豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的制備及其性質(zhì)表征

駱兆嬌，沈曉梅，江軼群，楊娟，王金梅*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.嶺南師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東湛江 524048）

植物甾醇（Phytosterol，PS）是一種廣泛存在于植物細(xì)胞膜中的天然活性成分，具有降低膽固醇、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗炎等生理作用[1-3]。然而，植物甾醇的親脂晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其既不溶于水也不溶于油脂[4]，生物利用度極差，腸道吸收率僅為1.5%～5%[5]。有學(xué)者試圖將酯化后的甾醇摻入高脂食品以提高其生物可及性[6]，但高脂食品的攝入仍存在健康隱患。因此，開發(fā)水溶性和水分散植物甾醇對擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。乳化及包埋是常用的兩種手段。Sarah等[7]構(gòu)建了基于蔗糖單月桂酸酯、丙二醇和油酸乳酸酯的微乳液體系，對植物甾醇顯示出高增溶能力。Cao等[8]通過乳化蒸發(fā)技術(shù)制備了蛋白基植物甾醇納米顆粒，可有效提高甾醇的生物利用率。Meng等[9]以β-環(huán)糊精為包材可將甾醇水溶性提升至8.68 mg/mL。遺憾的是，這些方法在工業(yè)化生產(chǎn)上具有較大的局限性。

白蛋白納米結(jié)合技術(shù)（Nanoparticle albumin-bound technology，Nab）是指在高壓微射流處理下白蛋白分子間二硫鍵發(fā)生交聯(lián)從而形成復(fù)合納米顆粒的藥物輸送技術(shù)，可避免表面活性劑和交聯(lián)劑的使用。美國Abraxis生物科技公司通過Nab技術(shù)制備的水溶性白蛋白結(jié)合型紫杉醇可使紫杉醇的生物可及性提高32%[10]。Nab技術(shù)良好的輸送特性主要?dú)w因于高壓微射流可誘導(dǎo)白蛋白分子二硫鍵的形成與交聯(lián)，形成穩(wěn)定的聚合物殼體保護(hù)活性成分。Liu等[11]人以富含二硫鍵的大豆Bowman-Birk型抑制劑（BBI）為載體通過反溶劑法制備了BBI-姜黃素納米顆粒，明顯提高了姜黃素的水溶性與生物利用度。蛋白質(zhì)-姜黃素之間的疏水相互作用為納米顆粒形成的主要驅(qū)動力。

豆渣作為大豆加工過程中的副產(chǎn)物，仍含有15%左右的蛋白質(zhì)，且這些蛋白質(zhì)疏水性較高，且含有較多的二硫鍵[12,13]，有可能可以作為植物甾醇的一種較為理想的包材。目前關(guān)于豆渣蛋白的研究多集中于蛋白提取、功能性質(zhì)分析與改性方法，應(yīng)用型研究也多限于抗氧化活性肽[14]。本文擬以豆渣蛋白為原料，采用反溶劑技術(shù)結(jié)合高壓微射流處理制備豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒，并對其性質(zhì)進(jìn)行表征，以期提高植物甾醇的生物可及性，擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣粉，Dumas法測定其蛋白含量為15.30%±0.02%（N×6.25，干基），購于山東香馳糧油公司；植物甾醇（PS）購于西安Realin生物科技有限公司，β-谷甾醇82.45%、豆甾醇10.02%，菜油甾醇3.32%及其他成分4.21%。5α-膽甾烷標(biāo)準(zhǔn)品、5,5-二硫基-2-硝基苯甲酸（DTNB）均由阿拉丁實業(yè)有限公司提供（上海，中國）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；Nano-ZS納米粒度分析儀、Mastersizer 3000+EV微米粒度儀，英國Malvern公司；Sonic Ruptor 400超聲細(xì)胞破碎儀，美國OMNI公司；UVA2300紫外可見分光光度計，上海天美公司；T25高速剪切機(jī)，德國IKA公司；M-110EH高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)，美國Microfluidics公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣蛋白的制備

