貴州泡菜中潤(rùn)腸通便功能乳酸菌的篩選及其特性研究

孫 盛，陳作國(guó)，俞赟霞，余騰斐，李言郡，曲冬梅，陳 蘇

（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司 浙江省食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

泡菜在我國(guó)已有3 000多年的歷史，以清脆、開(kāi)胃、爽口著稱(chēng)[1-2]。泡菜是以新鮮的蔬菜為主要原料，在酵母和乳酸菌等的作用下通過(guò)厭氧發(fā)酵而成的一種發(fā)酵食品[3]，具有解膩開(kāi)胃、助消化、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、抗氧化、抑菌、控制體質(zhì)量、抗動(dòng)脈粥樣化等功效[4-5]。乳酸菌主導(dǎo)著泡菜的發(fā)酵過(guò)程，在泡菜發(fā)酵的過(guò)程中起著重要作用，乳酸菌在發(fā)酵的各個(gè)階段種類(lèi)和數(shù)量的多少直接關(guān)系到泡菜的品質(zhì)和風(fēng)味[1，3]。

便秘是一個(gè)最為普遍的腸道疾病，全球約有16%的人群被功能性便秘困擾[6]，研究表明便秘是結(jié)腸癌、腸應(yīng)激綜合癥和其他胃腸道疾病發(fā)生的危險(xiǎn)信號(hào)[7]。有效地藥物療法包括膨脹劑、滲透性瀉藥、刺激性瀉藥、糞便軟化劑等[8]，但據(jù)報(bào)道這種療法有幾個(gè)嚴(yán)重的副作用，如腹瀉、結(jié)腸黑變病、心律失常、腹部絞痛、冠心病動(dòng)脈收縮、甚至心肌梗塞[7]。因此，需要找到一個(gè)更加安全、有效的治療便秘方法。在腸道中乳酸菌通過(guò)代謝產(chǎn)酸，能夠抑制有害菌在腸內(nèi)的繁殖，維持腸道生態(tài)平衡，提高腸道機(jī)能，促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)，增加糞便含水量，起到潤(rùn)腸通便的作用[9]。LI C等[7]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NCU116能夠顯著提高小鼠糞便含水率，加快腸道蠕動(dòng)，提高短鏈脂肪酸的含量，改善小鼠便秘，具有潤(rùn)腸通便功能。WANG L L等[10]研究發(fā)現(xiàn)，青春雙岐桿菌（Bifidobacterium adolescentis）通過(guò)在腸道內(nèi)定植影響腸道微生物群體結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善小鼠便秘，具有潤(rùn)腸通便的效果。QIAN Y等[11]研究報(bào)道一株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）Lee能夠預(yù)防和改善小鼠便秘。彭芝榕等[12]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）F1208給藥7 d后顯著提高便秘大鼠采食量、飲水量，促進(jìn)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育，增加排便粒數(shù)和糞便含水量，顯著提高便秘大鼠小腸碳墨汁推進(jìn)率，能夠改善便秘大鼠胃腸道功能。周曉丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）LC-01能夠縮短便秘小鼠首次排便時(shí)間，顯著增加小鼠排便粒數(shù)和質(zhì)量，提高糞便水分含量，顯著增加便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率，具有良好的潤(rùn)腸通便功能，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)菌株LC01在腸道內(nèi)具有較好的生存能力[14]。此外，乳酸菌還具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力等功效[15]，因此，乳酸菌隨泡菜一起進(jìn)入人體，能夠在人體內(nèi)發(fā)揮重要的益生作用。

該研究將乳酸菌的產(chǎn)酸能力作為初篩指標(biāo)，采用稀釋涂布平板法從貴州泡菜中分離鑒定乳酸菌，并使用復(fù)方地芬諾酯建立小鼠便秘模型，以麻仁丸作為陽(yáng)性藥物，以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC-01作為陽(yáng)性對(duì)照菌，篩選出具有潤(rùn)腸通便功能的乳酸菌，同時(shí)比較了優(yōu)選菌株與菌株LC-01的耐受性和黏附性，為開(kāi)發(fā)安全、有效的便秘預(yù)防和治療菌株提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴州泡菜樣品：采自貴州黔東南苗族侗族自治州（編號(hào)為20GZ1～20GZ11）和黔南布依族苗族自治州（編號(hào)為20GZ12～20GZ23）地區(qū)少數(shù)民族農(nóng)戶(hù)采用傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵泡菜樣品，詳情見(jiàn)表1。遠(yuǎn)交系美國(guó)癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)小鼠（體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡）：浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC-01：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司菌種資源庫(kù)。

