恐傷孕鼠對其子代股骨早期發(fā)育和骨代謝影響?

亓照耀， 楊 帆， 呂孟可， 楊麗萍， 袁海燕， 閆民澤， 張慧娜

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

中醫(yī)自古就對恐、腎、骨三者的關(guān)系有深刻認(rèn)識。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就已提出“腎主骨”理論，其中《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》曰：“腎生骨髓……其志為恐，恐傷腎”?？帜軅I，影響腎先天之精氣[1]?！鹅`樞·本神》又載：“恐懼而不解則傷精，精傷則骨酸痿厥，精時自下。[2]”現(xiàn)代研究提示，恐懼應(yīng)激可激活孕鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸，繼而影響孕鼠健康，表現(xiàn)出糖皮質(zhì)激素(GC)水平升高[3]。恐傷孕鼠會造成其幼年仔鼠情志改變，對仔鼠的一般發(fā)育及神經(jīng)發(fā)育造成不良影響[4，5]。但母代孕期恐懼應(yīng)激導(dǎo)致的“腎精虧虛”是否影響子代骨的早期發(fā)育鮮見報道。

本研究從“恐傷腎，腎主骨”角度探討孕期恐傷刺激對56日齡仔鼠股骨發(fā)育和血清骨代謝指標(biāo)I型膠原羧基端交聯(lián)肽(CTX-I)、骨源性堿性磷酸酶(BALP)和I型前膠原氨基端原肽(PINP)的改變，探索恐傷孕鼠對子代骨發(fā)育的影響，論證“恐傷腎虛致胎損”的中醫(yī)經(jīng)典理論，揭示“胎損”在骨發(fā)育方面的表現(xiàn)及機(jī)制。本研究已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查，倫理許可證號DWLL2018030017。

1 材料與方法

1.1 動物

7周齡Wistar大鼠40只，雌鼠25只，雄鼠15只，其中雄性270～320 g，雌性180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗動物公司提供許可證號SCXK(京)2016-0006。實(shí)驗在河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心進(jìn)行，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20 ℃±5℃、濕度40%±15%和12 h明暗循環(huán)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，首先采用曠場實(shí)驗進(jìn)行行為基線測試，選取基線水平一致且體格較強(qiáng)壯的雄鼠和雌鼠在晚20∶00進(jìn)行合籠，第2天8∶00檢查是否有陰栓，若有則為受孕0.5 d，反之繼續(xù)合籠。將成功受孕的雌鼠20只按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和模型組，所有雄鼠作為電擊鼠用于建立模型，所有仔鼠延續(xù)孕鼠分組飼養(yǎng)至56日齡。

1.2 主要試劑及儀器

CTX-I Elisa試劑盒(伊萊瑞特，E-EL-R1456c)；BALP Elisa試劑盒(伊萊瑞特，E-EL-R0113c)；PINP Elisa試劑盒(伊萊瑞特，E-EL-R1414c)；GC Elisa試劑盒(博士德，KE00022)；微型高速離心機(jī)(美國Labnet，C2500-R-230V)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，ICV-450)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices，F(xiàn)lexstation 3)；熱電ICP電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(美國ARL，ICAP6300)；動物行為學(xué)分析軟件(ANY-maze)(美國Stoeling, Edition 1.0，上海軟隆科技有限公司)；大鼠行為學(xué)檢測設(shè)備(江蘇賽昂斯生物技術(shù)有限公司提供)。

1.3 建模方法

模型組運(yùn)用旁觀電擊法建立妊娠期恐傷大鼠模型[5-7]，用于建立模型的交流電擊箱。交流電擊箱由透明有機(jī)玻璃組成，分為15 cm×15 cm×30 cm的9個小室，中間列3個小室為電擊室，兩側(cè)列6個小室為旁觀室。小室之間有機(jī)玻璃板上有若干直徑為1 cm小孔，在旁觀室靠近電擊室側(cè)有供攀爬逃離電擊的細(xì)鐵絲(電擊室無鐵絲)。旁觀孕鼠為逃避電擊攀爬在鐵絲上，通過聽、視、嗅等捕捉臨近被電擊鼠的恐懼信息，由此給孕鼠產(chǎn)生單純的恐懼心理刺激。建立模型具體操作如下：將電擊雄鼠、旁觀模型組孕鼠分別放入電擊箱相應(yīng)的小室內(nèi)，每2 min鳴響警報聲60 s，鳴響時段均勻給予瞬時20 mA電刺激10次，重復(fù)操作15次，每次總時30 min，每日2次，持續(xù)20 d。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 曠場實(shí)驗 利用動物行為學(xué)分析軟件(ANY-maze)進(jìn)行曠場實(shí)驗。對2組孕7 d、14 d和20 d的孕鼠及按隨機(jī)數(shù)表選取的56日齡仔鼠進(jìn)行心理應(yīng)激評價，測試時間為5 min。黑色曠場測試箱(100 cm×100 cm×45 cm)底面被分為25個正方形小格(20 cm×20 cm)。安靜環(huán)境下，抓住大鼠尾根尖1/3處提起，輕輕放入測試箱正中格，適應(yīng)1 min后，記錄5 min內(nèi)大鼠穿格次數(shù)(雙后肢穿過一格記1分)、直立次數(shù)(雙前肢離地直立一次記1分)、修飾次數(shù)和尿便次數(shù)。

