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    菌劑對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物群落的影響

    2021-11-06 02:58:36毛婷牛永艷鄭群楊濤穆永松祝英季彬王治業(yè)
    生物技術(shù)通報(bào) 2021年9期
    關(guān)鍵詞:菌劑苜蓿發(fā)酵液

    毛婷 牛永艷 鄭群 楊濤 穆永松 祝英 季彬 王治業(yè)

    (1. 甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅省微生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000;2. 甘肅華瑞農(nóng)業(yè)股份有限公司,張掖 734500)

    被稱(chēng)為飼草蛋白之王的紫花苜蓿是我國(guó)反芻動(dòng)物的主要飼草來(lái)源,在我國(guó)東北、華北、西北等地區(qū)都適宜種植不同抗寒、耐鹽、高產(chǎn)、抗病品種的紫花苜蓿。紫花苜蓿蛋白質(zhì)含量高、微生物及礦物質(zhì)含量豐富、氨基酸平衡,是一種優(yōu)良的保健飼料[1]。在苜蓿主產(chǎn)區(qū),由于雨水與熱量同期,苜蓿收獲季節(jié)在制備苜蓿干草過(guò)程中容易受到雨水、落葉等損失,很難曬制成優(yōu)質(zhì)的干草,紫花苜蓿的青貯成為解決上述問(wèn)題較為理想的途徑。紫花苜蓿屬于豆科多年生草本植物,可溶性碳水化合物及干物質(zhì)含量低,在青貯過(guò)程中難以快速降低pH,減少梭狀芽胞桿菌生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)水解和異氧發(fā)酵,提高青貯適口性[2]。因此,必需研究開(kāi)發(fā)適宜于紫花苜蓿青貯的專(zhuān)一菌劑產(chǎn)品。

    目前,關(guān)于菌劑產(chǎn)品的研究報(bào)道許多,市場(chǎng)上青貯的菌劑產(chǎn)品多樣,品質(zhì)層次不一。青貯菌劑主要以乳酸菌菌株為主,添加多種功能性酶,具有添加量小、安全、易操作、無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)[3];青貯密封后可以快速降低pH,減少蛋白質(zhì)的分解;抑制青貯發(fā)酵溫度上升,減少干物質(zhì)的損失;不宜發(fā)生二次發(fā)酵[4]。對(duì)于不同青貯原料開(kāi)發(fā)不同青貯菌劑的研究報(bào)道有許多,俸祥仁等[5]以黑曲霉、乳酸菌及產(chǎn)軟假絲酵母復(fù)配青貯菌劑并運(yùn)用于甘蔗葉梢青貯中。Fija?kowska等[6]采用3種不同乳酸菌作用于甜菜中提高青貯有氧穩(wěn)定性,降低產(chǎn)毒真菌的濃度。Hager等[7]以植物乳桿菌和小球菌復(fù)配菌劑,以提高辣根草和甜高粱青貯的發(fā)酵品質(zhì)。目前關(guān)于苜蓿等豆科植物單獨(dú)青貯的菌劑產(chǎn)品較少[8]。

    綠汁發(fā)酵液是一種新型的乳酸菌類(lèi)青貯菌劑,是將原料鮮草的汁液在厭氧條件下培養(yǎng),富集原料上附著的野生乳酸菌中制備成棕色或棕黃色的液體[9]。綠汁發(fā)酵液中存在適宜于原料發(fā)酵所需的豐富的乳酸菌,Li等[10]報(bào)道了在38個(gè)苜蓿品種中分離得到84株乳酸菌隸屬于7個(gè)屬15個(gè)種及亞種。Chen等[11]研究了乳酸菌與纖維素酶聯(lián)合使用改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì),影響瘤胃發(fā)酵對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能產(chǎn)生積極影響。在苜蓿綠汁發(fā)酵液中分離篩選能在低碳水化合物下生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株可用于開(kāi)發(fā)苜蓿青貯菌劑。研究表明,產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌株能快速的降低青貯pH值,為其他有益菌的生長(zhǎng)提供酸性環(huán)境[12];盧強(qiáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)在鹽堿地苜蓿青貯的微生物中,可能存在為數(shù)不多的藍(lán)細(xì)菌,并對(duì)鹽堿地苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生促進(jìn)作用。包維臣等[14]研究發(fā)現(xiàn)在苜蓿青貯中添加植物乳桿菌可以使乳酸菌活菌數(shù)快速升高,并對(duì)梭菌、大腸菌群、酵母菌和霉菌等青貯有害微生物產(chǎn)生了抑制作用。青貯過(guò)程是微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜變化的過(guò)程。不同青貯添加劑的添加對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有著不同的影響。