表1 貴州泡菜樣品信息Table 1 Information of samples from Guizhou Paocai

續(xù)表

復(fù)方地芬諾酯（批號(hào)1405021）：常州康普藥業(yè)有限公司；麻仁丸（批號(hào)1402812）：杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司；細(xì)菌/細(xì)胞總脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；MRS培養(yǎng)基：英國(guó)Oxoid公司；活性炭、阿拉伯樹(shù)膠：廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；牛膽鹽（生化試劑）：Sigma-Aldrich（中國(guó)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Baker Type B2 SterilGARD III生物安全柜、DU800紫外分光光度計(jì)：美國(guó)貝克曼公司GX2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、5810 R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Delta 320 pH計(jì)、JA2003N電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DNP-111電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海海向儀器設(shè)備廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏水市英谷硲予華儀器廠；MX-S漩渦振蕩器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋株式會(huì)社；OLYMPUS BX61光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化與鑒定

取泡菜樣品，篩網(wǎng)過(guò)濾后，取1 mL加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，然后10倍梯度稀釋?zhuān)魅?0-1、10-3、10-5稀釋度100 μL分別涂布于固體MRS培養(yǎng)基平板上，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。根據(jù)形態(tài)特征挑選典型菌落，挑取單個(gè)菌落劃線分離2～3次，反復(fù)劃線獲得純菌株，編號(hào)，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。菌株以1%的接種量接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h取樣測(cè)定pH值，判斷該試驗(yàn)菌株的產(chǎn)酸能力。

取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株純培養(yǎng)物，利用天根細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（DNA）提取試劑盒（離心柱型）提取菌體DNA，采用細(xì)菌16S片段通用引物27F（5'-AGTCTCTGATCATGC-3'）和1492R（5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'）進(jìn)行16S rDNA片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 0.5 μL，引物（10 mmol/L）各0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件雙向拼接后，結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的基本局部比對(duì)搜索工具（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析[16]。根據(jù)菌株16S rRNA序列，通過(guò)MEGA5軟件，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.2 菌株潤(rùn)腸通便功能篩選動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

ICR小鼠自購(gòu)入起適應(yīng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分組，共分為9組，每組12只。分組如下：陽(yáng)性藥物對(duì)照組灌胃麻仁丸，灌胃劑量為2 g/kg小鼠體質(zhì)量；乳酸菌組灌胃受試菌株，劑量為1×109CFU/kg小鼠體質(zhì)量，以菌株LC-01為陽(yáng)性對(duì)照菌。對(duì)照組和模型組每天灌胃0.2 mL 0.85%生理鹽水，其他處理組每天灌胃等體積的受試物溶液，各組受試物連續(xù)灌胃7 d。動(dòng)物飼養(yǎng)保持環(huán)境溫度為（21±2）℃，相對(duì)濕度為30%～70%，12 h光照交替，自由攝入小鼠維持飼料和飲水。小鼠在實(shí)驗(yàn)0和7 d各稱(chēng)質(zhì)量1次。

小鼠排便實(shí)驗(yàn)[17]：受試樣品給喂7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。對(duì)照組給喂0.85%生理鹽水，模型組、給藥組給予0.05%復(fù)方地芬諾酯懸液0.3 mL（10 mg/kg小鼠體質(zhì)量），給藥0.5 h后，對(duì)照組和模型組小鼠灌胃墨汁0.2 mL，給藥組給喂含受試樣品的墨汁0.2 mL（墨汁含5%活性炭和10%阿拉伯膠）。灌胃墨汁后，每只小鼠單籠飼養(yǎng)，觀察并記錄每只小鼠首粒排黑便時(shí)間，以及6 h內(nèi)排黑便的粒數(shù)及質(zhì)量。