采用堿溶酸沉法提取豆渣蛋白[15]：按照1:20的料液比加入去離子水，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至12，攪拌2 h后離心（8000 r/min×30 min）。用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，離心（8000 r/min×15 min）并洗滌沉淀，用7倍體積的去離子水重新溶解沉淀，回調(diào)pH至7.5，4 ℃透析48 h，冷凍干燥得到豆渣蛋白。蛋白純度為70.48%±0.35%（N×6.25，干基）。

1.3.2 豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的制備

用去離子水配制1%（W/W）的豆渣蛋白溶液，磁力攪拌2 h后調(diào)pH值至7.0，于4 ℃條件下水化過夜。將適量PS溶于無水乙醇，45 ℃水浴攪拌30 min，在6000 r/min剪切速率下將PS溶液于1 min內(nèi)注入豆渣蛋白分散液，剪切3 min后進(jìn)行超聲（功率280 W，時間15 min，間隔70%）后，進(jìn)行高壓微射流均質(zhì)3次（0～120 MPa），離心（1000 r/min×10 min），上清液冷凍干燥即為豆渣蛋白-甾醇納米顆粒（OP-PS）。其中，植物甾醇在終體系的濃度為1 mg/mL。以大豆分離蛋白作為對照（SPI-PS）。

1.3.3 粒度及ζ-電位

取復(fù)合納米顆粒溶液稀釋至1 mg/mL，于25 ℃室溫下測定顆粒平均粒徑（Size）、多分散指數(shù)（PDI）及ζ-電位（ζ-potential），每個平行測定三次。

1.3.4 游離巰基及二硫鍵

游離巰基及二硫鍵的測定參考Beveridge[16]的方法：稱取50 mg納米顆粒樣品溶于10 mL Tris-Gly-Urea緩沖液，離心（8000 r/min，10 min）分別取兩份2 mL上清液：一份加入80 μL的Ellman’s溶液，混勻后放置5 min，在412 nm下測定吸光值（A412）；另一份加入0.2%二硫蘇糖醇（DTT）處理2 h后加入三氯乙酸（TCA），離心后（8000 r/min，10 min）用3 mL緩沖液溶解沉淀，同樣在412 nm下測定吸光值。其中：

游離巰基（SHF）、總巰基（SHT）=73.53×A412/C（μmol/g蛋白質(zhì)）

二硫鍵=（SHT-SHF）/2（μmol/g蛋白質(zhì)）

1.3.5 PS包埋率

參考彭捷[17]的方法測定甾醇的包埋率。

準(zhǔn)確取2 mg樣品于10 mL血清瓶中，加入100 μL 5α-膽甾烷作為內(nèi)標(biāo)，再加入2 mL 2.5 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液后加蓋密封，劇烈震蕩后置于70 ℃皂化1 h。反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫，分別加入1 mL去離子水和3 mL正己烷，加蓋密封。劇烈震蕩3 min，靜置分層，將上層轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中。繼續(xù)用正己烷重復(fù)萃取3次，每次加正己烷2 mL，震蕩1 min，最后合并正己烷層。合并后的正己烷萃取液經(jīng)1 g無水硫酸鈉干燥后，置于氣相色譜的液體進(jìn)樣瓶中，待測。

氣相色譜測定參數(shù)：HP-5柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫300 ℃，進(jìn)口溫度330 ℃，檢測器溫度330 ℃，分流比5:1，氮?dú)饬髁浚?.5 mL/min，上樣量4 μL。采用以下公式對植物甾醇含量進(jìn)行定量計算：

式中：

RRF——相對響應(yīng)因子；

Vi——內(nèi)標(biāo)含量，mg/mL；

Vst——標(biāo)準(zhǔn)品含量，mg/mL；

Ai——內(nèi)標(biāo)峰面積；

Ast——標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；

As——樣品峰面積；

Aps——樣品中植物甾醇的含量，mg/mL；

Az——樣品中甾醇的總添加量，mg/mL；

Ab——樣品中植物甾醇的包埋率，%。

1.3.6 X射線衍射（XRD）

利用D8 ADVANCE衍射器（德國Bruker公司）測定OP-PS凍干粉的結(jié)晶度。將樣品平鋪至玻璃載片上，銅靶Kα輻射（λ=0.15418 nm），狹縫DS=1 mm；Ni濾波片，管壓40 kV，管流40 mA。以0.05步/s的速度從2 °到30 °對測試樣品進(jìn)行連續(xù)掃描。用JADE 5軟件對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.7 儲藏穩(wěn)定性