    有關(guān)青貯的研究多是從不同青貯原料、青貯條件等對(duì)青貯期間或開(kāi)封后微生物的影響方面進(jìn)行探討,較少將添加劑、青貯品質(zhì)與微生物多樣性結(jié)合進(jìn)行深入探討。本研究通過(guò)制備苜蓿綠汁發(fā)酵液分離篩選產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)乳酸菌株并與實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的菌株復(fù)配制備苜蓿青貯菌劑,研究不同的青貯菌劑對(duì)紫花苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落多樣性的影響,為青貯菌劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    紫花苜蓿來(lái)自于甘肅張掖華瑞農(nóng)業(yè)股份在有限公司種植地。青貯試驗(yàn)地位于張掖市民樂(lè)縣,E 100°22'-101°13',N 37°56'-38°48',海 拔2 309 m。試驗(yàn)開(kāi)展時(shí)間為2020年6月-9月,平均氣溫12℃-24℃,苜蓿原料有機(jī)組分如表1所示。

    表1 紫花苜蓿鮮草的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of fresh alfalfa

    1.2 方法

    1.2.1 試驗(yàn)處理 苜蓿收割后,放置田間晾曬1-2 d,用烘干法檢測(cè)水分含量為55%-60%。將晾曬水分含量為55%-60%的苜蓿切割為1-2 cm。4個(gè)處理組分別為:添加苜蓿綠汁發(fā)酵液(aFGJ組),添加進(jìn)口菌劑貯生宜寶(YB組),添加復(fù)配菌劑GSSW(GSSW組)、及未添加菌劑作為對(duì)照(CK組),每個(gè)處理組9個(gè)重復(fù)。將處理后的苜蓿草裝入50 L食品級(jí)塑料桶內(nèi)壓實(shí)封口后埋入地表下2 m貯存,樣品分別于30 d、50 d、70 d取樣檢測(cè)青貯的發(fā)酵特性和化學(xué)成分。對(duì)70 d的青貯微生物種群進(jìn)行分析。

    1.2.2 苜蓿青綠汁發(fā)酵液的制備 收集花蕾期苜蓿250 g,加入等量蒸餾水,在攪拌器中研磨攪拌,然后通過(guò)2層紗布過(guò)濾得到綠汁。將綠汁液500 mL藍(lán)蓋瓶中,加入2%葡萄糖,置于厭氧培養(yǎng)箱37℃厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d得到苜蓿綠汁發(fā)酵液。采用梯度稀釋法測(cè)定活菌數(shù)。

    1.2.3 乳酸菌株的分離與鑒定

    1.2.3.1 乳酸菌株的分離 將苜蓿綠汁發(fā)酵液做標(biāo)準(zhǔn)10倍濃度系列梯度稀釋?zhuān)謩e取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌液100 μL涂于MRS篩選 培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行試驗(yàn),培養(yǎng)基倒置放入37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀(guān)察菌落形態(tài)及是否產(chǎn)生鈣溶圈。用游標(biāo)卡尺測(cè)量培養(yǎng)基中鈣溶圈直徑和菌落直徑,將兩者的比值記為Dd,選取比值較大的菌株進(jìn)一步劃線(xiàn)純化3代獲得單菌落。

