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      黃枝瑚菌多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究*

      2021-11-10 09:29:22祝佳惠李玉芹唐裕芳陳禧瑤
      關(guān)鍵詞:清除率多糖活性

      周 蓉, 祝佳惠, 李玉芹, 唐裕芳, 陳禧瑤

      (湘潭大學(xué) 化工學(xué)院 生物與食品工程系,湖南 湘潭 411105)

      0 引言

      枝瑚菌屬珊瑚菌科,枝瑚菌屬,子實(shí)體形秀色美、質(zhì)地鮮甜脆爽,富含數(shù)種必需氨基酸、有益碳水化合物和微量元素,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1].中醫(yī)文獻(xiàn)記載其可以和胃現(xiàn)氣、祛風(fēng)、破血緩中[2],近年來(lái)的報(bào)道表明部分枝瑚菌具有抗氧化、降血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫等功能,對(duì)艾氏癌EC和小鼠肉瘤S-l80也有很強(qiáng)抑制作用[3-4].豐富的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值使其成為我國(guó)野生食藥用真菌資源中極其寶貴的組成部分.

      多糖是食藥用真菌發(fā)揮保健和醫(yī)療功能的重要成分,且對(duì)人體毒副作用較小,近年來(lái)成為功能性食品、天然藥物和保健品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),目前更是已將源自香菇、銀耳、靈芝、灰樹花等的多糖應(yīng)用于臨床領(lǐng)域.對(duì)枝瑚菌屬而言,現(xiàn)已有子實(shí)體多糖提取和活性相關(guān)的研究報(bào)道,如蘇鳳賢等[5]優(yōu)化了密枝瑚菌(R.stricta)多糖的提取工藝;王麗娟等[6]發(fā)現(xiàn)紅頂枝瑚菌(R.botrytoides)多糖具有羥基自由基(·OH)清除活性;董明明等[4]證實(shí)萎垂白枝瑚菌(R.flaccida)多糖具有良好的免疫增強(qiáng)功能.然而,黃枝瑚菌(R.flava)作為一類味道鮮美、效用良好的食材及傳統(tǒng)中藥材,在食品和中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,但其子實(shí)體多糖研究較少,提取工藝的研究不夠深入.

      本文以黃枝瑚菌為原料,通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其子實(shí)體多糖的熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化,并考察了優(yōu)化條件下多糖的抗氧化活性,為黃枝瑚菌的功效研究和其多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考.

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      黃枝瑚菌子實(shí)體,河南省南陽(yáng)市南召縣明存山貨店;DPPH、ABTS、還原型輔酶Ⅰ二鈉鹽(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氮藍(lán)四唑(NBT),上海麥克林生化科技有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

      1.2 儀器與設(shè)備

      RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;Agilent Cary 3500型紫外-可見分光光度計(jì);Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀;Netzsch TG209型同步熱重分析儀.

      1.3 方法

      1.3.1 熱水浸提黃枝瑚菌多糖黃枝瑚菌子實(shí)體烘干、粉碎過(guò)篩后,按照所需料液比、浸提溫度和時(shí)間浸提兩次;浸提液合并濃縮后加入4倍體積的無(wú)水乙醇,4 ℃靜置過(guò)夜;離心(8 000 r/min,10 min)收集沉淀并用蒸餾水復(fù)溶,加入25% Sevage試劑(v(三氯甲烷)∶v(異丙醇)=4∶1),重復(fù)數(shù)次后合并收集上層溶液;于4 ℃透析(截留分子量3 500 Da)48 h后,冷凍干燥即得黃枝瑚菌多糖.

      1.3.2 多糖含量測(cè)定將上述透析后的多糖樣品定容后,采用蒽酮-硫酸法[7]測(cè)定溶液在620 nm波長(zhǎng)下的吸光值,根據(jù)同法所得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖得率,計(jì)算公式如下:

      (1)

      式中:C為樣品中多糖濃度,g/mL;V為定容體積,mL;N為稀釋倍數(shù);M為子實(shí)體粉末干重,g.

      1.3.3 提取工藝優(yōu)化

      (1) 單因素試驗(yàn)

      選取料液比、浸提溫度和時(shí)間3個(gè)因素,以多糖得率為考察指標(biāo)按以下條件進(jìn)行單因素試驗(yàn):1) 固定浸提時(shí)間4 h,料液比1∶25,浸提溫度分別為60、70、80、90、100 ℃;2) 固定浸提溫度80 ℃,料液比1∶25,分別浸提1、2、3、4、5 h;3) 固定浸提溫度80 ℃,浸提時(shí)間4 h,料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35.

