基于高通量測(cè)序技術(shù)分析不同耕作方式下水稻根際土壤真菌多樣性

勞承英 申章佑 李艷英 韋本輝 周靈芝 周佳 胡泊 黃渝嵐

摘? 要：為研究不同耕作方式下水稻根際土壤真菌群落多樣性，本研究以旋耕、免耕和粉壟耕作處理的水稻根際土壤為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，并結(jié)合土壤環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：3種耕作處理水稻根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和球囊菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬為鐮刀菌屬、被孢霉屬、Pyrenochaetopsis、柄孢殼屬、毛殼菌屬、支頂孢屬、隱球菌屬、Westerdykella、頂囊殼屬、綠僵菌屬。接合菌門(mén)和被孢霉屬、支頂孢屬、隱球菌屬、頂囊殼屬真菌相對(duì)豐度在不同處理間差異顯著。Alpha多樣性指數(shù)分析顯示，3種耕作處理間無(wú)顯著差異。PCoA分析表明，不同耕作處理下的土壤真菌群落分布特征存在明顯差異。冗余分析表明前兩個(gè)排序軸共解釋了3種耕作處理間土壤真菌群落變化的87.46%。相關(guān)性分析顯示，土壤pH與接合菌門(mén)真菌豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，土壤速效磷、堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量與接合菌門(mén)真菌豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，土壤速效磷與擔(dān)子菌門(mén)真菌豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。綜上表明，短期不同耕作方式處理下水稻根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，不同處理下真菌群落分布受土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、堿解氮和速效磷影響。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序;耕作方式;水稻根際土壤;真菌群落多樣性

中圖分類號(hào)：S154.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Diversity Analysis of Fungal in Rhizosphere Soils of Rice under Different Tillage Methods Based on High-throughput Sequencing Technique

LAO Chengying， SHEN Zhangyou， LI Yanying， WEI Benhui， ZHOU Lingzhi， ZHOU Jia*， HU Po，

HUANG Yulan

Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： To study the diversity of the rhizosphere soil fungal communities in rice under different tillage practices， this research was carried out using rotary tillage， no tillage， smash and ridging tillage treatments. The structure and diversity of fungal communities were analyzed using high-throughput sequencing techniques in the rhizosphere soil， and Pearsons correlation analysis was performed combined with soil environmental factors. Ascomycota， Zygomycota Basidiomycota and Glomeromycota were the dominant phyla， and Fusarium， Mortierella， Pyrenochaetopsis， Zopfiella， Chaetomium， Acremonium， Cryptococcus， Westerdykella， Gaeumannomyces， Metarhizium were the top10 dominant genera in the rice rhizosphere soils of the three tillage treatments. Relative abundance of Zygomycota and Mortierella， Acremonium， Cryptococcus and Gaeumannomyces among the three treatments was significantly different. Alpha diversity index analysis showed no significant differences among the three farming treatments. Principal co-ordinates analysis showed that the distribution characteristics of the soil fungal communities under different tillage treatments were significantly different. Redundancy analysis showed that the variation of the soil fungal communities was 87.46% by the first two ranking axes together among the three tillage treatments. The Pearsons correlation analysis showed that soil pH was highly significantly positively correlated with the abundance of Zygomycota fungi. While the content of soil available phosphorus， alkaline hydrolytic nitrogen and organic matter was highly significantly negatively correlated with the abundance of Zygomycota fungi. And the content of soil available phosphorus was significantly positively correlated with the abundance of Basidiomycota fungi. In summary， it is shown that the structure and diversity of the rhizosphere soil fungal communities in rice are different under short-term different tillage treatments. The distribution of fungal communities is influenced by soil pH， organic matter， alkaline hydrolytic nitrogen and available phosphorus.