取OP-PS溶液（10 mg/mL）加入疊氮鈉（0.04%，m/V），密封于帶蓋的玻璃瓶中，室溫貯存50 d，測定其粒徑和甾醇含量變化，測試方法參考1.3.3和1.3.4。

1.3.8 熱穩(wěn)定性

取OP-PS凍干粉分散在緩沖液（pH 7.0）中，攪拌2 h，獲得OP-PS溶液（10 mg/mL）。將溶液密封于帶蓋的玻璃瓶中，分別于90 ℃（水浴鍋）和120 ℃（高壓滅菌鍋）內(nèi)熱處理15 min。熱處理結(jié)束后，冰浴冷卻至室溫，對熱處理后的納米顆粒樣品進(jìn)行粒徑和甾醇含量進(jìn)行測試，測試方法參考1.3.3和1.3.4。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)為三次測定平均值，采用SPSS 16.0方差分析（ANOVA，Duncan）比較樣品平均值間的顯著差異（p<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同均質(zhì)壓力對豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的影響

顆粒在溶液中的尺度及表面電荷數(shù)量與膠體體系的穩(wěn)定性密切相關(guān)。一般而言，粒徑越小且表面電荷多的顆粒越不容易聚集，更趨于穩(wěn)定。圖1a、b反映了不同均質(zhì)壓力下豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的粒徑及電位變化。在未經(jīng)高壓微射流處理時，OP-PS顆粒的粒徑（239.03 nm）較SPI-PS（163.89 nm）大，這可能與豆渣蛋白的溶解性較SPI差有關(guān)。隨著均質(zhì)壓力的增大，OP-PS顆粒的粒徑呈明顯的降低趨勢。經(jīng)120 MPa高壓均質(zhì)3次后，顆粒的粒徑可達(dá)139.28 nm，PDI為0.18，且溶液也較未高壓均質(zhì)的樣品更澄清透明，這意味著高壓微射流處理能顯著減小顆粒尺度，使其具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。Zhang等人[18]在反溶劑制備頭孢呋辛酯納米顆粒時發(fā)現(xiàn)，較高的攪拌速率有利于形成更小且更均勻的藥物顆粒，與本文結(jié)果一致。通常情況下，膠體體系電位的絕對值大于30 mV時被視為穩(wěn)定狀態(tài)[19]。如圖1B所示，SPI-PS和OP-PS體系中電位的絕對值均大于30 mV，表明二者具有不錯的穩(wěn)定性。OP-PS顆粒的ζ-電位絕對值高于SPI-PS，說明OP-PS表面存在更多電荷，更利于借助靜電相互作用維持其體系的穩(wěn)定。

圖1 均質(zhì)壓力對蛋白-植物甾醇納米顆粒粒徑(a)、電位(b)和包埋率(c)的影響Fig.1 Effects of homogenization pressure on size (a), ζ-potential(b) and encapsulation efficiency of protein-phytosterol nanoparticles (p<0.05)

在蛋白基膠體顆粒中，活性物質(zhì)的包埋率是評價輸送體系優(yōu)劣的重要指標(biāo)。如圖1c所示，未經(jīng)高壓均質(zhì)的SPI-PS和OP-PS顆粒中PS的包埋率分別為68.89%和66.84%。在反溶劑過程中，PS在蛋白溶液中迅速分散并通過疏水相互作用與蛋白結(jié)合成可溶性顆粒。對二者進(jìn)行高壓微射流處理后，PS的包埋率得到明顯提高，這可能歸因于高壓微射流較強(qiáng)的機(jī)械效應(yīng)能更好地抑制PS在反溶劑過程中形成較大的晶體而析出。越高的均質(zhì)壓力處理后得到的復(fù)合顆粒粒徑越小也證實了高壓微射流能減少PS聚集。OP-PS經(jīng)120 MPa微射流循環(huán)處理3次后PS的包埋率可提升至98.63%，明顯高于SPI-PS（77.73%）。這可能與豆渣蛋白具有更多的游離巰基，在高壓微射流作用下可形成更多的二硫鍵并發(fā)生交聯(lián)以減少PS的析出有關(guān)。

