抑制饅頭中腐敗霉菌活性乳酸菌的篩選及其應(yīng)用

王慶宇，李 嘯，*，宋宜兵，胡新平，劉玲彥，談亞麗，王帥靜，程 奔

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 中國輕工業(yè)酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000；3.湖北安琪生物集團(tuán)有限公司，湖北 宜昌 443000）

饅頭是以小麥粉和水為原料，以酵母菌為主要發(fā)酵劑揉成面團(tuán)，經(jīng)發(fā)酵、定型、醒發(fā)后蒸制而成的食品[1]。饅頭作為我國的傳統(tǒng)主食，在人們的飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要地位，隨著人民生活節(jié)奏的加快，主食工業(yè)化必將成為未來的發(fā)展趨勢，饅頭的工業(yè)化生產(chǎn)將是其中重要的組成部分[2-4]。但因饅頭營養(yǎng)豐富，含水量較高，儲(chǔ)存期間很容易受到細(xì)菌和霉菌的作用而腐敗，貨架期極短等因素都制約著饅頭工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展步伐[5-6]。化學(xué)防腐劑作為一種能夠抑制食品中微生物生長而延長食品保質(zhì)期的物質(zhì)，在食品行業(yè)已被廣泛使用，但其濫用和過量使用對(duì)人類健康造成的危害問題也逐漸受到消費(fèi)者的關(guān)注[7]。隨著人們對(duì)食品安全和品質(zhì)要求的提高，綠色安全無毒副作用的生物防腐劑逐漸成為研究熱點(diǎn)，生物防腐劑憑借其抗菌活性強(qiáng)、安全無毒、熱穩(wěn)定性好、抑菌譜廣等特點(diǎn)正逐步展現(xiàn)出替代化學(xué)防腐劑的趨勢[8]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱[9]。乳酸菌安全無毒，無致病性和致癌性，在世界范圍內(nèi)被公認(rèn)為安全等級(jí)“一般認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）”的食品微生物[10]。乳酸菌作為益生菌，在食品工業(yè)的生物防腐領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用價(jià)值，PLESSAS S等[11]采用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）以及兩者的混合菌分別發(fā)酵酸面團(tuán)制作面包，發(fā)現(xiàn)混合菌發(fā)酵的酸度更高且制作出的面包比其他面包的保質(zhì)期更長；錢洋[12]測試了3株乳酸菌發(fā)酵液對(duì)面包儲(chǔ)藏期限的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，噴灑了發(fā)酵液的面包的儲(chǔ)藏期限均得到相應(yīng)的延長。

本研究從發(fā)霉饅頭中分離主要腐敗霉菌，并通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。以分離得到的腐敗霉菌為指示菌，從實(shí)驗(yàn)室保藏的食品級(jí)乳酸菌中篩選對(duì)腐敗霉菌具有較強(qiáng)抑制活性的菌株，通過對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行過氧化氫酶、蛋白酶、不同溫度及pH處理，初步分析上清液中抑菌物質(zhì)的特性。最后將該菌株發(fā)酵制備的酸面團(tuán)用于饅頭的防霉應(yīng)用中，并與添加量為0.5 g/kg（以脫氫乙酸計(jì)）的脫氫乙酸鈉的防霉效果作對(duì)比，為饅頭工業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)綠色安全的生物防腐劑奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

饅頭：儲(chǔ)存6 d后發(fā)霉的饅頭；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP-1、LP-2、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LR-1、LR-2、LR-3、副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC-1、LC-2、LC-3：由安琪酵母菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基、MRS固體和MRS肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 試劑

過氧化氫酶（5 000 U/mg）、蛋白酶K（40 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；乳酸、氫氧化鈉（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；脫氫乙酸鈉（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司；BHC-1300IIA型生物潔凈安全柜：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FE22 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250BSH-II生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；XCS-HJSG-3恒溫?cái)嚢枞?lián)水浴鍋：陜西鑫昌實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 饅頭中腐敗霉菌的分離與鑒定