    1.2.3.2 乳酸菌株的鑒定 利用微生物16S rDNA通用 引 物27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')、1492R(5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)菌株16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。菌落PCR條件:95℃ 5 min;95℃ 45 s,57℃退火50 s,72℃ 1 min,30循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化回收后送至上海生物技術(shù)有限公司測(cè)序,利用BLAST軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行比對(duì),并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定菌株的種屬。

    1.2.4 青貯添加劑的特性 市售進(jìn)口菌劑宜生貯寶(美國(guó),成分:植物乳桿菌,乳酸片球菌,屎腸球菌,丙酸桿菌,枯草芽胞桿菌,黑曲霉;菌數(shù):≧2.0×1010CFU/g)。按照說(shuō)明書(shū)取0.1 g溶于200 mL水中,按規(guī)格均勻噴施于50 kg苜蓿上。產(chǎn)纖維素酶貝萊斯芽胞桿菌(Bacillus belais)K1和產(chǎn)淀粉酶枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)J1保存于甘肅省工業(yè)微生物菌種保藏中心,保藏號(hào)分別為GSICC 42323和GSICC 78393。K1的羧甲基纖維素酶活性達(dá)到370 U/mL,J1的α-淀粉酶活性達(dá)到110 U/mL。將菌株K1,K2及在苜蓿綠汁發(fā)酵液中篩選到的乳酸菌按照1∶1混合,得到復(fù)合青貯菌劑GSSW。采用梯度稀釋法測(cè)定活菌數(shù),青貯添加量為105CFU/g苜蓿。

    1.2.5 苜蓿青貯樣品理化及發(fā)酵品質(zhì) pH值采用pH計(jì)檢測(cè);氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,NH3-N),總氮(total nitrogen,TN)采用凱氏定氮儀[15];乳酸(lactic acid,LA)、乙酸(acetic acid,AA)及丁酸(butyric acid,BA)含量采用HPLC,KC-811離子色譜柱,柱溫50℃,流動(dòng)相為3 mmol/L HCLO4溶液,進(jìn)樣量5 μL[16];干物質(zhì)(dry matter,DM)含量測(cè)定采用105℃烘干恒質(zhì)量法[17];可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates,WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法[17];粗蛋白含量=總氮×6.2;酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)及木質(zhì)素(lignin,LN)含量的測(cè)定采用纖維素測(cè)定儀。

    1.2.6 青貯樣品微生物多樣性分析 無(wú)菌條件下取苜蓿綠汁發(fā)酵液200 mL及發(fā)酵70 d苜蓿青貯樣品20 g與200 mL無(wú)菌生理鹽水混合,分別在37℃振蕩 2 h 制得菌懸液,無(wú)菌濾膜過(guò)濾獲得微生物菌體,每個(gè)樣品處理3個(gè)重復(fù)。按照Water DNA試劑盒步驟提取微生物總DNA。根據(jù)16S rDNA全長(zhǎng)引物27F和1492R,合成帶有Barcode的特異引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)(SMRT Bell)采用PacBio Sequel進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與 NCBI 基因庫(kù)比對(duì),然后按照 97%相似性水平劃分操作分類(lèi)單元(OTU),選取最優(yōu)序列作為代表性序列,基于OTU分析結(jié)果,對(duì)樣品在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,獲得樣品在門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)學(xué)水平上的物種分布柱狀圖[18]。利用QIIME軟件計(jì)算Alpha多樣性分析研究單個(gè)樣品物種豐度(richness)及物種多樣性(diversity);Beta多樣性(beta diversity)分析比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度[19]。

    1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007軟件整理并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)不同處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素和一般線(xiàn)性模型分析,P<0.05代表差異顯著,P>0.05代表差異不顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 苜蓿綠汁發(fā)酵液中菌株的分離鑒定