表1 比較了不同均質(zhì)壓力處理后SPI和OP中游離巰基及二硫鍵的含量。結(jié)果顯示，隨著均質(zhì)壓力的增大，OP中游離巰基含量明顯減少且二硫鍵含量顯著提升。這是因為OP中游離巰基在高壓均質(zhì)產(chǎn)生的超氧化離子的作用下會發(fā)生氧化，形成新的二硫鍵。豆渣蛋白中游離巰基的數(shù)量（6.50 μmol/g蛋白質(zhì)）遠(yuǎn)高于SPI（3.95 μmol/g蛋白質(zhì)），因此經(jīng)過高壓微射流處理后會形成更多的二硫鍵并交聯(lián)，使顆粒的結(jié)構(gòu)更加致密穩(wěn)定。

表1 均質(zhì)壓力對蛋白游離巰基及二硫鍵的影響Table 1 Effects of homogenization pressure on free sulfhydryl group and disulfide bond of protein

2.2 豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的結(jié)構(gòu)分析

對OP-PS納米顆粒進(jìn)行X射線衍射可確定其晶體結(jié)構(gòu)，其衍射圖譜如圖2所示。單純的植物甾醇在7 °和9 °左右會出現(xiàn)較為明顯的結(jié)晶峰，將OP與PS按10:1的質(zhì)量比混合均勻后進(jìn)行XRD分析，結(jié)晶峰的位置與單純的植物甾醇相同。單純的豆渣蛋白在2～30 °內(nèi)并未出現(xiàn)明顯的結(jié)晶峰，OP-PS納米顆粒的XRD圖譜趨近于一條直線，這說明以豆渣蛋白為原料荷載植物甾醇可有效降低其結(jié)晶度，使其以無定型形式存在。一般而言，甾醇的高結(jié)晶度正是其生物利用率低的原因，因此采用高壓微射流技術(shù)制備OP-PS顆粒可能會提高植物甾醇的生物可及性和生物利用率。

圖2 豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的X射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of OP-PS nanoparticles freeze-dried powder

2.3 豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的復(fù)溶特性

表2 比較了新制蛋白-甾醇納米顆粒及凍干樣品復(fù)溶后的平均粒徑、分散指數(shù)和ζ-電位值（樣品均經(jīng)過120 MPa高壓微射流循環(huán)3次）。新制顆粒的平均粒徑在140 nm左右，PDI均未超過0.2，分散性良好。將凍干后的蛋白-甾醇顆粒進(jìn)行復(fù)溶，OP-PS和SPI-PS的粒徑都存在著不同程度的增加，PDI也明顯上升，這表明冷凍干燥會促進(jìn)顆粒聚集與分散性惡化。OP-PS復(fù)溶液粒徑的增加幅度明顯小于SPI-PS，意味著OP-PS的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強(qiáng)于SPI-PS。結(jié)合不同蛋白中游離巰基的數(shù)量分析，OP含有更多的游離巰基，經(jīng)高壓微射流處理后迅速氧化成二硫鍵并交聯(lián)，對PS的保護(hù)作用優(yōu)于SPI，因此凍干后粒徑變化更小。凍干前后，OP-PS顆粒的Zeta電位并無顯著差異，說明凍干處理對顆粒表面電荷數(shù)量影響不大。

表2 蛋白-植物甾醇納米顆粒的平均粒徑（Size）、分散指數(shù)（PDI）、ζ-電位（ζ-potential）Table 2 Size, PDI and ζ-potential of protein-phytosterol nanoparticles

