電化學(xué)法檢測(cè)氯酚類化合物對(duì)V79細(xì)胞的HGPRT基因突變①

劉繼光， 宋 佳， 李秋萍， 趙志宇， 胡建新

(佳木斯大學(xué)1.口腔醫(yī)學(xué)院，2.藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

氯酚類化合物大多數(shù)具有致畸、致癌以及致突變性，其中2,4-二氯酚(DCP)和2,4,6-三氯酚(TCP)因毒性較高一直被美國(guó)環(huán)保局列入優(yōu)先控制污染物名單[1]。近來(lái)科學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，很多氯酚類化合物對(duì)人類的各種危害中，尤以遺傳性疾病和癌癥備受關(guān)注。目前，國(guó)際上用于評(píng)價(jià)致突因素的常用方法為哺乳動(dòng)物細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)，該試驗(yàn)主要以V79細(xì)胞為模型細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中HGPRT基因位點(diǎn)的突變確定受試物的致突性[2]。然而此方法存在周期長(zhǎng)，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等缺點(diǎn)。近年來(lái)，新興起的細(xì)胞電化學(xué)是電化學(xué)原理、實(shí)驗(yàn)方法與細(xì)胞、分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一個(gè)新的前沿領(lǐng)域，它通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)具有電活性物質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)，反映各種生命過(guò)程[3-5]。采用電化學(xué)方法研究了DCP與TCP致V79細(xì)胞HGPRT基因突變的電化學(xué)信號(hào)變化特征，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)電化學(xué)新方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1V79細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)，多壁碳納米管購(gòu)于深圳納米港有限公司，胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，2,4,6-三氯酚和2,4-二氯酚購(gòu)于百靈威科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 V79細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

V79細(xì)胞培養(yǎng)在5 %濃度CO2，溫度37 ℃，100 %飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用的培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清、1 %非必需氨基酸、谷氨酰胺和雙抗)。收集V79細(xì)胞后加入適量PH值為7.4的PBS溶液，在水浴恒溫50 ℃加熱裂解30 min后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)[6]。

1.2.2 修飾電極的制備及電化學(xué)檢測(cè)

多壁碳納米管/離子液體修飾玻碳電極制備，將適量離子液體與多壁碳納米管混合物均勻涂于玻碳電極表面，室溫干燥。電化學(xué)檢測(cè)采用電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，以三電極體系進(jìn)行，其中工作電極為多壁碳納米管/離子液體修飾玻碳電極，Ag/AgCl絲為參比電極，Pt絲為輔助電極[7]。

1.2.3 V79細(xì)胞基因突變常規(guī)法檢測(cè)

V79細(xì)胞接觸受試物3 h后繼續(xù)培養(yǎng)8d，然后以每皿2×105個(gè)細(xì)胞接種于100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)；貼壁后，加6-巰鳥嘌呤使藥物濃度達(dá)到5μg·mL-1，培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-10d，加入甲醇進(jìn)行細(xì)胞固定，15 min后進(jìn)行染色，計(jì)算突變率的同時(shí)計(jì)算各培養(yǎng)皿的細(xì)胞集落數(shù)。測(cè)定集落形成率，在另一不加6-巰鳥嘌呤的培養(yǎng)皿中接種200個(gè)細(xì)胞，剩余步驟同上，計(jì)算方法同上(注意：集落數(shù)：聚集細(xì)胞個(gè)數(shù)≥50為一集落)。溶劑對(duì)照組的集落數(shù)為100 %，計(jì)算受試藥物各濃度的相對(duì)集落形成率，結(jié)果即為受試物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。

相對(duì)集落形成率 = 實(shí)驗(yàn)組集落形成率/溶劑對(duì)照組集落形成率

突變率 = 突變集落數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)×集落形成率)

1.2.4 V79細(xì)胞HGPRT基因突變的電化學(xué)檢測(cè)

將V79細(xì)胞分為受試物組、甲磺酸乙酯(EMS)陽(yáng)性對(duì)照組和二甲基亞砜(DMSO)溶劑對(duì)照組。加藥3 h后換DMEM完全培養(yǎng)基，每2d傳代一次，培養(yǎng)9d，電化學(xué)檢測(cè)時(shí)間周期為48 h。

將不同受試物組細(xì)胞加入6-硫鳥嘌呤培養(yǎng)8-10d后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代2次后，消化計(jì)數(shù)，獲得3×106cells·mL-1完全突變V79細(xì)胞，對(duì)同濃度完全突變與未突變細(xì)胞進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)法檢測(cè)氯酚類化合物對(duì)V79細(xì)胞HGPRT基因突變