    根據(jù)MRS培養(yǎng)基上乳酸菌的菌落形態(tài)差異及鈣溶圈比值大小,挑選Dd比值較大菌株共得到3株,分別為MXLZ-1、MXLZ-2、MXLZ-4,Dd比值分比為8.82、8.39、7.29。通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA片段,測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST同源性分析,選取親緣關(guān)系最近的13個(gè)菌株序列,采用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖1所示。從圖中看出菌株MXLZ-1、MXLZ-2及MXLZ-4的16S rDNA序列分別與小片球菌(Pediococcus parvulus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)及戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)同源性≧99%。因此,菌株MXLZ-1、MXLZ-2及MXLZ-4分別鑒定為P. parvulus、L. plantarum及 P.pentosaceus。

    圖1 菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strains

    2.2 苜蓿青貯

    在無(wú)菌條件下將菌株MXLZ-1、MXLZ-2、MXLZ-4分別接入100 mLMRS培養(yǎng)基,菌株K1、J1分別接入100 mL營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng),5種菌株發(fā)酵液按照1∶1∶1∶1∶1復(fù)配得到500 mL青貯菌劑GSSW。檢測(cè)GSSW青貯菌劑菌數(shù)為1.1×108g/mL。檢測(cè)苜蓿綠汁發(fā)酵液菌數(shù)為2.5×107g/mL。

    2.3 苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)成分變化

    青貯時(shí)間及青貯添加劑對(duì)苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響如表2所示。從表中可以看出,添加菌劑3組DM及CP含量明顯高于CK組(P<0.05);隨青貯時(shí)間的延長(zhǎng),4組DM及CP含量顯著降低;YB組30 d DM含量達(dá)到最高為324 g/kg FM,GSSW組30 d CP含量達(dá)到最高為274 g/kg DM;與發(fā)酵前原料相比,YB與GSSW組CP含量顯著增加。在青貯過(guò)程中WSC含量變化較大,發(fā)酵30 d、50 d時(shí)除CK組外,其余3個(gè)組WSC含量降低,70 d后WSC又有所升高,70 d時(shí)GSSW組WSC含量為67.8 g/kg DM,高于其他3個(gè)組(P<0.05)。添加菌劑GSSW組及YB組ADF、NDF值顯著低于CK組,隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng),添加菌劑3組ADF及NDF顯著降低,而CK組無(wú)明顯變化,50 d后ADF及NDF降低速度緩慢,GSSW組及YB組苜蓿青貯NDF值分別為284、260 g/kg DM,ADF分別為314、323 g/kg DM;青貯過(guò)程中除YB處理組LN值明顯的降低外,其余3組無(wú)明顯變化。

    表2 青貯時(shí)間和青貯添加劑對(duì)苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 2 Effect of time and silage additive on the nutritional quality of alfalfa silage

    2.4 苜蓿青貯發(fā)酵特性及微生物的代謝產(chǎn)物變化

    青貯時(shí)間及青貯添加劑對(duì)苜蓿發(fā)酵品質(zhì)的影響如表3所示。從表中可以看出,除CK組pH降低速度較慢外,其余3個(gè)組pH在發(fā)酵50 d后都能快速的降到5以下;在青貯70 d后GSSW組、YB組 及aFGJ組pH值 分 別 為4.20、4.25、4.80,添加GSSW、YB可有效降低青貯pH值,提高青貯品質(zhì);GSSW組青貯pH的降低速度明顯高于aFGJ組。GSSW組氨氮/總氮含量明顯低于其他組;CK組氨氮含量明顯高于其他組。隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng),GSSW組乳酸含量呈現(xiàn)先降低后輕微升高,而乙酸含量降低的趨勢(shì),在青貯50 d時(shí),乳酸、乙酸含量分別為59.8、11.2 g/kg DM;YB組乳酸含量低于GSSW組而乙酸含量高于YB組;CK組在發(fā)酵30、50 d時(shí)乳酸含量無(wú)明顯的增加而在70 d后顯著增高(P<0.05);YB及GSSW組都未檢測(cè)到丁酸含量,aFGJ組檢測(cè)到丁酸含量明顯低于CK組(P<0.05)。

