海洋紅冬孢酵母分泌蛋白的鑒定及其在番茄 采后生物防治中的應(yīng)用

孫丹丹，張曉君，路來(lái)風(fēng)，楊 瑩，喬麗萍，王昌祿

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

生物防治指利用生物物種間的相互關(guān)系，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物的方法。利用安全且具有拮抗活性的微生物進(jìn)行果蔬病害生物控制的方法，被認(rèn)為采后領(lǐng)域最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一[1]。研究已經(jīng)分離和篩選出了上千種拮抗微生物菌株，這些菌株包括了具有拮抗作用的細(xì)菌、小型絲狀真菌和酵母菌等[2-3]，可以有效控制果蔬采后主要病害[4-5]。

利用拮抗微生物防治果蔬采后病害的效果取決于生防制劑的篩選、開發(fā)和應(yīng)用過(guò)程[6]。環(huán)境中包含眾多潛在的生防因子，而一般有效的生防因子制劑需要能夠與果蔬建立密切的關(guān)系，進(jìn)而有效抑制病原菌的擴(kuò)展；通過(guò)抑制病原菌發(fā)育，使病原菌易于被優(yōu)勢(shì)微生物區(qū)系攻擊或殺死；同時(shí)，能夠在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)定植并達(dá)到足以有效防治的密度，從而發(fā)揮對(duì)病原菌的控制作用和保護(hù)果蔬免受采后病害侵染[1,7]。微生物能在傷口處迅速定植，并且不會(huì)引發(fā)宿主劇烈的免疫反應(yīng)是它能作為生防制劑的前提，而目前缺乏關(guān)于拮抗微生物與果蔬建立密切關(guān)聯(lián)機(jī)制的系統(tǒng)性研究。

海洋紅冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenumFell & Tallman）作為海洋中存在的一中抗逆性很強(qiáng)的天然真菌，對(duì)多種果蔬的多種采后病害具有良好抑制效果，明顯抑制鏈格孢、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、擴(kuò)展青霉、指狀青霉、多毛孢等多種病原微生物在冬棗、番茄、蘋果、柑橘、葡萄等果實(shí)上引起的病變和腐敗[8-9]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)和誘導(dǎo)果實(shí)抗病等是R. paludigenum生物防治采后病害的主要作用機(jī)制[10-11]。R. paludigenum能通過(guò)在果實(shí)傷口處的快速生長(zhǎng)，迅速占據(jù)水果傷口表面的空間，并調(diào)控果實(shí)局部和系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮限制致病菌對(duì)果實(shí)組織營(yíng)養(yǎng)的目的。

果蔬采后病原菌等死體營(yíng)養(yǎng)型致病菌在與寄主之間建立寄主關(guān)系時(shí)會(huì)分泌大量的降解酶類，幫助病原菌侵入和定植于果蔬組織，同時(shí)降解酶可以分解這些果蔬組織的高分子質(zhì)量組分，產(chǎn)生病原菌能夠代謝的營(yíng)養(yǎng)[12]。本研究擬參考果蔬采后病原菌與寄主之間建立寄主關(guān)系的方式，選取具有優(yōu)良采后生物防治效果的R. paludigenum為研究對(duì)象，通過(guò)解析其分泌蛋白信息，探究拮抗微生物與番茄之間建立宿主關(guān)系的方式及其中的相關(guān)機(jī)制，旨在為強(qiáng)化拮抗微生物防治制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用果實(shí)均為新鮮（收獲時(shí)間，1～2 d）的紅熟期番茄（Solanum lycopersicum），采摘于天津市東麗經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)溫室試驗(yàn)果園。選取外觀無(wú)機(jī)械傷口、大小均勻一致的果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1～2 min，用自來(lái)水沖洗并在室溫下放干后備用。

R. paludigenumFell & Tallman（IMI 394084）分離自中國(guó)東海近海海域，并經(jīng)英國(guó)國(guó)際微生物所菌種保存和鑒定中心鑒定。將適量活化后的菌種挑入到100 mL番茄液體培養(yǎng)基（番茄果肉25 g，加水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min）中，于200 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)36 h。

病原菌為B. cinerea，分離自腐爛番茄果實(shí)表面。挑取適量的霉菌孢子，在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基斜面上劃線，置于培養(yǎng)箱中，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)在培養(yǎng)好的霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到適量0.05%吐溫-20溶液中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整至1×104spores/mL 待用。