Keywords： high-throughput sequencing; tillage methods; rice rhizosphere soil; diversity of fungal community

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.038

土壤真菌作為土壤微生物的主要成員之一，其多樣性及其生態(tài)功能已成為目前國(guó)內(nèi)外土壤微生態(tài)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)多種生態(tài)系統(tǒng)中植物根際土壤真菌的研究表明，真菌數(shù)量、群落組成和功能多樣性受不同的土壤類型、耕作方式、種植模式、施肥方式和植被種類等因素影響[1]。因此，研究不同耕作方式下根際土壤真菌的多樣性對(duì)解釋稻田土壤真菌群落的形成和水稻種植方式的選擇具有重要意義。土壤耕作是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要技術(shù)措施，通過(guò)耕作工具對(duì)土壤擾動(dòng)而改變了耕層土壤物理狀況，引起土壤水、肥、氣、熱等變化，間接影響耕層土壤養(yǎng)分、酶活性和微生物區(qū)系等化學(xué)和生物學(xué)特性，改變土壤微生物數(shù)量、結(jié)構(gòu)及其多樣性[2-6]。長(zhǎng)期以來(lái)稻田生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用淺旋耕（即常規(guī)漿耕）的耕作方式，但頻繁漿耕會(huì)導(dǎo)致稻田土壤犁底層上移、耕層土壤變淺、表面結(jié)膜板結(jié)、水分滲透能力和通氣性變差、耕性變劣、保水保肥性能降低。免耕是20世紀(jì)60年代開(kāi)始實(shí)行的播種前不單獨(dú)進(jìn)行任何土壤耕作的耕作方式，部分研究認(rèn)為免耕可保護(hù)土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤供肥保肥能力[7?8];但也有研究認(rèn)為短期免耕能改善土壤物理性狀，長(zhǎng)期少免耕、輕耕等耕作會(huì)使土壤物理性質(zhì)變差，且單一免耕對(duì)土壤養(yǎng)分狀況改善效果不顯著[6?9]。近些年興起深松、粉壟等耕作措施能加深耕層土壤厚度，改善土壤結(jié)構(gòu)，擴(kuò)大土壤庫(kù)容，為植物生長(zhǎng)創(chuàng)造全新的耕層土壤生態(tài)環(huán)境[2， 6， 10-15]。粉壟耕作是一種新型全耕層深耕深松耕作技術(shù)，通過(guò)粉壟機(jī)械螺旋型鉆頭垂直入土將耕層土壤橫向切割碎土，改變土壤團(tuán)聚體顆粒組成增加孔隙度[10]、降低土壤容重[11-14]、增加土壤蓄水量[12-13]，改變耕層土壤養(yǎng)分分布[14]，提高土壤的保肥蓄水能力[15]、保持多年提高作物產(chǎn)量和養(yǎng)分效率[11， 16-18]，但關(guān)于粉壟耕作對(duì)土壤微生物的影響尚缺乏研究。