1.4.2 血清生化指標(biāo)和臟器指標(biāo)檢測 模型組孕鼠在孕20 d時行尾靜脈取血，模型組56日齡仔鼠在行為學(xué)檢測實(shí)驗結(jié)束后，適度麻醉經(jīng)腹主動脈取血，靜置30 min后3000r/min離心15 min取血清。冰面上快速剝離雙后肢股骨，在液氮速凍后存置于-80 ℃冰箱保存，所有實(shí)驗大鼠取材后采用斷頭法處死。采用ELISA法測定血清生化指標(biāo)GC、CTX-I、BALP、PINP水平，按試劑盒推薦步驟操作。腎臟臟器系數(shù)的具體計算公式為：腎臟臟器系數(shù)=腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100，即腎臟質(zhì)量在每100 g體質(zhì)量占比。

1.4.3 血清和骨鈣磷水平檢測 取股骨頭樣品進(jìn)行磨細(xì)、過篩(0.25 mm篩)、稱量0.2 g裝入100 mL消煮管底部，加入硝酸5 mL、高氯酸2 mL，200 ℃消煮1 h至澄清，定容至50 mL待測。取血清樣品0.5～1.0 mL按上述方法處理制備待測液。采用ICP電感耦合等離子發(fā)射光譜儀檢測鈣磷水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型評價

表2示，與對照組比較，模型組孕鼠在孕7 d、孕14 d和孕20 d的曠場實(shí)驗水平得分、垂直得分均降低(P<0.05)。建模結(jié)束后，孕20 d GC水平顯著升高(P<0.05)。

表1 2組孕鼠孕7 d和14 d曠場實(shí)驗評分比較(分，

表2 2組孕鼠孕20天曠場實(shí)驗評分和GC水平比較(分，

2.2 仔鼠行為學(xué)與發(fā)育評價

表4示，模型組56日齡仔鼠曠場實(shí)驗水平得分、垂直得分均低于對照組(P<0.05)(表3)，體質(zhì)量減輕，腎臟質(zhì)量和臟器系數(shù)均降低(P<0.05)。

表3 2組仔鼠曠場實(shí)驗評分水平比較

表4 2組仔鼠體質(zhì)量和腎臟發(fā)育情況比較

2.3 仔鼠股骨和骨鈣磷情況

表5示，與對照組比較，模型組56日齡仔鼠雙后肢股骨干重降低(P<0.05)，鈣磷含量也均降低(P<0.05)。

表5 2組仔鼠股骨發(fā)育和鈣磷水平比較

2.4 仔鼠血清鈣磷和骨代謝指標(biāo)水平

表6示，與對照組比較，模型組56日齡仔鼠血清中鈣含量降低(P<0.05)，CTX-I的水平顯著升高(P<0.05)，BALP和PINP的水平均降低(P<0.05)。

表6 2組仔鼠血清鈣磷和骨代謝指標(biāo)CTX-I、BALP、PINP水平比較

3 討論

近年來，情志因素對健康的影響受到越來越多的關(guān)注?！翱謧I”是中醫(yī)七情內(nèi)傷的經(jīng)典論述之一?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論篇》記載：“在臟為腎……在志為恐”，指出“恐”的情志活動與“腎”關(guān)系密切[1]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》也有“腎藏精”“腎主骨”“骨者髓之府”“腎生骨髓”等理論，認(rèn)為腎與骨的生長發(fā)育密切相關(guān)[8]。腎在體合骨生髓，又稱“腎主骨”，骨的生長有賴于骨髓所養(yǎng)，若腎精不足，骨髓生化無源，則骨失所養(yǎng)，這些都表明“恐”與“骨發(fā)育”之間的關(guān)系密切。