異硫氰酸胍、糜蛋白酶、幾丁質(zhì)、昆布多糖、蘋果果膠、Chitin Azure 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶 美國(guó)Promega公司；尿素、三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇 糖醇 美國(guó)Bio-Rad公司；胰蛋白酶蛋白酶、天冬氨酸激酶（均為質(zhì)譜級(jí)） 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive UHMR（超高質(zhì)量數(shù)范圍）組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1 000 nL級(jí)液相色譜儀 美國(guó) 賽默飛世爾科技公司；BX-60熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；HYG-IIa型迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；Allegra X-30型臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1R. paludigenum分泌蛋白質(zhì)譜鑒定與生物信息學(xué)分析

R. paludigenum分泌蛋白質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)委托上海中科新生命生物科技有限公司開展，具體實(shí)驗(yàn)流程如下：R. paludigenum分泌蛋白經(jīng)過(guò)還原和烷基化處理后，加入胰蛋白酶（質(zhì)量比1∶50），在37 ℃條件下酶解20 h。蛋白質(zhì)分裝，保存于－80 ℃冰箱。各取樣品20 μg（可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整上樣量）進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色（或者銀染），判斷樣品裂解情況。酶解產(chǎn)物脫鹽后凍干，復(fù)溶于0.1%三氟乙酸溶液中，－20 ℃保存待用。質(zhì)譜分析A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸-84%乙腈溶液。色譜柱以95% A液平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣至Trap柱。對(duì)于復(fù)合的樣品采用1H梯度。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集：每次全掃描后采集20 個(gè)碎片圖譜（MS2Scan）。采用Bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

R. paludigenum分泌蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析按照聶燕芳等[13]方法，用Signal P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）[14]、WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）[15]、Target P（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php）[16]、TMHMM（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）[17]和big-PI Predictor（http://gpcr2.biocomp.unibo.it/predgpi/pred.htm）[18]軟件對(duì)質(zhì)譜鑒定得到的拮抗酵母胞外蛋白氨基酸序列進(jìn)行經(jīng)典分泌蛋白的預(yù)測(cè)分析，利用Secretome P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）軟件對(duì)拮抗酵母非經(jīng)典分泌蛋白進(jìn)行分析，將氨基酸序列 NN-score＞0.6（人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法）的蛋白質(zhì)定義為非經(jīng)典分泌蛋白[19]。

1.3.2R. paludigenum分泌蛋白抑菌實(shí)驗(yàn)

在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度B. cinerea孢子懸浮液、R. paludigenum發(fā)酵上清液鹽析蛋白混合物和番茄空白培養(yǎng)基上清液鹽析蛋白混合物，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)18 h，觀察B. cinerea芽管長(zhǎng)度和萌發(fā)率，以評(píng)估R. paludigenum分泌蛋白對(duì)B. cinerea發(fā)育的影響。

1.3.3 番茄果實(shí)采后病理學(xué)實(shí)驗(yàn)

將R. paludigenum發(fā)酵液于9 000×g、4 ℃條件下離心20 min，獲得發(fā)酵上清液與菌體沉淀物，將收集到的菌體沉淀物用無(wú)菌水清洗2 次以充分除去培養(yǎng)基，重新懸浮在pH 6.5磷酸緩沖液中，冰浴超聲5 min后，于25 000×g、4 ℃條件下離心20 min，即獲得酵母胞內(nèi)上清液。利用不同飽和度(NH4)2SO4溶液同時(shí)對(duì)酵母發(fā)酵上清液和胞內(nèi)上清液進(jìn)行鹽析，低溫（4 ℃）靜置過(guò)夜后于8 000×g離心30 min，即分別獲得R. paludigenum酵母分泌蛋白和胞內(nèi)蛋白混合物。

用消過(guò)毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)的頂部形成統(tǒng)一大小（5 mm）和盡可能相同的深度（2 mm）的傷口2 個(gè)。每個(gè)果實(shí)第1傷口中加入等量（50 μL）的R. paludigenum酵母分泌蛋白或胞內(nèi)蛋白，果實(shí)第2傷口中加入等量的番茄液體培養(yǎng)基上清液鹽析蛋白混合物或無(wú)菌水作為對(duì)照。在25 ℃恒溫恒濕條件下誘導(dǎo)48 h后，在果實(shí)表面鄰近原傷口5 mm處形成一個(gè)新的傷口，接入30 μLB. cinerea病原菌懸液（1×104spores/mL）。在恒溫（25 ℃）恒濕條件下貯藏，每天定時(shí)記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑。