至今，關(guān)于免耕、翻耕和旋耕等耕作對(duì)土壤真菌的影響研究有少量報(bào)道，粉壟耕作對(duì)土壤真菌的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以旋耕、免耕和粉壟耕作不同耕作方式處理的水稻根際土壤為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，并結(jié)合土壤環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析，評(píng)價(jià)短期旋耕、免耕和粉壟耕作下稻田水稻根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，以期從微生態(tài)學(xué)角度為水稻耕作方式的選擇提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究在廣西南寧市那桐鎮(zhèn)大藤村廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所試驗(yàn)基地的稻田進(jìn)行，試驗(yàn)地為多年常規(guī)漿耕種植水稻的稻田，但為了能較好地進(jìn)行免耕處理，實(shí)驗(yàn)處理前半年內(nèi)將試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行休耕（即不進(jìn)行任何耕作和種植作物）。供試土壤為紅壤，耕作處理前，采用“S”取樣法分別采集旋耕、免耕和粉壟耕作處理的各3個(gè)小區(qū)的地塊內(nèi)0～15 cm土層土壤，其基本理化性質(zhì)為：pH為旋耕5.98～6.26、免耕5.94～6.28、粉壟5.96～6.28;有機(jī)質(zhì)含量旋耕為26.15～27.94 g/kg、免耕25.70～27.54 g/kg、粉壟25.26～27.68 g/kg;全氮旋耕1.38～1.52 g/kg、免耕1.34～1.58 g/kg、粉壟1.36～1.62 g/kg;全磷旋耕0.86～0.92 g/kg、免耕0.86～0.94 g/kg、粉壟0.81～0.90 g/kg;全鉀旋耕12.58～14.48 g/kg、免耕12.84～14.38 g/kg、粉壟13.02～14.56 g/kg;速效氮旋耕70.91～ 72.06 mg/kg、免耕70.82～72.84 mg/kg、粉壟70.74～ 72.96 mg/kg;速效磷旋耕46.74～49.22 mg/kg、免耕47.24～ 49.28 mg/kg、粉壟46.22～49.42 mg/kg;速效鉀旋耕174.53～187.87 mg/kg、免耕174.96～ 185.96 mg/kg、粉壟175.82～187.35 mg/kg。各試驗(yàn)處理點(diǎn)土壤養(yǎng)分指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 共設(shè)置旋耕、免耕和粉壟3種不同耕作方式的處理。旋耕（常規(guī)漿耕）處理，在秧苗移栽前1 d使用傳統(tǒng)拖拉機(jī)將灌水后的稻田進(jìn)行耕作深度約15 cm的漿耕;免耕處理，稻田除秧苗移栽前1 d灌水軟土外不單獨(dú)進(jìn)行任何土壤耕作;粉壟處理，在稻田干水時(shí)，利用專用粉壟機(jī)械（廣西五豐機(jī)械有限公司生產(chǎn)的自走式粉壟機(jī)）的垂直螺旋型鉆頭刀片對(duì)0～28 cm耕層土壤進(jìn)行快速橫向切割碎土的整地耕作，在秧苗移栽的前1 d回水至保留水層約5 cm。本研究采用田間小區(qū)試驗(yàn)（面積約30 m2），各小區(qū)四周利用塑料隔板（隔板寬42 cm、插入田面以下深約30 cm）進(jìn)行分隔，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。供試水稻品種為‘H兩優(yōu)991（廣西兆和種業(yè)有限公司）采用塑盤(pán)漿播育秧，三葉一心時(shí)拋秧，拋栽密度為30萬(wàn)蔸/hm2。施肥采用田面撒施方式，化肥施用量以常規(guī)施氮量為N 225.0 kg/hm2，氮、磷、鉀（N∶P2O5∶K2O）配比為1∶0.5∶1.2，在移栽前施基肥，拋秧后7、12 d及幼穗分化前7 d施3次追肥。水稻生育期內(nèi)實(shí)行水分干濕交替管理。不同耕作方式處理除種植前的整地方式不同外，其他田間管理措施均保持一致。

1.2.2? 土壤樣品的采集? 水稻根際土壤樣品取樣方法參照劉波等[19]“抖根法”，在耕作處理后第一季水稻成熟期分別采集旋耕、免耕和粉壟耕作種植的水稻根際土壤分成2份帶回實(shí)驗(yàn)室，一份土樣存放于?80 ℃用于土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析，另一份土樣置于通風(fēng)處晾干用于pH、有機(jī)質(zhì)和速效養(yǎng)分測(cè)定，各處理均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3? 土壤基因組DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序? 不同處理水稻根際土壤樣本中基因組 DNA提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（德國(guó)QIAGEN），提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA質(zhì)量合格后送樣給微基生物科技（上海）有限公司，進(jìn)行miseq文庫(kù)制備和高通量測(cè)序分析。采用兩步PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建文庫(kù)，將純化的DNA作為模板，使用特異引物ITS1F （5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA A-3'）和ITS1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3'）擴(kuò)增真菌ITS1基因[20]，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段，并利用凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA）回收純化目的片段，將回收產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增時(shí)將illumina平臺(tái)測(cè)序所需的接頭barcode添加到目的片段的兩端，再次凝膠回收全部PCR產(chǎn)物;采用FTC-3000TM real-time PCR儀對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，均一化混勻后完成文庫(kù)制備。按照測(cè)序要求使用NGS Illumina MiSeq 2 x 300 bp平臺(tái)進(jìn)行上樣測(cè)序。