小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)[17]：受試樣品給喂7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。對(duì)照組給喂0.85%生理鹽水，模型組灌胃給予0.025%復(fù)方地芬諾酯懸液0.3 mL（5 mg/kg小鼠體質(zhì)量），給藥0.5 h后，對(duì)照和模型組給予墨汁灌胃0.2 mL，給藥組給予含受試樣品的墨汁0.2 mL。25 min后立即脫頸椎處死小鼠，打開(kāi)腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門(mén)、下端至回盲腸部的腸管，置于托盤(pán)上，輕輕將小腸拉成直線，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門(mén)至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度”，墨汁推進(jìn)率計(jì)算公式如下：

1.3.3 篩選菌株生物學(xué)特性研究

（1）生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線

篩選菌株以1%的接種量接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，傳至2代后，篩選菌株按1%接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、24 h，取樣測(cè)定pH值，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定樣品的光密度（optical density，OD600nm）值，判斷篩選菌株的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸能力。

（2）耐酸性實(shí)驗(yàn)

篩選菌株以1%的接種量接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，傳至2代后，取適量菌液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入等體積pH值為2.5的MRS液體培養(yǎng)基中，重懸，37 ℃培養(yǎng)，分別取0、1 h、2 h、4 h的菌液用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，以此判斷篩選菌株的耐酸能力[18]。

（3）耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)

篩選菌株以1%的接種量接種到含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，傳至2代后，取適量菌液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入等體積含有0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，重懸，37 ℃培養(yǎng)，分別取0 h、4 h和8 h的菌液用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，以此判斷篩選菌株的膽鹽耐受能力[18]。菌株存活率計(jì)算公式如下：

（4）黏附性實(shí)驗(yàn)

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29復(fù)蘇后傳至第三代，以細(xì)胞懸液濃度為1×106CFU/mL接種于已放置細(xì)胞爬片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。菌株以1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，菌濃度調(diào)到2×108CFU/mL。取1 mL菌液接種于含有HT-29細(xì)胞和細(xì)胞爬片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育結(jié)束后，緩慢吸去培養(yǎng)液，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，無(wú)水甲醇固定8 min。取出細(xì)胞爬片，經(jīng)革蘭氏染色后，用中性樹(shù)脂封片。于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，每個(gè)片子隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，每株菌3個(gè)重復(fù)[19]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定指標(biāo)均表示為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯著性分析采用SPSS17.0軟件中的Duncan's多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行分析，顯著水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化與鑒定

采用稀釋涂布平板法從23個(gè)貴州泡菜樣品中分離得到77株乳白色圓形菌落的乳酸菌疑似菌株，對(duì)其編號(hào)為GZ1～GZ77，經(jīng)革蘭氏染色后，共計(jì)得到革蘭氏陰性菌31株，革蘭氏陽(yáng)性菌46株。根據(jù)菌株在MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸特性，最終挑選出5株產(chǎn)酸強(qiáng)的菌株（編號(hào)為GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54），且都在衛(wèi)生部2010年頒布的《可用于食品的菌種名單》中。

菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54的革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54均為革蘭氏陽(yáng)性菌。

圖1 5株菌的革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of 5 lactic acid bacteria

菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖2 基于16S rRNA序列的5株乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 5 lactic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，菌株GZ9和GZ47被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株GZ15和GZ54被鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌株GZ20被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermenti）。菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54的信息見(jiàn)表2。

表2 受試菌株的信息Table 2 Information of tested strains

2.2 潤(rùn)腸通便功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

為了篩選具有潤(rùn)腸通便功能的乳酸菌，選取遠(yuǎn)交系ICR小鼠，利用復(fù)方地芬諾酯建立便秘模型，并選取麻仁丸為陽(yáng)性藥物對(duì)照，以菌株LC-01作為陽(yáng)性菌株對(duì)照，比較5株乳酸菌（GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54）的潤(rùn)腸通便效果。