      (2) 響應(yīng)面試驗(yàn)

      根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理以浸提溫度X1、浸提時(shí)間X2和料液比X3為自變量,多糖得率為響應(yīng)值Y,設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)以優(yōu)化多糖浸提工藝.設(shè)計(jì)因素及水平見表1.

      表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

      1.3.4 熱重分析將多糖置于氧化鋁坩堝中,在氮?dú)獗Wo(hù)下以10 ℃/min的升溫速率利用同步熱重分析儀評(píng)估多糖在30~800 ℃間的質(zhì)量變化.

      1.3.5 傅里葉紅外光譜分析取2 mg多糖粉末與干燥KBr混合并壓片,在4 000~500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描.

      1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

      (1) DPPH·清除能力

      將不同濃度的多糖溶液與DPPH-甲醇溶液等體積混合均勻,黑暗靜置30 min后測(cè)定OD517值.以L-抗壞血酸(Vc)為陽(yáng)性對(duì)照.

      (2) ABTS+·清除能力

      7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合后黑暗靜置12 h后制成ABTS+·工作液,將工作液與多糖溶液以體積比4∶1混合,避光靜置5 min后測(cè)定其OD734值.以Vc為陽(yáng)性對(duì)照.

      (3) O2-·清除能力

      (3)

      向700 μL多糖溶液中依次加入78 μmol/L NADH溶液、50 μmol/L NBT溶液和10 μmol/L PMS溶液各100 μL,混勻后測(cè)定OD560值.以沒食子酸為陽(yáng)性對(duì)照.

      多糖的自由基清除率根據(jù)式(2)計(jì)算.其中Ax為實(shí)驗(yàn)組吸光值,Ax0為陰性對(duì)照組吸光值(無(wú)自由基),A0為空白組吸光值(無(wú)樣品).

      (2)

      1.4 數(shù)據(jù)分析

      所有試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)來(lái)表示,數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性評(píng)價(jià),其中響應(yīng)面試驗(yàn)利用Design Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與方差分析.

      2 結(jié)果與分析

      2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

      浸提時(shí)間對(duì)多糖得率影響的結(jié)果見圖1(a):浸提時(shí)間從1 h逐漸增加到4 h,多糖得率顯著升高,在4 h時(shí)達(dá)到最大值11.49 mg/g,提升了120.96%,主要是由于浸提時(shí)間增加促使多糖在浸提液中充分溶解;但繼續(xù)增加浸提時(shí)間至5 h,多糖得率下降1.92 mg/g,其原因是浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起多糖的降解,產(chǎn)生部分小分子糖類,不利于在醇沉過(guò)程中回收[8].因此適宜的浸提時(shí)間為4 h.

      圖1 浸提條件對(duì)黃枝瑚菌多糖得率的影響:(a) 浸提時(shí)間的影響;(b)浸提溫度的影響;(c)料液比的影響Fig.1 Effects of extraction conditions on the yield of polysaccharides from R. flava:(a) Effect of extraction time; (b) effect of extraction temperature;(c) effeet of solid liquid ratio

      由圖1(b)可知,浸提溫度由60 ℃升高到90 ℃,分子運(yùn)動(dòng)速度加快,利于多糖從細(xì)胞中溶出,得率逐漸升高,整體提升76.39%.繼續(xù)升溫至100 ℃,得率略有下降,其原因是隨著溫度的升高,多糖降解速率增加,最終表現(xiàn)為多糖的宏觀溶出速率減少、得率降低[9].又因較高浸提溫度會(huì)帶來(lái)較大能耗,因此浸提溫度的優(yōu)化范圍選擇70~90 ℃.

      多糖得率在料液比1∶15~1∶30(g/mL)范圍內(nèi)隨溶劑比例的增加而升高,1∶30之后趨于平緩(圖1(c)).當(dāng)料液比低于1∶30時(shí),溶劑比例增大使物料與提取液接觸愈加充分,多糖溶解率逐漸增加,得率顯著升高,最高為9.86 mg/g;但在多糖已充分溶出后繼續(xù)增大料液比,浸提液中多糖不再繼續(xù)增加,得率(9.87 mg/g,P>0.05)基本保持不變.而水量過(guò)多會(huì)增加濃縮成本,所以確定1∶30為適宜料液比水平.