1.2.4? 生物信息學(xué)分析? 對(duì)Miseq測(cè)序結(jié)果序列進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾和拼接，得到優(yōu)化序列。利用USEARCH軟件將優(yōu)化序列在97%相似度下進(jìn)行聚類，得到各樣品OTU代表序列。利用mothur（Version 1.33.3）進(jìn)行Alpha多樣性分析（Chao、Ace等物種豐富度統(tǒng)計(jì)，Shannon、Simpson等物種多樣性統(tǒng)計(jì)）、Venn圖繪制，Beta多樣性分析（PCoA分析）。運(yùn)用USEARCH和mothur軟件將 OTU代表序列與Silva 128數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類學(xué)分析。采用R語(yǔ)言的Vegan軟件對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)群落和土壤環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析。

1.2.5? 土壤環(huán)境因子測(cè)定? 采用酸度計(jì)法（土水比為1∶2.5）測(cè)定pH，采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定有機(jī)質(zhì)，采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮，采用NH4F/HCl浸提鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷，采用醋酸銨浸提火焰光度法測(cè)定速效鉀[21]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019軟件整理土壤環(huán)境因子試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行土壤環(huán)境因子和真菌相對(duì)豐度數(shù)據(jù)的方差分析（ANOVA）顯著性檢驗(yàn)，以及真菌群落與土壤環(huán)境因子間的Pearson相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 土壤真菌群落高通量文庫(kù)評(píng)價(jià)

從旋耕、免耕和粉壟處理的9個(gè)樣品采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序后共獲得491 814條有效序列，經(jīng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、去噪、去除嵌合體和非真菌序列后，共獲得394 764條優(yōu)化序列（旋耕、免耕和粉壟處理分別為45 071條、42 393條和44 123條），優(yōu)質(zhì)序列主要集中在225～350 nt，各處理樣品文庫(kù)覆蓋率均達(dá)到99.96%以上，在97%相似度下共獲得1 074個(gè)OTU。表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可以反映出樣品中的物種組成特征，更深的測(cè)序幾乎不會(huì)產(chǎn)生更多新的 OTU，所構(gòu)建的文庫(kù)能夠較好地反映土壤真菌群落結(jié)構(gòu)情況，可用于后續(xù)分析。

2.2? 土壤真菌群落Alpha多樣性分析

通過(guò)對(duì)不同耕作處理的水稻根際土壤真菌群落豐富度指數(shù)（Chao指數(shù)和Ace指數(shù)）和群落多樣性的指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）分析表明，Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)是粉壟大于旋耕和免耕，Ace指數(shù)是免耕大于旋耕和粉壟，Simpson指數(shù)粉壟小于旋耕和免耕，但在不同耕作方式處理間均無(wú)顯著性差異（表1）。

2.3? 不同耕作處理OTU分布分析

經(jīng)對(duì)有效序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接和優(yōu)化，通過(guò)RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋以及在97%的相似水平下的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，在旋耕、免耕和粉壟水稻根際土壤中分別獲得535、612和547個(gè)真菌OTU。Venn圖可以直觀地表現(xiàn)土壤真菌群落的OTU數(shù)目組成相似性、重疊情況以及特異性。通過(guò)Miseq測(cè)序，旋耕、免耕和粉壟3個(gè)不同處理下根際土壤真菌的OTUs-Venn圖表明，9個(gè)樣品共獲得1074個(gè)真菌OTUs，旋耕、免耕和粉壟共有OTUs數(shù)量為204，只占OTUs總數(shù)的18.99%;特有的OTUs數(shù)量分別為188、260和210，分別占17.50%、24.21%和19.55%;旋耕和免耕共有的OTUs數(shù)量為79，旋耕和粉壟共有的 OTUs數(shù)量為64，免耕和粉壟共有的OTUs數(shù)量為69（圖1）。說(shuō)明旋耕、免耕和粉壟等3個(gè)處理栽培的水稻根際土壤中真菌多樣性存在差異且各自都有其獨(dú)特的OTUs，群落結(jié)構(gòu)也較復(fù)雜。對(duì)OTU從門(mén)到種依次進(jìn)行分類，總共獲得真菌群落7門(mén)、23綱、55目、90科、124屬、116種。