    表3 時(shí)間和添加劑對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 3 Effect of time and silage additive on the fermentation quality of alfalfa silage

    2.5 苜蓿青貯微生物群落分析

    2.5.1 Alpha多樣性 不同處理組青貯樣品中的多樣性指數(shù)分析如圖2所示,Shannon稀釋曲線(xiàn)顯示曲線(xiàn)已經(jīng)趨于平坦,其覆蓋度均達(dá)到99%以上,表明樣本測(cè)序量已經(jīng)飽和,足夠反映樣本中絕大部分細(xì)菌物種的信息。

    圖2 多樣本的香農(nóng)曲線(xiàn)Fig.2 Multi-samples Shannon curves

    2.5.2 Beta多樣性分析 不同處理組青貯樣品PCoA分析如圖3所示。3個(gè)重復(fù)的樣品點(diǎn)聚集在一起,表示3個(gè)樣品重復(fù)性好,PC1貢獻(xiàn)率為81.1%,PC2的貢獻(xiàn)率為10.7%。CK組落在第一象限,GSSW組和YB組樣品落在第二象限,和其他組樣品的距離相對(duì)較遠(yuǎn),GSSW組與YB組在物種上相似度較高。

    圖3 多樣本的PCOA分析Fig.3 PCoA analysis of multi-samples

    2.5.3 基于屬種水平細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)分析 12個(gè)樣品測(cè)序后通過(guò)Barcode識(shí)別后共獲得89 997條CCS 序列,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生7 387條CCS序列,平均產(chǎn)生7 500條CCS序列。圖中顯示豐度水平前十的物種,并將其他物種合并為Other在圖中顯示。不同處理組青貯樣品屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4-A所示,不同處理組青貯樣品屬種類(lèi)和分布比例有顯著差異,4組屬水平豐度較高的屬均為L(zhǎng)actobacillis及Pediococcus;而添加3種菌劑的處理組,Lactobacillis豐度高于Pediococcus,CK組相反。不同處理組種水平微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4-B所示,圖中豐度大于5%的種中GSSW組微生物群落為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,92.95%);YB組為植物乳桿菌(L. plantarum,85.50%)、戊糖 片 球 菌(Pediococcus pentosaceus,7.63%);aFGJ組 為 植 物 乳 桿 菌(L. plantarum,50.55%)、戊糖 片 球 菌(P. pentosaceus,29.90%)、短 乳 桿 菌(Lactobacillus brevis,8.91%);CK組為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus,49.84%)、植物乳桿菌(L.plantarum,23.83%)、類(lèi)腸膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides,9.71%)、蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii,6.04%)。

    圖4 樣品屬種水平微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community structure of samples on the genus and species level

    不 同 處 理 組L. plantarum,P. pentosaceus,L.brevis及E. mundtii相對(duì)豐度差異顯著;添加3種菌劑的處理組L. plantarum 明顯高于CK組而P.pentosaceus明顯低于CK組;aFGJ組L.brevis明顯高于其他3組;在CK組中E. mundtii豐度明顯高于添加青貯菌劑的3組。

    3 討論

    3.1 苜蓿青貯菌劑的分類(lèi)