1.3.4 拮抗酵母分泌蛋白中寡聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定

按照盧黃娉[20]方法用二硝基水楊酸法測(cè)定拮抗酵母分泌蛋白中葡聚糖酶活性，葡聚糖酶活性以每毫升蛋白溶液每小時(shí)產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量表示；按照De Los Santos-Romero等[21]方法，用可見分光光度法測(cè)定拮抗酵母分泌蛋白中幾丁質(zhì)酶活性，幾丁質(zhì)酶活性以每毫升蛋白溶液每小時(shí)OD570nm增加0.01為1 個(gè)單位（U）；按照Lu Laifeng等[22]方法，用二硝基水楊酸法測(cè)定拮抗酵母分泌蛋白中果膠酶活性，果膠酶活性以每毫升蛋白溶液每小時(shí)產(chǎn)生的D-半乳糖醛酸的質(zhì)量表示。利用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)得蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS/PC ver. II. x軟件（Statistical Product and Service Solutions）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)組內(nèi)比較個(gè)數(shù)為3 個(gè)及3 個(gè)以上時(shí)，數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析（P＜0.05，差異顯著）；當(dāng)組內(nèi)個(gè)數(shù)為2 個(gè)時(shí)，采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)進(jìn)行平均數(shù)分離。每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理至少設(shè)3 個(gè)以上重復(fù)，并按照完全隨機(jī)區(qū)組原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。采用Origin 7.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 R. paludigenum經(jīng)典與非經(jīng)典分泌蛋白鑒定與預(yù)測(cè)分析

利用QE質(zhì)譜儀對(duì)酵母胞外蛋白混合物進(jìn)行鑒定 （圖1）。選取Uniprot_Rhodotorula_40850_20171211.fasta為對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，脲甲基化為固定修飾，氧化和磷酸化為可變修飾，使用MASCOT等質(zhì)譜匹配軟件對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，共計(jì)獲得1 632 條目標(biāo)蛋白質(zhì)多肽序列。其中，UniPepCount為1和2的蛋白分別共計(jì)1 346 個(gè)和147 個(gè)，合計(jì)占比91.48%（圖1A）。80%左右的氨基酸數(shù)目占對(duì)應(yīng)目標(biāo)蛋白質(zhì)全長(zhǎng)比例在5%以內(nèi)，另有20%左右的蛋白覆蓋程度高于5%，即在此樣品中該蛋白的峰度可能相對(duì)高些，但是沒(méi)有絕對(duì)量化的標(biāo)準(zhǔn)（圖1B）。

圖1 R. paludigenum發(fā)酵上清液蛋白Unique肽段數(shù)量分布（A）和 肽段序列覆蓋度（B）圖Fig. 1 Distribution of the number of unique protein sequences (A) and coverage of peptide sequences (B) in the fermentation supernatant of R. paludigenum

利用UniParc數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）獲取蛋白質(zhì)一級(jí)氨基酸全長(zhǎng)序列。參照經(jīng)典分泌蛋白的4 個(gè)特征[13]：1）具有N-端信號(hào)肽；2）亞細(xì)胞定位為胞外分泌類型，不含有細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)及其他亞細(xì)胞預(yù)測(cè)定位信號(hào)；3）無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；4）無(wú)糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定位點(diǎn)對(duì)R. paludigenum發(fā)酵上清液中的蛋白混合物進(jìn)行篩選，除去冗余或者番茄屬（Lycopersicon）等其他來(lái)源蛋白質(zhì)。

首先，利用Signal P軟件對(duì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到的1 632 條蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明有114 個(gè)氨基酸序列具有分泌型信號(hào)肽，占總數(shù)的6.99%。其次，使用WoLF PSORTRU軟件對(duì)具有信號(hào)肽的114 個(gè)分泌性蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明104 個(gè)蛋白質(zhì)分泌到胞外，屬于胞外蛋白類型。利用Target P進(jìn)一步對(duì) WoLF PSORT預(yù)測(cè)的104 個(gè)分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證分析，得到100 個(gè)含有分泌型信號(hào)肽的蛋白質(zhì)，所占比例為 96.2%。結(jié)合TMHMM Server對(duì)以上100 個(gè)含有分泌型信號(hào)肽的蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜區(qū)判斷，結(jié)果表明有81 個(gè)蛋白質(zhì)沒(méi)有跨膜螺旋，具有典型分泌蛋白的特征。最后，利用big-PI Predictor軟件對(duì)上述81 個(gè)沒(méi)有跨膜螺旋的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明58 個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸序列不具有GPI錨定位點(diǎn)，具有經(jīng)典分泌蛋白的特征，另有23 個(gè)蛋白質(zhì)具有GPI 錨定位點(diǎn)，不符合經(jīng)典分泌蛋白的特征。綜合上述不同生物信息學(xué)軟件的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到的R. paludigenum發(fā)酵上清液中有58 個(gè)具有經(jīng)典分泌特征的蛋白質(zhì)，占比3.56%（表1）。