由表1可知，DMSO溶劑對(duì)照組的突變率為6.2×10-6；EMS陽(yáng)性對(duì)照組的突變率為613×10-6；濃度為400 μmol·L-1的氯酚類化合物DCP、TCP的突變率分別為564×10-6和710×10-6；兩種化合物的突變率與陽(yáng)性對(duì)照組相近為典型的陽(yáng)性反應(yīng)。采用氯酚類化合物DCP和TCP做為受試物，標(biāo)準(zhǔn)致突物EMS為陽(yáng)性對(duì)照組的常規(guī)檢測(cè)法結(jié)果符合體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞(V79/HGPRT)基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果，說(shuō)明氯酚類化合物DCP和TCP可以致哺乳動(dòng)物細(xì)胞HGPRT基因突變。并且常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示同樣400μmol·L-1濃度下氯酚類化合物突變率大小順序?yàn)椋篢CP>DCP。

表1 DCP和TCP對(duì)V79細(xì)胞HGPRT基因位點(diǎn)突變頻率的影響

2.2 雙信號(hào)電化學(xué)法檢測(cè)氯酚類化合物致V79細(xì)胞HGPRT基因突變

采用原位電化學(xué)法檢測(cè)了TCP和DCP對(duì)V79細(xì)胞的致突變作用。由圖1可知，V79細(xì)胞在接觸濃度為400 μmol·L-1的氯酚類化合物TCP和DCP后，自表達(dá)第三天開始，其電化學(xué)信號(hào)峰的峰高明顯高于DMSO溶劑對(duì)照組，表達(dá)第五天達(dá)到最高點(diǎn)，出現(xiàn)與EMS陽(yáng)性對(duì)照組相同的趨勢(shì)。圖2為氯酚類化合物DCP、TCP誘變天數(shù)與信號(hào)Ⅱ峰高關(guān)系圖，由圖可知，V79細(xì)胞在接觸受試物后，信號(hào)Ⅱ峰高在表達(dá)第三天開始明顯區(qū)別于DMSO溶劑對(duì)照組，出現(xiàn)與信號(hào)Ⅰ峰高相同趨勢(shì)。

圖1 電化學(xué)信號(hào)I(0.69 V)隨DCP和TCP對(duì)V79細(xì)胞誘變時(shí)間變化圖

圖2 電化學(xué)信號(hào)II(1.03 V)隨DCP和TCP對(duì)V79細(xì)胞誘變時(shí)間變化圖

2.3 完全突變細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)

將正常V79細(xì)胞在接觸不同受試物后培養(yǎng)8天加入6-硫鳥嘌呤篩選出完全突變細(xì)胞，檢測(cè)相同濃度細(xì)胞電化學(xué)信號(hào)變化，見圖3。在相同細(xì)胞量3×106cells·mL-1的情況下，接觸了DCP與TCP的完全突變細(xì)胞，電化學(xué)信號(hào)峰大于正常V79細(xì)胞，EMS陽(yáng)性對(duì)照組同樣大于正常V79細(xì)胞，而DMSO溶劑對(duì)照組的電化學(xué)信號(hào)峰小于正常V79細(xì)胞。

圖3 完全突變細(xì)胞電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度差異細(xì)胞濃度：3×106 cells·mL-1

3 結(jié) 語(yǔ)

氯酚類化合物大多數(shù)具有致畸、致癌作用。常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果顯示，DCP與TCP均具有明顯的致突變，且TCP的致突變作用強(qiáng)于DCP。V79細(xì)胞接觸了氯酚類化合物DCP和TCP后，在表達(dá)的第三天受試物組既出現(xiàn)明顯高于溶劑對(duì)照組電化學(xué)信號(hào)峰的趨勢(shì)，并在第五天達(dá)到最高點(diǎn)。此趨勢(shì)與EMS陽(yáng)性對(duì)照組相似。對(duì)同細(xì)胞量完全突變與未突變細(xì)胞進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)比較，其結(jié)果顯示，在同樣細(xì)胞數(shù)量下完全突變細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)峰高與EMS陽(yáng)性對(duì)照組相似，均大于正常V79細(xì)胞。而未突變細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)峰與DMSO溶劑對(duì)照組相似，均小于正常V79細(xì)胞。以上結(jié)果說(shuō)明，電化學(xué)法可以檢測(cè)到氯酚類化合物DCP和TCP致哺乳動(dòng)物細(xì)胞HGPRT基因突變的特征性變化，有望發(fā)展成為一種新的哺乳動(dòng)物細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)。