    青貯菌劑主要分為發(fā)酵促進(jìn)型添加劑、發(fā)酵抑制型添加劑、好氧性變質(zhì)抑制劑、營(yíng)養(yǎng)性添加劑及吸附劑[20]。其中以乳酸菌類(lèi)添加劑屬于發(fā)酵促進(jìn)型添加劑,通過(guò)調(diào)節(jié)微生物的種類(lèi)及數(shù)量從而促進(jìn)其快速向低溫和低損失的發(fā)酵過(guò)程轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗(yàn)從綠汁發(fā)酵液中通過(guò)產(chǎn)酸能力強(qiáng)的3株菌株經(jīng)16S rDNA檢測(cè)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建確定為P. pentosaceus、L. plantarum及P. parvulus,這一結(jié)果與Li等[21]等報(bào)道的綠汁發(fā)酵液中乳酸菌株包括L. plantarum、L.casei、L. brevis及Streptococcus faecalis等結(jié)果相符。綠汁發(fā)酵液通常會(huì)促生原料上附著的野生乳酸菌株,更適宜于苜蓿青貯。目前市售的青貯菌劑中除乳酸菌外還添加纖維素酶、淀粉酶等或產(chǎn)酶的芽胞桿菌菌株,Bai等報(bào)道[22]在苜蓿青貯中添加產(chǎn)生抗菌肽的B. subtilis可以改善青貯發(fā)酵品質(zhì),提高有氧穩(wěn)定性。Rychen等[23]報(bào)道了在一定劑量下添加解B.belais可以改善青貯有氧穩(wěn)定性。因此,在GSSW菌劑中,除了添加來(lái)自綠汁發(fā)酵液中高產(chǎn)酸野生乳酸菌株外還添加了實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的產(chǎn)纖維素酶的B. belais K1及產(chǎn)淀粉酶的B. subtilis J1,調(diào)節(jié)苜蓿草營(yíng)養(yǎng)成分及微生物的代謝組成。

    3.2 苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)及發(fā)酵品質(zhì)

    青貯過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的微生物活動(dòng)和生物化學(xué)變化問(wèn)題,原料成分會(huì)隨著發(fā)酵不同階段微生物的生長(zhǎng)而成變化。隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng),植物體類(lèi)一系列的酶促反映都會(huì)造成蛋白質(zhì)的水解。70 d時(shí)GSSW組WSC含量高于其他3個(gè)組,菌劑的添加可以促進(jìn)飼草中纖維素類(lèi)物質(zhì)的分解釋放出可被乳酸菌利用的糖,增加可發(fā)酵底物的量;青貯菌劑GSSW及YB組的添加可以提高原料中粗蛋白含量,快速降酸,減少干物質(zhì)及粗蛋白的損失,這一研究結(jié)果與Li等[24]報(bào)道的內(nèi)容一致。GSSW及YB組pH明顯低于CK及aFGJ組,菌劑的添加可以快速降低青貯PH,這與Mariott等[25]的研究結(jié)果相同。有機(jī)酸的總量及構(gòu)成可以反映青貯發(fā)酵品值,優(yōu)質(zhì)青貯飼料乳酸含量>50 g/kg DM,并占總有機(jī)酸60%以上;乙酸含量10-40 g/kg DM;丁酸含量越少或不含丁酸。GSSW及YB組乳酸含量明顯高于CK組,菌劑的添加不僅可以使青貯早期產(chǎn)生較多酸,在青貯后青貯飼料中乳酸含量也高于一般青貯飼料,而丙酸乙酸含量明顯降低。優(yōu)質(zhì)的苜蓿青貯飼料氨態(tài)氮/總氮的比例應(yīng)<15%。GSSW組氨氮/總氮含量明顯低于其他組,菌劑的添加可以減少蛋白質(zhì)的分解,降低氨態(tài)氮/總氮含量,這一結(jié)論與Liu等[26]的研究結(jié)果一致。GSSW及YB菌劑的添加對(duì)于調(diào)整苜蓿營(yíng)養(yǎng)成和改善發(fā)酵品質(zhì)有著顯著地作用。

    3.3 苜蓿青貯微生物群落結(jié)構(gòu)