2.2.1 小鼠排便實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間小鼠灌胃受試藥物與受試菌株菌懸液均未發(fā)現(xiàn)明顯不適癥狀，無(wú)意外死亡情況。對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，在7 d內(nèi)，與模型組相比，不同處理組小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明灌胃受試劑量的試驗(yàn)藥物與試驗(yàn)菌株菌懸液對(duì)小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表3 小鼠灌胃受試藥物及菌懸液前后體質(zhì)量的變化Table 3 Change of mice body weight before and after intragastric administration with tested drug and bacterial suspension

受試樣品給喂7 d后，進(jìn)行小鼠排便情況測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠的首次排黑便時(shí)間顯著增加，6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量均顯著降低，表明采用復(fù)方地芬諾酯懸液灌胃制造便秘模型造模成功。

表4 灌胃受試藥物及菌懸液對(duì)便秘小鼠排便指標(biāo)的影響Table 4 Effect of intragastric administration with tested drug and bacterial suspension on defecation indexes of constipation mice

由表4可知，藥物組小鼠連續(xù)灌胃7 d麻仁丸溶液，與模型組小鼠相比，6 h排黑便質(zhì)量顯著增加，但首次排黑便時(shí)間和6 h排黑便粒數(shù)與模型組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但優(yōu)于模型組。與模型組小鼠相比，灌胃1×109CFU/kg小鼠體質(zhì)量的菌株GZ9和GZ15菌懸液均可以顯著減少小鼠的首次排黑便時(shí)間（P＜0.01），與菌株LC-01相當(dāng)。灌胃菌株GZ9和GZ15菌懸液的小鼠，其6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量與模型組小鼠相比顯著提高（P＜0.05），且高于菌株LC-01。其中，經(jīng)菌株GZ15菌懸液灌胃處理的小鼠，其首次排黑便時(shí)間、6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量3項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他4株菌和菌株LC-01，說(shuō)明菌株GZ15菌懸液能夠降低便秘小鼠首次排黑便時(shí)間，增加便秘小鼠6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量，潤(rùn)腸通便的效果顯著。

2.2.2 小腸墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間小鼠灌胃受試藥物與受試菌株菌懸液均未發(fā)現(xiàn)明顯不適癥狀，無(wú)意外死亡情況。對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，在7 d內(nèi)，與模型組相比不同處理組小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明灌胃受試劑量的試驗(yàn)藥物與試驗(yàn)菌株菌懸液對(duì)小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表5 小鼠灌胃受試藥物及菌懸液前后體質(zhì)量的變化Table 5 Change of mice body weight before and after intragastric administration with tested drug and bacterial suspension

受試樣品給喂7 d后，進(jìn)行小鼠小腸墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，各處理組小鼠的小腸總長(zhǎng)度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠的墨汁推進(jìn)率顯著降低（P＞0.01），表明采用復(fù)方地芬諾酯懸液灌胃制造便秘模型造模成功。由表6亦可知，與模型組小鼠相比，藥物組小鼠的墨汁推進(jìn)率顯著高于模型組（P＜0.05）；灌胃1×109CFU/kg小鼠體質(zhì)量的菌株GZ15菌懸液小鼠，其墨汁推進(jìn)率顯著高于造模組小鼠（P＜0.05），且優(yōu)于其他4株菌，與菌株LC-01相當(dāng)，說(shuō)明菌株GZ15菌懸液能夠提高便秘小鼠墨汁推進(jìn)率，與小鼠排便實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，潤(rùn)腸通便的功能顯著。

表6 灌胃受試藥物及菌懸液對(duì)便秘小鼠墨汁推進(jìn)率的影響Table 6 Effect of intragastric administration with tested drug and bacterial suspension on the ink propulsion rate of constipation mice

2.3 菌株GZ15生物學(xué)特性研究

2.3.1 菌株GZ15生長(zhǎng)和產(chǎn)酸特性

生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸速率是乳酸菌活力良好的重要特征之一，同時(shí)產(chǎn)酸速率也是篩選優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)[15]。由圖3A可知，菌株GZ15生長(zhǎng)迅速，在接種后4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖3B可知，在接種菌株GZ15后產(chǎn)酸趨于平穩(wěn)，培養(yǎng)16 h時(shí)pH達(dá)3.85±0.07，顯示出較好的產(chǎn)酸能力。

