原表位預測結果

2.7 VP2 蛋白翻譯后修飾位點預測

本研究采用多種蛋白翻譯后修飾預測軟件（NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0），對FPV VP2 蛋白進行修飾位點預測。結果顯示：VP2 蛋白可能存在49 個磷酸化修飾位點，其中絲氨酸（S）12個、酪氨酸（T）9個、蘇氨酸28個（圖9）；6 個N-糖基化修飾位點，分別為第25、47、64、180、443、505 位（圖10）；21 個O-糖基化修飾位點，分別為第2、21、23、27、41、221、223、225、226、228、230、348、349、355、388、389、390、391、394、399、433 位。這些修飾位點在FPV VP2 蛋白內(nèi)高度保守，因此推測這些位點可能影響了VP2 蛋白的構象或生物學功能。

圖9 SD-01 株VP2 蛋白的磷酸化修飾位點預測結果

圖10 SD-01 株VP2 蛋白的N-糖基化修飾位點預測結果

3 討論

無囊膜病毒主要由衣殼蛋白及遺傳物質(zhì)組成。其中衣殼蛋白在無囊膜病毒感染細胞及其復制過程中發(fā)揮著關鍵作用，影響著病毒的宿主嗜性、細胞敏感性、致病性以及對宿主天然免疫的拮抗能力。同時，衣殼蛋白也是無囊膜病毒的重要抗原蛋白，具有良好的免疫原性，可以誘導機體產(chǎn)生高水平的細胞免疫和體液免疫。FPV 衣殼蛋白主要由結構蛋白VP1 和VP2 組成。VP1 雖占衣殼蛋白的總量不高，不足15%，但其是產(chǎn)生具有感染性病毒粒子的必要組分[7]。VP2 蛋白是衣殼蛋白的主要成分，其含量占衣殼蛋白的80%以上，同時也是FPV 主要的抗原蛋白，可以誘導機體產(chǎn)生有效的中和抗體[8]。同時，VP2 蛋白也是面對宿主壓力重要的變異蛋白，因此對細小病毒的遺傳進化分析主要是針對VP2 蛋白。

本研究克隆了FPV SD-01 株的VP2基因，測序得知VP2基因全長為1755 bp，共編碼584 個氨基酸。根據(jù)VP2 蛋白氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹可知，分離毒株SD-01 雖為國內(nèi)分離株，但在親緣關系上與葡萄牙分離株PT09 更為接近，而PT09 株分離時間較早，因此推測SD-01 株可能是從國外傳播到國內(nèi)的。目前CPV 雖有多種亞型的報道，且新亞型有取代傳統(tǒng)亞型成為主要流行毒株的趨勢，但是關于FPV 亞型的分類還未見到相關報道[9-11]。本研究構建的FPV VP2 蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化樹顯示，所有FPV 毒株位于一個大分支上，但除了少數(shù)毒株外，大部分FPV 毒株又可被分為3 個小分支。由此推測在宿主和免疫的雙重壓力下，F(xiàn)PV有進一步進化從而產(chǎn)生亞型分化的趨勢，所以臨床上要加強對FPV 的流行病學監(jiān)測，以便在新變異亞型出現(xiàn)時可以快速應對。

通過對SD-01 株VP2 蛋白的理化性質(zhì)及高級結構預測分析可知，VP2 蛋白為親水性非分泌性蛋白，沒有跨膜區(qū)，因此推測大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞-桿狀病毒、真核細胞等多種表達系統(tǒng)都可被用于高效表達VP2 蛋白。VP2 蛋白上有兩個主要的抗原決定簇A 和B，其中決定簇A 由第93、222、224、426 位氨基酸殘基組成，B 由第299、300、302 位氨基酸殘基組成[12]。通過對SD-01 株VP2 蛋白的B 細胞抗原表位進行預測可知，這兩個抗原決定簇都位于SD-01 株VP2 蛋白的B 細胞優(yōu)勢表位內(nèi)，且SD-01 株VP2 蛋白的兩個抗原決定簇與疫苗株一致，因此推測疫苗株可以給動物提供針對SD-01 株的有效保護。

FPV、CPV、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）及小鼠細小病毒（mouse parvovirus，MPV）等均屬于細小病毒科、細小病毒屬。根據(jù)遺傳進化分析可知，F(xiàn)PV 與CPV 親緣關系最為接近，與PPV 親緣關系次之，而與其他細小病毒親緣關系較遠。通過比較FPV 及其他細小病毒VP2 的生物信息學差異發(fā)現(xiàn)，不同動物源細小病毒的VP2 蛋白氨基酸序列存在差異，但生理生化性質(zhì)較為相似，均為親水性無跨膜區(qū)的穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)高級結構比較發(fā)現(xiàn)，不同種細小病毒VP2 蛋白均主要由無規(guī)則卷曲組成，α 螺旋及β 折疊所占比重較小，且三級結構高度一致。除氨基酸序列本身，蛋白翻譯后修飾同樣對抗原的免疫原性有著重要作用，通過比對不同細小病毒 VP2 蛋白的重要抗原表位及潛在翻譯后修飾位點，可見不同細小病毒的VP2 蛋白存在部分一致的蛋白翻譯后修飾位點，但抗原表位仍具有明顯差異。比較不同細小病毒VP2 蛋白的生物信息學差異，有利于更好地研究VP2 蛋白在不同細小病毒進化過程中所發(fā)揮的作用，為廣譜的抗細小病毒藥物及分子制劑篩選及研發(fā)奠定基礎。