無菌操作下稱取5 g發(fā)霉饅頭碎屑于裝有45 mL無菌水的試管中，振蕩混勻，再吸取1 mL混勻液體加入9 mL無菌水中，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取100 μL稀釋液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察各菌落的形態(tài)，選取兩株形態(tài)數(shù)量最多的菌落做進(jìn)一步分離純化，純化后的菌落參考《真菌鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并委托北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行真菌18S rDNA測序。將測得的序列結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的18S rDNA基因序列，使用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14-15]。

1.3.2 霉菌孢子懸液的制備

將純化后的霉菌接種在PDA斜面上，30 ℃條件下培養(yǎng)7 d至霉菌產(chǎn)生大量孢子，加入30 mL無菌生理鹽水于斜面培養(yǎng)瓶中，充分振蕩后的清洗液經(jīng)無菌紗布過濾除去菌絲，獲得孢子懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[16]。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備

將甘油管冷凍保藏的乳酸菌解凍后，吸取100 μL接種于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)壯，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。復(fù)壯后再以5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行活化，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h?；罨蟮娜樗峋?%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心15 min后，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌即得到乳酸菌發(fā)酵上清液[17]。

1.3.4 乳酸菌抑菌活性的測定

（1）乳酸菌菌株抑菌活性的測定

將活化后的乳酸菌菌株在MRS固體培養(yǎng)基中于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。將孢子懸液（孢子濃度為3.6×107～5.2×107CFU/mL）以1%（V/V）的接種量接入冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，取5 mL含有霉菌孢子懸液的PDA培養(yǎng)基傾倒在上層，待其凝固后，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)乳酸菌周圍抑菌圈直徑的大小評(píng)價(jià)抑菌效果[18]。

（2）乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的測定

發(fā)酵上清液抑菌活性的測定參考胡誠等[19]的微量孔板法并稍作修改：在每個(gè)孔中依次加入100 μL乳酸菌發(fā)酵上清液、200 μLPDB培養(yǎng)基和50 μL霉菌孢子懸液，以100 μL的MRS肉湯培養(yǎng)基替代乳酸菌發(fā)酵上清液作為對(duì)照組。將孔板置于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，使用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀在波長580 nm處測定吸光度值（OD580nm值），并計(jì)算抑菌率，其計(jì)算公式如下：

1.3.5 乳酸菌生長特性的分析

活化后的乳酸菌，按5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，混合均勻后取300 μL加入到微孔板的孔中，37 ℃條件下培養(yǎng)，每30 min取樣測定吸光度值（OD600nm值），另外每隔4 h取樣測定乳酸菌發(fā)酵液的pH值，測得數(shù)據(jù)用于乳酸菌生長曲線及發(fā)酵液pH變化曲線的繪制。

1.3.6 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株LP-1發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

溫度、酶及pH值對(duì)菌株LP-1發(fā)酵上清液抑菌活性的影響：取5 mL菌株LP-1發(fā)酵上清液分別在-20 ℃、4 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃條件下保持30 min[20]；取10 mL菌株LP-1發(fā)酵上清液分別加入1 mg/mL過氧化氫酶（pH 7.3）、胰蛋白酶（pH 8.1）和蛋白酶K（pH 7.0），37 ℃水浴2 h后，100 ℃水浴滅酶3 min，將pH調(diào)回發(fā)酵上清液的初始值[21-22]；使用1 mol/L乳酸和1 mol/L NaOH溶液分別將菌株LP-1發(fā)酵上清液的pH值調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7和8[23]；以未處理的乳酸菌發(fā)酵上清液作為對(duì)照組，采用微量孔板法測定各實(shí)驗(yàn)組的抑菌率。

1.3.7 乳酸菌在饅頭防霉中的應(yīng)用

將活化后的乳酸菌按5%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，離心棄上清液，獲得的菌體經(jīng)無菌水清洗兩次后備用。按菌體、面粉、水質(zhì)量比為0.01∶1.00∶1.00的配比混合均勻，密封置于37 ℃醒發(fā)箱發(fā)酵12 h即獲得酸面團(tuán)。按表1的4種配方分別制作饅頭[24]，蒸制好的饅頭用自封袋包裝后儲(chǔ)存于37 ℃醒發(fā)箱中，分別測定和記錄面團(tuán)的pH值、蒸制后饅頭的pH值以及饅頭儲(chǔ)存過程出現(xiàn)明顯可見霉斑的時(shí)間點(diǎn)。