表1 R. paludigenum經(jīng)典分泌蛋白序列信息Table 1 Sequence information of classical secretory proteins in R. paludigenum

結(jié)合UniParc數(shù)據(jù)庫(kù)58 個(gè)具有經(jīng)典分泌特征的R. paludigenum分泌蛋白的人工注釋信息，發(fā)現(xiàn)40 個(gè)已知功能蛋白，18 個(gè)未知功能蛋白。碳水化合物酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）類蛋白是指參與碳水化合物合成和降解的重要酶類，其作為分泌蛋白中的一大類，是植物病原菌侵染過(guò)程中突破寄主植物細(xì)胞壁的關(guān)鍵因素，主要包括糖基水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物結(jié)合模塊及輔助模塊酶類6 類。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R. paludigenum分泌蛋白中含有藻膠裂解酶和β-葡萄糖苷酶等18 個(gè)CAZymes類蛋白，占比31.0%，其中包括糖基水解酶14 個(gè)、多糖裂解酶3 個(gè)、碳水化合物酯酶1 個(gè)（表2）。

表2 R. paludigenum經(jīng)典分泌蛋白的功能注釋分析Table 2 Functional annotation analysis of classical secretory proteins in R. paludigenum

此外，利用 Secretome P 2.0 Server軟件，對(duì)R. paludigenum發(fā)酵上清液中不具有信號(hào)肽的1 518 條氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，有433 個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸序列符合非典型分泌蛋白的特征，占目標(biāo)蛋白質(zhì)多肽序列總數(shù)的26.6%。其中，包括糖苷水解酶26家族蛋白、甲殼素脫乙酰酶和蛋白磷酸聚糖5等蛋白。

2.2 R. paludigenum分泌蛋白對(duì)B. cinerea發(fā)育的影響

為了研究分泌蛋白在R. paludigenum與B. cinerea互作過(guò)程中的功能，本研究將R. paludigenum分泌蛋白混合物與B. cinerea孢子進(jìn)行共同培養(yǎng)（圖2）。結(jié)果表明，相對(duì)于番茄液體培養(yǎng)基上清液鹽析所得的蛋白混合物而言，R. paludigenum分泌蛋白可以有效抑制B. cinerea孢子的發(fā)育過(guò)程。添加0.1%（體積分?jǐn)?shù)）R. paludigenum分泌蛋白處理組，B. cinerea孢子萌發(fā)率為（21.1±2.81）%，較對(duì)空白照組降低了31.4%。

圖2 R. paludigenum分泌蛋白對(duì)B. cinerea萌發(fā)的抑制情況Fig. 2 Inhibition of spore germination of B. cinerea by secretory proteins of antagonistic yeast R. paludigenum

2.3 分泌蛋白在R. paludigenum與番茄建立關(guān)聯(lián)中的作用

微生物區(qū)系與宿主之間存在互利共生關(guān)系，因此宿主組織往往是潛在生防因子的有效來(lái)源。宿主免疫系統(tǒng)可以不間斷監(jiān)測(cè)其微生物區(qū)系，通過(guò)調(diào)整抗性反應(yīng)機(jī)制與微生物之間達(dá)到微妙平衡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R. paludigenum分泌蛋白參與介導(dǎo)了微生物區(qū)系與宿主之間的動(dòng)態(tài)識(shí)別過(guò)程，即番茄果實(shí)可以有效識(shí)別R. paludigenum的分泌蛋白，并作出溫和與適當(dāng)?shù)拿庖唔憫?yīng)（圖3）。R. paludigenum的分泌蛋白處理可以有效降低番茄果實(shí)傷口周圍組織處灰霉病的發(fā)生幾率，其病斑直徑和發(fā)病率分別為4.22 mm和19.4%，較無(wú)菌水對(duì)照組顯著降低了70.5%和30.6%，而較番茄液體培養(yǎng)基上清液（未發(fā)酵）鹽析蛋白處理組而言分別顯著降低了86.7%和72.3%。