圖3 菌株GZ15的生長(zhǎng)（A）和產(chǎn)酸（B）曲線Fig.3 Growth (A) and acid production (B) curves of strain GZ15

2.3.2 菌株GZ15的酸和膽鹽耐受性

胃液pH根據(jù)飲食的不同，通常在3.0附近波動(dòng)，但飲食酸性食物后pH降至1.5左右，飲食堿性食物pH在4.0～4.5之間[20]，食物在胃中通過(guò)的時(shí)間一般是0～4 h[21]。由表7可知，在pH 2.5的酸性環(huán)境下孵育4 h后，存活率高達(dá)99.40%，活菌數(shù)達(dá)到5.91×108CFU/mL，與對(duì)照菌LC-01相當(dāng)，其存活率為99.05%。在0.3%膽鹽環(huán)境下孵育8 h后，活菌數(shù)存活率高達(dá)98.37%，達(dá)到4.71×107CFU/mL，優(yōu)于對(duì)照菌LC-01，表現(xiàn)出較好的膽鹽耐受性。說(shuō)明菌株GZ15具有較好的酸和膽鹽耐受性，能夠在胃腸道嚴(yán)苛的環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間保持較高活性。

表7 菌株GZ15的酸及膽鹽耐受性Table 7 Acid and bile salt tolerance of strain GZ15

2.3.3 菌株GZ15的黏附性

乳酸菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附作用有助于其在腸道定植、抑制病原菌定植、增強(qiáng)其與腸道細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和提高機(jī)體的免疫力[22]。而目前普遍認(rèn)為乳酸菌黏附性是評(píng)價(jià)其是否具有優(yōu)良特性重要標(biāo)準(zhǔn)，菌株GZ15在人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29表面的黏附性見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株GZ15表現(xiàn)出高黏附能力，每個(gè)細(xì)胞表面可黏附（4.68±0.59）個(gè)，顯著高于菌株LC-01[（3.72±0.14）個(gè)，P＜0.05）]，是菌株LC-01的1.26倍，說(shuō)明菌株GZ15能夠黏附于腸道黏膜細(xì)胞表面，顯示出較高的腸道定植活性。

圖4 菌株LC-01（a）及菌株GZ15（b）對(duì)人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29黏附性Fig.4 Adhesion of strain LC-01 (a) and strain GZ15 (b) to human colorectal adenocarcinoma cell HT-29

3 討論

便秘是由于腸道功能紊亂引起的慢性疾病，主要臨床癥狀有排便困難、排便頻率低、糞便干硬和延長(zhǎng)腸道排空時(shí)間[10]。乳酸菌在胃腸道中扮演著重要角色，影響著宿主健康，補(bǔ)充乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、緩解便秘[7，11-13]。復(fù)方地芬諾酯是一種小鼠便秘模型造模常用藥物，其主要是直接作用于腸道平滑肌，通過(guò)抑制腸黏膜感受器，消除局部腸黏膜蠕動(dòng)反射而使腸道蠕動(dòng)減慢，使腸內(nèi)容物通過(guò)延遲，致使小鼠排便困難，與便秘臨床癥狀相近[13]。麻仁丸作為臨床用于治療便秘的常用藥，其療效確切?？诜嫔軌蛘{(diào)節(jié)腸道菌群平衡，保護(hù)腸道健康，可帶來(lái)顯著的通便效果，近年來(lái)多項(xiàng)研究表明益生菌能夠治療功能性便秘[7，11-13]。副干酪乳桿菌LC-01具有良好的潤(rùn)腸通便功能[13]，并在腸道內(nèi)具有較好的生存能力[14]。本研究采用止瀉劑復(fù)方地芬諾酯建立便秘模型，以麻仁丸作為陽(yáng)性藥物對(duì)照，以副干酪乳桿菌LC-01作為陽(yáng)性對(duì)照菌，發(fā)現(xiàn)在5株菌中干酪乳桿菌GZ15降低復(fù)方地芬諾酯引發(fā)的便秘小鼠首次排黑便時(shí)間最顯著，小鼠6 h排黑便粒數(shù)、排黑便質(zhì)量和小鼠墨汁推進(jìn)率最高，效果與麻仁丸相當(dāng)，優(yōu)于副干酪乳桿菌LC-01。說(shuō)明干酪乳桿菌GZ15具有良好的潤(rùn)腸通便功能。