2.4? 不同耕作處理下的土壤真菌群落Beta多樣性分析

為了解不同耕作方式處理的水稻根際土壤真菌群落組成，在OTU水平上對(duì)樣本的土壤真菌群落進(jìn)行基于unweighted UniFrac距離算法的主坐標(biāo)分析（PCoA），研究不同耕作處理下水稻根際土壤真菌Beta多樣性差異。PCoA分析結(jié)果顯示，相同耕作處理的水稻根際土壤真菌群落聚在一起，不同耕作處理分布在不同象限內(nèi)能明顯分開(kāi)， 說(shuō)明不同耕作處理下的水稻根際土壤真菌群落存在明顯差異（圖2）。在土壤真菌群落中PC1的貢獻(xiàn)率為24.80%，旋耕和免耕處理受PC1影響較大;PC2的貢獻(xiàn)率為22.74%，免耕和粉壟處理受PC2影響較大。結(jié)果表明，耕作方式能夠影響水稻根際土壤真菌群落組成。

2.5? 真菌群落分布特征分析

2.5.1? 水稻根際真菌群落在門(mén)水平上的組成和群落結(jié)構(gòu)多樣性差異? 利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤真菌群落多樣性進(jìn)行分析。測(cè)定結(jié)果顯示，旋耕、免耕和粉壟處理水稻根際土壤微生物真菌群落共檢測(cè)到7個(gè)門(mén)類。從門(mén)的分類水平看，旋耕、免耕和粉壟處理水稻根際土壤微生物真菌群落組成多樣性豐富，主要含有子囊菌門(mén)（Ascomycota）、接合菌門(mén)（Zygomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）和壺菌門(mén)（Chytridiomycota）5個(gè)已知菌門(mén)和2個(gè)分類地位未鑒定菌門(mén)，5個(gè)已知菌門(mén)相對(duì)豐度在旋耕、免耕和粉壟處理中分別占比39.04%、45.76%和58.24%（圖3）。其中，第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)子囊菌門(mén)相對(duì)豐度在旋耕、免耕和粉壟處理分別占比32.19%、39.27%和42.61%;第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)接合菌門(mén)相對(duì)豐度在旋耕、免耕和粉壟分別為3.62%、3.80%和13.83%。此外，壺菌門(mén)只在旋耕處理中檢測(cè)到，而在免耕和粉壟處理的水稻根際土壤中未檢測(cè)到，說(shuō)明在門(mén)的分類水平上，旋耕、免耕和粉壟栽培水稻根際土壤真菌群落組成多樣性存在差異。物種差異分析顯示，在菌門(mén)分類水平上，3種不同耕作處理間的接合菌門(mén)相對(duì)豐度差異極顯著，粉壟（13.83%）處理中顯著高于免耕（3.80%）和旋耕（3.62%）分別提高了2.64倍和2.82倍（圖4）。結(jié)果表明，在菌門(mén)水平上，3種耕作處理中粉壟處理顯著增加了水稻根際土壤真菌群落多樣性。