本研究使用改進(jìn)的旁觀電擊法建立孕期恐懼應(yīng)激大鼠模型。建立模型時，旁觀鼠在恐懼心理狀態(tài)下攀爬箱體躲避電擊的同時，又可通過視、聽、嗅覺獲得恐懼信號，加強(qiáng)應(yīng)激效果且避免大鼠遭受實(shí)質(zhì)性傷害，其模型的重現(xiàn)性高，適合建立單純慢性恐懼心理應(yīng)激模型[3]。慢性恐懼應(yīng)激可致HPA軸過度激活,使血清中GC含量升高，可作為評價慢性應(yīng)激程度的可靠指標(biāo)。研究表明，恐傷孕鼠的HPA軸激活，促腎上腺皮質(zhì)激素和GC水平均升高[3，4]。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組孕鼠行為學(xué)評價異常，GC水平升高，提示恐傷孕鼠模型建立成功。

腎主藏精，主生長發(fā)育。既往研究表明，恐傷孕鼠不僅對子代仔鼠的發(fā)育[3,9]、情志及空間學(xué)習(xí)等能力具有調(diào)控作用[7,10]，而且影響腦部神經(jīng)遞質(zhì)水平[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組56日齡仔鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量減輕和行為學(xué)異常，提示恐懼應(yīng)激影響了子代發(fā)育和情志。從中醫(yī)理論來講，母孕期受恐，傷及其腎，致使腎精不足，“先天有虧，子氣應(yīng)之”，子所蘊(yùn)先天之精氣不足影響其生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，仔鼠的腎臟質(zhì)量和股骨干重減輕，臟器系數(shù)降低，提示母鼠孕期恐傷腎導(dǎo)致的腎精虧虛影響子代的正常生長和股骨的發(fā)育。

骨骼是代謝活躍的組織，PINP和CTX-I是敏感的骨形成及骨吸收指標(biāo)[11，12]。鈣、磷是骨礦物質(zhì)中最基本的元素，在骨基質(zhì)鈣化過程中具有重要作用，其減少影響骨骼的發(fā)育[13]。正常情況下機(jī)體通過血鈣與骨鈣的交換來維持血鈣相對穩(wěn)定，當(dāng)血鈣濃度升高時鈣可向骨沉積，當(dāng)血鈣濃度降低時骨鈣會轉(zhuǎn)移到血液中導(dǎo)致骨鈣流失，可能引起骨代謝紊亂[14，15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組仔鼠血清鈣含量降低，骨中鈣磷含量也出現(xiàn)降低，提示模型組仔鼠的股骨質(zhì)量減輕的原因可能與骨鈣磷減少有關(guān)。

骨轉(zhuǎn)換是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等緊密合作的骨骼代謝動態(tài)過程[16，17]。骨代謝生化指標(biāo)是骨組織分解與合成的中間產(chǎn)物，相比骨密度檢測更靈敏。骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)比較敏感，是評價骨早期發(fā)育的重要方法[18，19]。骨基質(zhì)蛋白90%以上是Ⅰ型膠原，PINP是骨形成中Ⅰ型原膠原代謝成膠原的中間產(chǎn)物，可敏感而特異性地反映成骨細(xì)胞活性，在應(yīng)用中有重要意義[20]。CTX-I是骨吸收過程中Ⅰ型膠原降解產(chǎn)物，可特異性地反映破骨細(xì)胞活性[21，22]。BALP由成骨細(xì)胞分泌，可以促進(jìn)骨基質(zhì)鈣化。舊骨被吸收，鈣磷釋放至血液，在新骨重建時BALP促進(jìn)血中鈣磷重新沉著于新建的骨組織。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組仔鼠血清CTX-I升高，PINP和BALP出現(xiàn)降低，表明模型組仔鼠的骨吸收速度高于骨生成速度，這提示骨代謝平衡出現(xiàn)異常，骨流失增強(qiáng)。而且骨鈣化速度也減慢，可能是為了進(jìn)一步彌補(bǔ)血鈣流失。模型組仔鼠的骨吸收增快，可能也是股骨質(zhì)量降低的主要原因，進(jìn)而影響了骨發(fā)育進(jìn)程。恐懼刺激可能是通過影響腎臟發(fā)育進(jìn)而引起骨發(fā)育和代謝的紊亂，但其具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。

綜上所述，恐傷孕鼠的子代不僅情志認(rèn)知改變，而且骨代謝也出現(xiàn)紊亂，腎精虧虛是造成這種紊亂的原因之一。這為“腎主骨”“恐傷腎”的中醫(yī)經(jīng)典理論提供了客觀實(shí)驗依據(jù)，也為中藥防治腎經(jīng)虧虛導(dǎo)致的骨發(fā)育異常提供參考。