圖3 R. paludigenum分泌與胞內(nèi)蛋白對(duì)番茄抗病性的影響Fig. 3 Effect of intracellular and extracellular proteins of R. paludigenum on disease resistance of tomato fruits

2.4 不同飽和度(NH4)2SO4鹽析對(duì)R. paludigenum分泌蛋白誘導(dǎo)番茄抗病性的影響

向R. paludigenum發(fā)酵上清液中加入不同質(zhì)量(NH4)2SO4，使之達(dá)到不同的飽和度，沉淀之后分別測(cè)定酵母分泌蛋白混合物誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗灰霉病的能力，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度在0%～80%范圍內(nèi)時(shí)，R. paludigenum分泌蛋白混合物中能誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗病的活性蛋白分子較少，其處理組后的果實(shí)灰霉病發(fā)病率與對(duì)照組幾乎無(wú)顯著差別。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度達(dá)到90%時(shí)，R. paludigenum分泌蛋白混合物中能誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗病能力顯著增加，經(jīng)90%飽和度鹽析所得R. paludigenum分泌蛋白混合物處理后，番茄果實(shí)傷口周圍組織灰霉病發(fā)病率和發(fā)病程度受到顯著抑制，果實(shí)組織發(fā)病率僅為49.9%，較對(duì)照組降低了50.1%。

圖4 不同飽和度鹽析R. paludigenum分泌蛋白對(duì) 番茄灰霉病的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effect on gray mold of gradient salting-out fractions of secretory proteins of antagonistic yeast R. paludigenum

2.5 R. paludigenum分泌蛋白中3 種CAZymes活性分析

對(duì)比分析R. paludigenum與B. cinerea分泌蛋白中葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和寡聚半乳糖醛酸酶3 種關(guān)鍵的CAZymes活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同體積中B. cinerea葡聚糖酶和寡聚半乳糖醛酸酶活性顯著高于拮抗酵母，特別是寡聚半乳糖醛酸酶活性（表3）。B. cinerea分泌蛋白中的寡聚半乳糖醛酸酶活性為1.121 μg/mL，而R. paludigenum分泌蛋白中的寡聚半乳糖醛酸酶活性僅為0.014 μg/mL。因此，R. paludigenum在果實(shí)表面和傷口處的定植不會(huì)對(duì)果實(shí)組織細(xì)胞壁造成太大的損傷。而R. paludigenum分泌蛋白中的幾丁質(zhì)酶活性為3.867 U，較B. cinerea組高出 14.85 倍，而這可能是R. paludigenum分泌蛋白能夠直接抑制B. cinerea發(fā)育的原因。

表3 R. paludigenum與B. cinerea分泌蛋白中3 種CAZymes活性比較Table 3 Activities of three CAZymes in R. paludigenum and B. cinereasecretory proteins

3 討 論

健康的果蔬等植物組織中生活著多種多樣但分類學(xué)結(jié)構(gòu)不同且具有宿主特異性的微生物群落，它們可以在果蔬等植物組織表面或者組織內(nèi)部定植[23-25]。微生物之間、微生物與宿主之間的相互合作賦予果蔬宿主的健康優(yōu)勢(shì)，包括促進(jìn)果實(shí)品質(zhì)、成熟衰老、抗逆性和對(duì)病原菌的抵抗力等[23]。本研究所用到的R. paludigenum是一種能夠防治多種果蔬采后病害的拮抗微生物[8,20]。前期研究表明，R. paludigenum在接種到櫻桃番茄傷口后迅速繁殖，24～48 h后櫻桃番茄果實(shí)傷口處的酵母數(shù)量是接種時(shí)的50～100 倍；R. paludigenum接種到冬棗傷口后迅速繁殖，24～48 h后冬棗果實(shí)傷口處的酵母數(shù)量是接種時(shí)的50～150 倍，以上兩種情況都很好地抑制了采后病原菌鏈格孢菌的侵染，且不會(huì)引起傷口的過(guò)敏反應(yīng)[8]。此外，R. paludigenum還可以定植于柑橘、蘋果、梨和番茄等果實(shí)表面或者傷口處，并有效防治柑橘果實(shí)采后綠霉、酸腐病害，蘋果、梨采后青霉病害和櫻桃番茄采后黑斑病害等發(fā)生[20,26]，可以初步證實(shí)R. paludigenum能夠通過(guò)定植過(guò)程與果蔬建立互惠互利式的宿主關(guān)系。