2.5.2? 水稻根際真菌群落在屬水平上的組成和群落結(jié)構(gòu)多樣性差異? 在屬的分類水平上對(duì)真菌群落組成和相對(duì)豐富度進(jìn)行分析，旋耕、免耕和粉壟栽培水稻根際土壤真菌群落共檢測(cè)到124個(gè)屬，3個(gè)處理間真菌群落組成屬水平多樣性比較豐富且差異較大（圖5）。其中，Top10的優(yōu)勢(shì)菌屬為鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Morti?erella）、Pyrenochaetopsis、柄孢殼屬（Zopfiella）、毛殼菌屬（Chaetomium）、支頂孢屬（Acremonium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、Westerdykella、頂囊殼屬（Gaeumannomyces）、綠僵菌屬（Metarhizium），在旋耕、免耕和粉壟處理分別占比20.10%、23.60%和34.39%。物種群落組成多樣性分析顯示，被孢霉屬（Mortierella）、支頂孢屬（Acremonium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、頂囊殼屬（Gaeumannomyces）4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬在3個(gè)處理間存在顯著或極顯著差異（圖6）。被孢霉屬的相對(duì)豐度分別為旋耕（3.62%）、免耕（3.76%）和粉壟（13.83%），粉壟處理極顯著大于旋耕和免耕處理;支頂孢屬的相對(duì)豐度分別為旋耕（1.55%）、免耕（0.81%）和粉壟（2.66%），粉壟>旋耕>免耕，三者間差異顯著;隱球菌屬的相對(duì)豐度分別為旋耕（1.25%）、免耕（0.49%）和粉壟（0.36%），旋耕處理顯著高于粉壟和免耕處理;頂囊殼屬的相對(duì)豐度分別為旋耕（1.24%）、免耕（0.13%）和粉壟（0.20%），旋耕處理極顯著高于粉壟和免耕處理;Stilbella為旋耕處理特有菌屬。結(jié)果說(shuō)明，不同耕作處理改變了水稻根際土壤真菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)分布，粉壟耕作對(duì)提高真菌屬群落豐度影響最大。

2.6? 不同耕作處理下的土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

為了明確3種栽培方式對(duì)水稻根際土壤環(huán)境因子的影響，分析了不同處理下水稻根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀。結(jié)果如圖7所示，土壤pH變化范圍在4.48～4.95，偏酸性，粉壟處理顯著高于旋耕和免耕，分別增加9.51%和10.49%;旋耕和免耕處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著大于粉壟處理，分別增加18.15%和19.29%;對(duì)于土壤堿解氮含量，旋耕和免耕處理顯著大于粉壟，分別增加16.20%和22.35%;旋耕處理的土壤速效磷含量顯著大于免耕和粉壟處理，分別增加15.32%和95.35%;免耕處理的土壤速效鉀含量顯著大于旋耕和粉壟處理，分別增加43.95%和15.70%。結(jié)果說(shuō)明，不同耕作方式下水稻根際土壤理化性質(zhì)有顯著改變。

為了明確不同處理下土壤環(huán)境因子pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀對(duì)真菌群落分布的影響，將土壤理化因子與真菌門(mén)群落進(jìn)行冗余分析（RDA），結(jié)果顯示，第一排序軸（RDA1）解釋了真菌群落變化的69.67%，第二排序軸解釋了真菌群落變化的17.79%，前2個(gè)排序軸總共解釋了87.46%的群落變化（圖8）。除土壤pH與RDA1呈正相關(guān)外，其余土壤環(huán)境因子與RDA1都呈負(fù)相關(guān);除土壤速效鉀與RDA2呈正相關(guān)外，其余土壤環(huán)境因子與RDA2都呈負(fù)相關(guān)。

為進(jìn)一步明確3種耕作方式處理的水稻根際土壤真菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，對(duì)真菌門(mén)菌群與土壤理化因子間進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明6個(gè)菌群中有3個(gè)菌門(mén)與土壤理化性質(zhì)有顯著相關(guān)（表2）。子囊菌門(mén)、球囊菌門(mén)和壺菌門(mén)群落受土壤因子影響較小，與土壤因子相關(guān)性差異不顯著。土壤速效磷與接合菌門(mén)真菌豐度圖中不同綠色圓點(diǎn)（MG）、紅色正方形（FL）和藍(lán)色三角形（XG）為樣本組;黑色箭頭代表物種;紅色箭頭表示環(huán)境影響因子，箭頭的長(zhǎng)短可以代表環(huán)境因子對(duì)于物種數(shù)據(jù)的影響程度。

呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與擔(dān)子菌門(mén)真菌豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系;土壤堿解氮與接合菌門(mén)真菌豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;土壤pH與接合菌門(mén)真菌豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與未分類真菌門(mén)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;土壤有機(jī)質(zhì)與接合菌門(mén)真菌豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;土壤速效鉀對(duì)不同耕作方式下水稻根際土壤真菌群落分布無(wú)顯著影響。說(shuō)明土壤真菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)土壤pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮和速效磷環(huán)境因子有響應(yīng)，其中接合菌門(mén)受土壤環(huán)境因子影響最大。

3? 討論

土壤的特性差異會(huì)對(duì)土壤真菌種類及組成有一定影響。其中土壤pH能夠直接或間接影響真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性[22]，本研究中從3種耕作方式的土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)變化分析，土壤pH、堿解氮和有機(jī)質(zhì)在旋耕和免耕處理間均無(wú)顯著差異，而二者與粉壟處理間差異顯著。粉壟處理的土壤pH顯著高于旋耕和免耕處理，土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮顯著低于旋耕和免耕處理。菌群群落結(jié)構(gòu)分析也發(fā)現(xiàn)，粉壟處理中接合菌門(mén)及其被孢霉屬菌群約占13.83%，旋耕和免耕處理中分別約為3.62%和3.80%。同時(shí)Pearson相關(guān)性分析也顯示，接合菌門(mén)菌群與土壤pH呈極顯著正相關(guān)，而與土壤堿解氮、有機(jī)質(zhì)和速效磷呈極顯著負(fù)相關(guān)，速效鉀對(duì)其影響很小。說(shuō)明一季短期3種不同耕作方式處理主要是改變了土壤pH、堿解氮和有機(jī)質(zhì)的養(yǎng)分條件而引起水稻根際土壤真菌群落的改變，其中短期粉壟耕作對(duì)水稻根際土壤養(yǎng)分和真菌群落的影響最大。

接合菌門(mén)被孢霉屬是土壤習(xí)居菌，是一種具有較強(qiáng)分解纖維素能力的真菌。Puget等[23]研究發(fā)現(xiàn)，接合菌門(mén)中的毛霉屬、根霉屬和被孢霉屬等真菌能分解土壤中的簡(jiǎn)單糖類和纖維素等物質(zhì)。Goto等[24]研究表明，接合菌門(mén)的被孢霉屬是對(duì)土壤有益的微生物。段倩倩等[25]對(duì)石漠化生態(tài)桑林根際土壤微生物資源多樣性研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)真菌中接合菌門(mén)被孢霉屬為土壤有益微生物，且其具有溶解土壤中磷的功能。李發(fā)虎等[26]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭可顯著提高黃瓜根際土壤中真菌子囊菌門(mén)和接合菌門(mén)豐度，且黃瓜根系體積與被孢霉科比例顯著正相關(guān)。陳力力等[27]對(duì)水稻-油菜雙序列復(fù)種免耕、翻耕土壤真菌多樣性的研究顯示，免耕樣品被孢霉科相對(duì)豐度比翻耕樣品的大3～5倍。粉壟栽培的水稻根際土壤中接合菌門(mén)被孢霉屬相對(duì)豐度極顯著高于旋耕和免耕處理，說(shuō)明短期粉壟耕作比免耕和旋耕更有利于接合菌門(mén)被孢霉屬真菌生長(zhǎng)繁殖。

土壤微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)評(píng)價(jià)微生物群落豐富度和多樣性，一般認(rèn)為較高的多樣性指數(shù)即具有較高的微生物豐富度和多樣性[28]。部分學(xué)者認(rèn)為，與常規(guī)旋耕或翻耕相比，免耕可以提高土壤真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性指數(shù)[29-32]，但也有研究表明免耕和常規(guī)耕作處理間微生物多樣性和豐富度指數(shù)無(wú)顯著性差異[33-36]。本研究中，不同耕作方式間水稻根際土壤真菌群落Alpha多樣性指數(shù)差異不顯著，這與Kuntz等[33]、李麗娜等[34]、王小玲等[35]和沈吉成等[36]的研究結(jié)果相似。土壤真菌作為重要的生物指示因子對(duì)土壤環(huán)境變化具有一定的抵抗和恢復(fù)能力[1]。研究結(jié)果的差異可能與耕作方式的處理年限有關(guān)，土壤微生物豐富度和多樣性水平的改變需要經(jīng)過(guò)一段周期。本研究在一季短期耕作處理下，土壤真菌的不同類型微生物群落間的豐富度增加與降低相互抵消[37]而差異不明顯。