      2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

      2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取浸提溫度(70~90 ℃)、浸提時(shí)間(3~5 h)、料液比(1∶25~1∶35)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,共17組試驗(yàn),多糖得率為6.13~19.19 mg/g.

      表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

      2.2.2 回歸模型有效性及顯著性分析對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,可得如下多糖得率Y對(duì)浸提溫度X1、浸提時(shí)間X2和料液比X3的多項(xiàng)回歸方程:

      Y=0.015+3.358×10-3X1+1.884×10-3X2+5.050×10-4X3-1.135×10-3X1X2

      -1.230×10-3X1X3+1.172×10-3X2X3-1.798×10-3X12+8.954×10-4X22

      -5.293×10-4X32.

      對(duì)該模型進(jìn)行方差和顯著性分析(表3)可知,回歸模型的P=0.0031<0.01,極顯著,失擬項(xiàng)P=0.24>0.05,不顯著,說(shuō)明模型顯著可靠.決定系數(shù)R2為0.8971,說(shuō)明有89.71%的試驗(yàn)組結(jié)果落在樣本的回歸曲線上,模型與實(shí)際情況擬合較好,變異系數(shù)CV值為0.37%,表明變異程度較小,可信度高.同時(shí)表3顯示:一次項(xiàng)X1、X2極顯著(P<0.01),且X1的F值較大,說(shuō)明浸提溫度對(duì)多糖得率的影響更顯著;二次項(xiàng)X12的P<0.05,表明各因素對(duì)多糖得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系;但交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均不顯著,又說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值影響的交互作用較弱.

      2.2.3 響應(yīng)曲面分析響應(yīng)曲面和等高線圖是將回歸方程任一因素固定在0水平后的圖形表達(dá)形式.響應(yīng)曲面中曲線越陡峭說(shuō)明該因素對(duì)得率的影響越大.圖2顯示,曲線的陡峭程度最高為浸提溫度,最低為料液比,說(shuō)明各因素對(duì)多糖得率的影響程度為浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比;另外,等高線圖的形狀越接近橢圓形說(shuō)明兩變量間交互作用越強(qiáng),越接近圓形越弱,而圖2所示的等高線圖雖然都接近橢圓形,但弧度較緩,說(shuō)明各因素間存在一定的交互作用但程度較弱,與表3結(jié)果一致.

      圖2 各因素交互作用對(duì)黃枝瑚菌多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線:(a) 浸提溫度-料液比的影響; (b)浸提溫度-浸提時(shí)間的影響;(c) 浸提時(shí)間-料液比的影響Fig.2 Response surface and contourlines of effects of various interactive factors on polysaccharide yield from R. flava: (a) Effect of extraction temperature-solid liquid ratio;(b) effect of extraction temperature-extraction time; (c) effect of extraction time-solid liquid ratio

      2.2.4 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證通過(guò)Design Expert V8.0.6軟件分析,預(yù)測(cè)多糖最佳浸提條件為料液比(1∶34) g/mL,83 ℃下浸提5 h,該條件下多糖理論得率為19.26 mg/g.實(shí)際得率為(19.21±0.15) mg/g,與理論值僅相差0.05 mg/g,說(shuō)明該優(yōu)化方案可行.

      2.3 熱重分析

      圖3所示的熱重(TG)和微商熱重(DTG)曲線表征了多糖的溫度敏感性,其中有2次明顯的質(zhì)量損失:第一次是由于水分蒸發(fā),多糖在30~100 ℃質(zhì)量損失8.77%,該結(jié)果暗示該多糖具有一定持水力,可應(yīng)用于酸乳和面制品中,以減少乳清析出,應(yīng)對(duì)面制品口感不佳、失水等問題[10];由于多糖熱分解,217~800 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)第二次質(zhì)量損失(84.11%),并于308.67 ℃時(shí)達(dá)到最快熱分解速率.而在100~217 ℃范圍內(nèi)多糖質(zhì)量保持穩(wěn)定,表明一定程度的熱處理不會(huì)引起多糖的熱分解,其可應(yīng)用于需要一定高溫處理的領(lǐng)域,如需巴氏殺菌的食品及藥品.