表1 饅頭的制作配方Table 1 Formulations for making Mantou

2 結(jié)果與分析

2.1 饅頭中腐敗霉菌的分離與鑒定

從發(fā)霉的饅頭中共分離純化出2株主要的腐敗霉菌，分別編號(hào)為A1、A2，其菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 腐敗霉菌A1（a）及A2（b）的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of colonies and cells of spoilage molds A1(a)and A2(b)

由圖1可知，菌株A1的菌落呈綠色或青綠色，邊緣有白色絨毛且菌落中心有突起，分生孢子梗頂生排列成帚狀的間枝，分生孢子呈鏈狀排列，球形至卵圓形。菌株A2的菌落初呈黃色后漸變?yōu)辄S綠色，成熟后顏色變暗，分生孢子梗粗壯無分枝頂囊，分生孢子呈球形或近球形。

采用分子生物技術(shù)對(duì)2株腐敗霉菌進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，菌株A1與Penicillium expansum聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株A2與Aspergillus flavus聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察，鑒定菌株A1、A2分別為擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、黃曲霉（Aspergillus flavus），此結(jié)果與文獻(xiàn)[25]中報(bào)道的相一致。

圖2 基于18S rDNA基因序列腐敗霉菌A1、A2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of spoilage molds A1 and A2 based on 18S rDNA gene sequences

2.2 不同乳酸菌抑菌效果評(píng)價(jià)

由表2可知，供試乳酸菌對(duì)兩株霉菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用，其中，植物乳桿菌LP-1對(duì)兩種霉菌的抑制效果都較為突出，故確定該菌株為優(yōu)良菌株。

表2 不同乳酸菌對(duì)霉菌的抑菌活性比較Table 2 Comparison of antimicrobial activities of different lactic acid bacteria against molds

2.3 植物乳桿菌LP-1生長曲線及發(fā)酵液pH變化曲線

為了解植物乳桿菌LP-1的生長以及產(chǎn)酸情況，測定該菌株的生長曲線以及生長過程中發(fā)酵液的pH變化，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在發(fā)酵0～4 h內(nèi)，植物乳桿菌LP-1的生物量變化緩慢為延滯期；發(fā)酵4～14 h內(nèi)，其生物量迅速增長，為對(duì)數(shù)生長期；發(fā)酵14 h后生物量基本維持不變進(jìn)入穩(wěn)定生長期。植物乳桿菌LP-1發(fā)酵液的pH值在0～8 h內(nèi)由6.16迅速降低至4.25，8～12 h由4.25緩慢降至3.98，12 h后基本維持不變并最終降至3.87。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用該菌發(fā)酵制備酸面團(tuán)時(shí)，以發(fā)酵12 h為發(fā)酵終點(diǎn)。

圖3 植物乳桿菌LP-1的生長曲線及發(fā)酵液pH變化曲線Fig.3 Growth curve of Lactobacillus plantarum LP-1 and pH change curve of fermentation broth

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

溫度、酶、pH值對(duì)植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液抑菌率的影響見圖4。

由圖4a可知，植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液經(jīng)過不同溫度處理后，對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉的抑菌率與室溫條件（約25 ℃）下未處理的發(fā)酵上清液相比均無明顯差異，說明發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對(duì)溫度處理不敏感，在溫度-20～121 ℃的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

由圖4b可知，發(fā)酵上清液經(jīng)過過氧化氫酶、蛋白酶K以及胰蛋白酶處理后對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率分別為75.46%、77.99%和76.04%，與未處理的原液抑菌率（81.67%）相比略有下降；對(duì)黃曲霉的抑菌率分別為72.52%、73.85%和74.23%，與未處理的原液抑菌率（73.75%）相比無明顯差異，表明植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)并不是過氧化氫或蛋白類細(xì)菌素起主要的抑菌活性，可能是乳酸菌產(chǎn)生的其他代謝產(chǎn)物發(fā)揮主要抑菌活性作用。