土壤真菌是土壤微生物的重要成員，推動(dòng)著土壤生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，在土壤中發(fā)揮著重要的調(diào)控養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與分解作用[38]。王小玲等[35]研究表明，在寧夏南部山區(qū)免耕覆蓋及有機(jī)肥施用處理的冬小麥農(nóng)田中子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。沈吉成等[36]研究表明，隴中旱農(nóng)區(qū)免耕秸稈覆蓋和傳統(tǒng)耕作的麥豆輪作系統(tǒng)中子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)種群，且其豐度在免耕處理比傳統(tǒng)耕作中分別提高3.67%和1.86%。代紅翠等[39]研究華北平原地區(qū)不同耕作和秸稈還田下褐土真菌群落，結(jié)果也表明子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。陳力力等[27]研究表明，在水稻-油菜雙序列復(fù)種免耕、翻耕稻田土壤真菌中前三位優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)。Frey等[40]研究認(rèn)為，土壤中植物殘?bào)w的分解和有機(jī)質(zhì)的降解過(guò)程中子囊菌門(mén)和接合菌門(mén)真菌起重要作用，而擔(dān)子菌門(mén)有較強(qiáng)分解木質(zhì)纖維素的能力。本研究不同耕作方式下水稻根際土壤真菌群落組成結(jié)果與陳力力等[27]的研究結(jié)果相似，主要優(yōu)勢(shì)類群依次為子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)。因此，說(shuō)明在多種生態(tài)系統(tǒng)中子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)都作為優(yōu)勢(shì)菌群參與養(yǎng)分的循環(huán)利用。

Hazard等[41]研究顯示，土壤環(huán)境因子（如有機(jī)質(zhì)等）對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有重要影響。韓世忠等[42]研究表明土壤pH也是影響真菌群落結(jié)構(gòu)組成的重要環(huán)境因子，對(duì)土壤真菌的生長(zhǎng)繁殖具有顯著影響。代紅翠等[39]研究不同耕作和秸稈還田下褐土真菌群落變化認(rèn)為土壤有機(jī)碳和堿解氮的改變是影響真菌群落組成的主要因素。周玉杰等[43]研究結(jié)果表明，橡膠林的土壤真菌多樣性與土壤養(yǎng)分含量密切相關(guān)，接合菌門(mén)與全磷和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，擔(dān)子菌門(mén)與堿解氮、全氮、全鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。本研究中相關(guān)性分析也表明接合菌門(mén)相對(duì)豐度與土壤pH呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與土壤速效磷、堿解氮和有機(jī)質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與前人研究表明土壤養(yǎng)分是影響土壤真菌群落分布的重要因素的結(jié)果相似。說(shuō)明與短期常規(guī)漿耕和免耕栽培相比，短期粉壟耕作可能通過(guò)改變土壤環(huán)境因子而引起土壤真菌群落變化。

綜上，本研究結(jié)果表明，與常規(guī)漿耕和免耕栽培相比，短期粉壟耕作后水稻根際土壤優(yōu)勢(shì)真菌菌群結(jié)構(gòu)組成變化較小，但優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和菌屬群落豐富度顯著增加，尤其是接合菌門(mén)被孢霉屬相對(duì)豐度顯著增加;土壤環(huán)境因子中土壤pH、堿解氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)含量的改變是影響真菌群落組成的主要因素。研究結(jié)果可為解析不同耕作方式對(duì)水稻根際土壤真菌群落形成提供理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯：崔麗虹