    在苜蓿青貯過(guò)程中微生物的組成與發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)、青貯組分變化、青貯的品質(zhì)優(yōu)質(zhì)密切的關(guān)系。研究表明青貯發(fā)酵品質(zhì)與發(fā)酵過(guò)程的微生態(tài)演變密切相關(guān)[27]。4個(gè)處理組發(fā)酵70 d苜蓿青貯樣品中豐度較高的屬為L(zhǎng)actobacillis、Pediococcus、Weisella及Enterococcus,這與Tohno等[28]報(bào)道的青貯有關(guān)乳酸菌等相一致。GSSW組種水平乳酸菌株有植物乳桿菌(L. plantarum,92.95%)、戊糖片球菌(P.pentosaceus,2.36%)與GSSW菌劑中的菌株相符,說(shuō)明GSSW菌劑中菌株可以在苜蓿青貯中大量繁殖,適宜于苜蓿青貯并發(fā)揮重要作用。GSSW菌劑復(fù)配時(shí)添加了芽胞桿菌屬菌株,但在青貯發(fā)酵70 d后未檢出,分析原因?yàn)榘l(fā)酵70 d已進(jìn)入發(fā)酵穩(wěn)定階段,厭氧條件下不適宜芽胞桿菌屬菌株生長(zhǎng),芽胞桿菌屬菌株主要是在青貯初期好氧發(fā)酵階段進(jìn)行繁殖。

    添加菌劑處理組L. plantarum 明顯高于CK組而P. pentosaceus明顯低于CK組;L. plantarum屬于兼性異型發(fā)酵乳酸菌,相比于異型發(fā)酵乳酸菌可以更好地利用原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失。GSSW組相比于其他組L. plantarum相對(duì)豐度越高,產(chǎn)酸速度快,乳酸含量高,pH值降低,減少蛋白質(zhì)的分解,降低氨態(tài)氮含量,這一結(jié)果與GSSW組營(yíng)養(yǎng)及發(fā)酵品質(zhì)數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)。青貯70 d樣品中,添加GSSW菌劑及進(jìn)口菌劑YB組pH值分別為4.20、4.25,明顯低于CK組,乳酸含量分別為44.5 g/kg DM、52.3 g/kg DM,明顯高于CK組。Zhao等[29]報(bào)道L. plantarum是青貯中重要菌株,可以快速產(chǎn)酸,為其他乳酸菌的生長(zhǎng)提供酸性環(huán)境。GSSW組及YB組微生物群落結(jié)構(gòu)中L. plantarum均占主要優(yōu)勢(shì),而在自然青貯條件下P. pentosaceus占主要優(yōu)勢(shì),這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了L. plantarum對(duì)青貯pH,乳酸含量影響顯著。不同菌劑處理組中L. plantarum / P.pentosaceus值為GSSW組>YB組>aFGJ組,乳酸含量為GSSW組>YB組>aFGJ組,而pH及氨氮/總氮 為aFGJ組>YB組>GSSW組。L. plantarum / P.pentosaceus值與青貯乳酸含量呈正相關(guān),與pH及氨氮/總氮呈負(fù)相關(guān),比值越高,青貯品質(zhì)越佳。E.mundtii在CK組中相對(duì)豐度明顯高于添加菌劑3組,E. mundtii在發(fā)酵初期與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)可溶性碳水化合物,減緩青貯的酸化,因此,CK組青貯品質(zhì)低于添加菌劑3組。正是由于發(fā)酵過(guò)程中有益乳酸菌群占據(jù)優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位,生成一定量的乳酸從而使pH值快速下降,才使得上述腐敗菌被有效抑制,從而更好地保存發(fā)酵原料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),青貯中微生物的種類(lèi)及數(shù)量對(duì)于青貯品質(zhì)有著顯著地影響。

    4 結(jié)論

    添加青貯菌劑均能增加有益菌的數(shù)量,減少有害菌數(shù)量,改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。苜蓿青貯中L.plantarum及 P. pentosaceus的含量及比值對(duì)青貯優(yōu)良發(fā)酵品質(zhì)和組分變化起著重要作用。GSSW菌劑處理后青貯苜蓿品質(zhì)優(yōu)于與市場(chǎng)在售菌劑YB,可運(yùn)用于苜蓿青貯。

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