圖4 溫度（a）、酶（b）及pH（c）對(duì)植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液抑菌率的影響Fig.4 Effects of temperature (a),enzyme (b) and pH (c) on the inhibition rate of Lactobacillus plantarum LP-1 fermentation supernatant

由圖4c可知，不同pH對(duì)植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液的抑菌率影響較大，當(dāng)pH為3和4時(shí)，發(fā)酵上清液對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉的抑制作用與原液相比未見明顯改變；當(dāng)pH值≥5時(shí)，植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉的抑制作用均明顯降低；pH值為6時(shí)發(fā)酵上清液對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉的抑制作用最低，分析推測發(fā)酵上清液中起主要抑菌作用的物質(zhì)為乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸類代謝產(chǎn)物。

2.5 植物乳桿菌LP-1在饅頭防腐中的應(yīng)用

采用4種配方制作饅頭時(shí)，面團(tuán)的pH值、饅頭的pH值以及饅頭在儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)明顯可見霉斑的時(shí)間點(diǎn)見表3，各實(shí)驗(yàn)組饅頭儲(chǔ)存6 d后的霉變情況見圖5。

表3 4種配方制作饅頭時(shí)面團(tuán)的pH、饅頭的pH及霉斑出現(xiàn)時(shí)間Table 3 pH of dough and Mantou and the appearance time of mildew spots in the Mantou-making with 4 formulas

圖5 4種配方制作的饅頭儲(chǔ)存6 d后的霉變情況Fig.5 Mildew of Mantou made with 4 kinds of formula after storage for 6 d

由表3可知，1#、2#配方制作饅頭時(shí)，面團(tuán)的pH值（4.09、4.31）和饅頭的pH值（4.03、4.39）均明顯低于3#、4#配方，2#、3#配方制作出的饅頭在第2天表面出現(xiàn)了可見霉斑，1#、4#配方制作出的饅頭在第4天表面出現(xiàn)了可見霉斑，表明40%酸面團(tuán)添加量制作出的饅頭的防霉效期與0.5 g/kg脫氫乙酸鈉添加量（以脫氫乙酸計(jì)）的一致，較空白對(duì)照組（3#配方）相比延長了2 d。2#、3#配方制作的饅頭儲(chǔ)存6 d后表面發(fā)粘，由圖5可知，2#、3#配方制作的饅頭儲(chǔ)存6 d后饅頭的腐敗程度及表面霉菌的菌落大小均明顯高于1#、4#配方制作的饅頭。

3 結(jié)論

本研究采用稀釋涂布平板法從發(fā)霉饅頭中分離得到2株主要腐敗霉菌，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定分別為擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）和黃曲霉（Aspergillus flavus），以其作為指示菌，從實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌中篩選得到一株抑霉菌活性優(yōu)良的植物乳桿菌LP-1。植物乳桿菌LP-1發(fā)酵上清液在溫度-20～121 ℃范圍內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性，且對(duì)蛋白酶和過氧化氫酶處理均不敏感，在pH為3～4的酸性條件下抑菌物質(zhì)能展現(xiàn)出較好的抑菌性能，pH≥5時(shí)抑菌活性顯著降低，分析推測發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)為乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸類代謝產(chǎn)物。植物乳桿菌LP-1發(fā)酵制得的酸面團(tuán)用于饅頭的制作，37 ℃密封儲(chǔ)存，40%酸面團(tuán)添加量配方制作的饅頭在第4天表面出現(xiàn)可見霉斑，較空白對(duì)照組延長2 d，其防霉效果與0.5 g/kg脫氫乙酸鈉添加量相當(dāng)，表現(xiàn)出較好的生物防腐性能，為饅頭工業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)綠色安全生物防腐劑奠定研究基礎(chǔ)。