      圖3 黃枝瑚菌多糖TG和DTG曲線Fig.3 TG and DTG curves of polysaccharides from R. flava

      2.4 紅外光譜分析

      黃枝瑚菌多糖的紅外圖譜如圖4所示:3 440 cm-1和2 931 cm-1波數(shù)附近出現(xiàn)的強(qiáng)O—H和強(qiáng)C—H伸縮振動(dòng)吸收峰,是典型的多糖特征吸收[11].1 540、1 250 cm-1附近為酰胺Ⅱ、Ⅰ的酰胺鍵彎曲振動(dòng)吸收峰,說(shuō)明多糖中可能含有蛋白質(zhì)[12].1 070 cm-1附近是C—O—C糖化鍵振動(dòng)和C—O—H拉伸振動(dòng)重疊的吡喃糖環(huán)振動(dòng)[13].1 650 cm-1和914 cm-1附近為C=O的伸縮振動(dòng)和二聚體羧酸O—H基面外變角振動(dòng)[14],兩者表明多糖中含有糖醛酸.

      圖4 黃枝瑚菌多糖的紅外圖譜Fig.4 FTIR of polysaccharides from R. flava

      2.5 黃枝瑚菌多糖的抗氧化活性

      2.5.1 對(duì)DPPH·的清除能力圖5(a)顯示,多糖對(duì)DPPH·的清除活性隨樣品濃度的升高而增大,125~500 μg/mL范圍內(nèi),清除率增長(zhǎng)59.05%;500 ~1 000 μg/mL時(shí),清除率僅增長(zhǎng)4.35%,但均在90%以上;當(dāng)濃度為1 000 μg/mL,達(dá)到最高清除率96.33%,基本與陽(yáng)性對(duì)照Vc持平,但明顯高于同濃度的葡萄色頂枝瑚菌和紅頂枝瑚菌子實(shí)體多糖對(duì)DPPH·的清除能力(約10%)[15-16].

      圖5 黃枝瑚菌多糖的抗氧化活性:(a) DPPH·清除作用;(b)ABTS+·清除作用;(c)O2-·清除作用Fig.5 Antioxidant activities of polysaccharides from R. flava:The scavenging effect of DPPH·(a);ABTS+·(b);O2-·(c)

      2.5.2 對(duì)ABTS+·的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,其對(duì)ABTS+·的清除率也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),250 μg/mL后趨于平穩(wěn)(圖5(b)).在測(cè)試濃度范圍內(nèi),清除率為55.04%~99.25%,最高活性基本與陽(yáng)性對(duì)照持平,遠(yuǎn)高于紅頂枝瑚菌多糖RBP-Ⅰ的清除率(10 mg/mL,15.71%)[16].

      2.5.3 對(duì)O2-·的清除能力圖5(c)顯示多糖對(duì)O2-·的清除能力呈劑量依賴性.在測(cè)試范圍內(nèi),清除率最高值為92.74%,其半抑制濃度(IC50)為232.08 μg/mL.可能由于83 ℃浸提5 h比沸水浸提2 h對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響小,本文枝瑚菌多糖對(duì)O2-·的清除能力優(yōu)于何榮軍等[17]從珊瑚菌中分離的多糖RFPF2A(IC50=2.5 mg/mL).

      3 結(jié) 論

      在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn),確定了黃枝瑚菌多糖的最佳熱水浸提工藝條件:浸提溫度83 ℃,浸提時(shí)間5 h,料液比(1∶34) g/mL,得率達(dá)19.21 mg/g,且其中浸提溫度為主要影響因素.同時(shí),熱重分析結(jié)果顯示該多糖能耐受一定程度的高溫,可應(yīng)用于需要熱處理的食品和藥品領(lǐng)域.此提取方法簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、對(duì)多糖結(jié)構(gòu)影響小,可為其工業(yè)化提取提供理論與技術(shù)支撐.此外,該多糖具有明顯的多糖特征吸收峰,主要由吡喃糖構(gòu)成,可能含有少量蛋白質(zhì)和糖醛酸,且表現(xiàn)出較好的DPPH·、ABTS+·和 O2-·清除活性,具有作為天然抗氧化劑的潛力.本研究為黃枝瑚菌多糖在醫(yī)藥和功能性食品領(lǐng)域的綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù).

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