目前，普遍認(rèn)為優(yōu)良的乳酸菌應(yīng)具備如下條件：對(duì)胃腸道環(huán)境具有高的耐受性；能夠在腸道中定植；具有高的安全性；臨床效果明顯[23]。乳酸菌的黏附性被認(rèn)為是其定植腸道，發(fā)揮益生功能的前提和基礎(chǔ)，而優(yōu)良的乳酸菌還應(yīng)具有良好的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸特性，必須能夠在胃中酸性條件和消化酶條件下存活，其次能夠通過(guò)小腸高濃度膽鹽條件，黏附于腸道細(xì)胞表面，定植在腸道中，競(jìng)爭(zhēng)性排斥病原菌在腸道中的黏附，長(zhǎng)期釋放一些功能性物質(zhì)，如乳酸、短鏈脂肪酸、抗菌肽、維生素和一些功能酶，幫助宿主抵御病原菌、分解食物和提供營(yíng)養(yǎng)[10]。該研究發(fā)現(xiàn)菌株GZ15具有良好的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸特性，能夠在pH 2.5和0.3%膽鹽濃度下保持較高活性，并且對(duì)HT-29細(xì)胞具有高的黏附性，每個(gè)細(xì)胞平均可以黏附（4.68±0.59）個(gè)菌，且顯著高于副干酪乳桿菌LC-01[黏附（3.72±0.14）個(gè)菌]，說(shuō)明GZ15菌株具有良好的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸特性、耐受性和黏附性。

乳酸菌在肉制品、乳制品、植物蛋白飲料和果蔬飲料加工中都扮演著重要角色，能夠提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善食品風(fēng)味、增強(qiáng)食品的保健作用和延長(zhǎng)食品的保存期[24-25]。干酪乳桿菌GZ15不僅具有良好的生長(zhǎng)特性，并且可以在pH 2.0條件下存保持高的活力，同時(shí)具有潤(rùn)腸通便功能，能夠應(yīng)用在多種發(fā)酵食品中。由于干酪乳桿菌GZ15良好的耐酸特性，因此可以在植物基且具有一定潤(rùn)腸通便功能的酸性果蔬汁中發(fā)酵，如蘋(píng)果汁、胡蘿卜汁、獼猴桃汁等，結(jié)合乳酸菌和植物果蔬汁的特性，可以開(kāi)發(fā)一款富含果蔬汁，且能夠預(yù)防便秘的功能性發(fā)酵食品。

4 結(jié)論

該研究從貴州泡菜樣品中分離、篩選、鑒定乳酸菌，并采用止瀉劑復(fù)方地芬諾酯建立便秘模型，通過(guò)小鼠首次排黑便時(shí)間、6 h排黑便粒數(shù)和排黑便質(zhì)量、小鼠墨汁推進(jìn)率等指標(biāo)篩選具有潤(rùn)腸通便功能的乳酸菌，并對(duì)優(yōu)選菌株的耐受性和黏附性進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，從貴州泡菜中分離鑒定出產(chǎn)酸能力強(qiáng)的革蘭氏陽(yáng)性乳酸菌5株，其中菌株GZ9和GZ47被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株GZ15和GZ54被鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌株GZ20被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermenti）。通過(guò)對(duì)5株菌潤(rùn)腸通便功能篩選，發(fā)現(xiàn)菌株GZ15給藥7 d后，便秘小鼠首次排便時(shí)間最短，6 h排便粒數(shù)、質(zhì)量和小腸墨汁推進(jìn)率最高。對(duì)菌株GZ15進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其具有優(yōu)良的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸特性，能在高pH和膽鹽濃度下保持較高活性，且黏附性高?？蓱?yīng)用于發(fā)酵功能食品中，預(yù)防和治療便秘。