2.4 豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒的穩(wěn)定性

高壓微射流處理能有效提升OP-PS顆粒的穩(wěn)定性。由圖3a可知，經(jīng)高壓微射流處理后的顆粒在常溫儲存過程中粒徑變化幅度較未處理的顆粒小，表明其物理穩(wěn)定性明顯優(yōu)于未處理的顆粒。高壓處理后的顆粒放置50 d后PS損失幅度更小也說明高壓微射流處理有助于提升顆粒的儲藏穩(wěn)定性。高壓微射流處理誘導(dǎo)OP分子間二硫鍵的形成可能是顆粒穩(wěn)定性提升的內(nèi)在原因。在高壓均質(zhì)作用下，OP游離巰基氧化形成分子間二硫鍵，且原有的分子內(nèi)二硫鍵也可能斷裂重新形成分子間二硫鍵并交聯(lián)，進(jìn)而提高顆粒的穩(wěn)定性。經(jīng)120 MPa處理的SPI-PS顆粒在儲藏30 d內(nèi)的粒徑增長幅度始終高于OP-PS，這意味著著OP-PS的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較SPI-PS好。放置50 d后SPI-PS和OP-PS顆粒中PS的包埋率分別由77.73%和98.63%降至57.31%和66.90%，說明在常溫貯藏過程中，PS都存在著不同程度的損失。但無論是新制顆粒還是儲藏50 d后的樣品，以O(shè)P為原料制備的顆粒中PS的包埋率總遠(yuǎn)高于SPI，這表明相較于用SPI荷載PS，以O(shè)P為載體更能減少貯藏過程中PS的損失。這一結(jié)果與高壓微射流能誘導(dǎo)更多二硫鍵形成并交聯(lián)有關(guān)，120 MPa高壓均質(zhì)后的OP-PS顆粒中二硫鍵的數(shù)量（56.42 μmol/g蛋白質(zhì)）遠(yuǎn)高于SPI-PS（36.97 μmol/g蛋白質(zhì)）也印證了這一點(diǎn)。

圖3 蛋白-植物甾醇納米顆粒分散液儲存50 d后的粒徑（a）及甾醇荷載率（b）變化Fig.3 Changes in particle size (a) and encapsulation efficiency(b) of protein- phytosterol nanoparticle dispersion after 50 days of storage different letters represent significant differences among different samples (p<0.05)

熱穩(wěn)定性也是評價顆粒是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)之一，圖4反映了不同蛋白-甾醇顆粒經(jīng)熱處理后平均粒徑及甾醇包埋率的變化。熱處理后OP-PS的粒徑明顯增大且PS包埋率也存在不同程度的降低，這說明高壓微射流處理對顆粒熱穩(wěn)定性的提升效果不大。在90 ℃處理15 min的條件下，OP-PS粒徑明顯高于SPI-PS，這可能是由于豆渣蛋白的熱聚集程度高于SPI，從而導(dǎo)致了更大的顆粒尺度。OP-PS中PS的包埋率總顯著高于SPI-PS，說明OP-PS的耐熱性優(yōu)于SPI-PS，這可能歸因于OP中更多的二硫鍵在高壓微射流處理過程中發(fā)生了交聯(lián)，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖4 蛋白-植物甾醇納米顆粒經(jīng)不同熱處理后的粒徑（a）及甾醇荷載率（b）變化Fig.4 Changes in particle size (a) and encapsulation efficiency of phytosterol (b) of protein-phytosterol nanoparticles after different heat treatments.

3 結(jié)論

采用高壓微射流技術(shù)制備豆渣蛋白-植物甾醇納米顆粒能極大改善植物甾醇的水分散性。隨著均質(zhì)壓力的增加，納米顆粒表現(xiàn)出更小的尺度與更高的甾醇荷載能力，且穩(wěn)定性也得到明顯提升。經(jīng)120 MPa高壓微射流處理3次后的OP-PS顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且包埋率高（98.63%）。與SPI-PS相比，OP-PS的重分散性更好，且穩(wěn)定性更優(yōu)。這是由于OP中更多的游離巰基含量更易于在高壓微射流處理中氧化生成分子間二硫鍵并交聯(lián)，使顆粒的結(jié)構(gòu)更加緊湊穩(wěn)定。