單獨(dú)施用拮抗酵母R. paludigenum分泌蛋白可以有效增強(qiáng)傷口周圍組織抵抗B. cinerea侵染的能力，同時(shí)未引發(fā)細(xì)胞程序性死亡等宿主劇烈的免疫反應(yīng)，證明分泌蛋白參與了拮抗酵母R. paludigenum與宿主番茄果實(shí)建立密切關(guān)聯(lián)關(guān)系的過(guò)程。其中，CAZymes類蛋白，例如寡聚半乳糖醛酸酶等糖基水解酶、多糖裂解酶，可能參與了R. paludigenum在果實(shí)表面的定植與識(shí)別過(guò)程，介導(dǎo)其與番茄果實(shí)之間建立宿主關(guān)系。為使根瘤菌感染豆科植物根，植物需要通過(guò)外源寡聚半乳糖醛酸激活結(jié)瘤信號(hào)通路和NIN轉(zhuǎn)錄因子激活果膠裂解酶（LjNPL）對(duì)自身的細(xì)胞壁進(jìn)行局部降解，以形成植物侵染點(diǎn)，以便在微生物與植物之間建立關(guān)系[27]。同理，糖基水解酶、多糖裂解酶等蛋白可以有助于拮抗酵母局部解聚果膠等果實(shí)細(xì)胞壁多糖組分，為拮抗酵母在果實(shí)表面或者傷口處定植提供定植位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。同時(shí)，寡聚半乳糖醛酸等微生物定植過(guò)程中產(chǎn)生的植物細(xì)胞壁多糖酶解組分，可以作為植物損傷相關(guān)分子模體被果蔬等宿主識(shí)別，激活植保素累積、抗性蛋白響應(yīng)以及活性氧爆發(fā)等防御過(guò)程[28]。另外，擬南芥表面受體蛋白AtRLP42也可以直接識(shí)別多種真菌果膠酶進(jìn)而激活植物體對(duì)腐生型病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis的抗性[29]。值得注意的是，不同微生物分泌蛋白中果膠水解酶與裂解酶的組成與比例會(huì)影響所產(chǎn)生寡糖的聚合度和占比等，而因寡糖聚合度不同其誘發(fā)的宿主抗性響應(yīng)也有不同[30]。探究不同微生物糖基水解酶、裂解酶等蛋白酶產(chǎn)生順序、組成及其酶解產(chǎn)物的種類與功能研究有助于揭示果蔬等宿主識(shí)別拮抗微生物和病原微生物的具體機(jī)制。

除參與微生物與宿主之間的互作過(guò)程外，R. paludigenum分泌蛋白還介導(dǎo)了其與病原菌之間的互作關(guān)系。酵母細(xì)胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、脂類和無(wú)機(jī)物（磷酸鹽等）構(gòu)成。其中，幾丁質(zhì)僅出現(xiàn)于出芽痕中，出芽結(jié)束后被葡聚糖和甘露糖所覆蓋。紅酵母屬、隱球酵母屬、拿遜酵母屬等絲狀酵母出芽痕較多，細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量相應(yīng)較高，但遠(yuǎn)低于采后病原真菌等絲狀真菌。采后病原真菌等霉菌細(xì)胞壁一般為幾丁質(zhì)組成，有的含有纖維素[31]。由此推論，環(huán)境中的高濃度幾丁質(zhì)水解酶會(huì)優(yōu)先限制絲狀真菌的細(xì)胞壁合成過(guò)程，進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)繁殖。R. paludigenum分泌蛋白中含有較高濃度的幾丁質(zhì)酶等糖基水解酶，推測(cè)參與了抑制B. cinerea孢子的萌發(fā)過(guò)程，幫助拮抗酵母競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和宿主潛在定植位點(diǎn)，抑制病原菌對(duì)寄主的侵入方式等。前期研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)可以增加R. paludigenum分泌包括幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶在內(nèi)的胞外水解酶，并顯著提高了其對(duì)多種果實(shí)的采后病原真菌的防治效力[32]，側(cè)面印證了以上推論，在培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)、葡聚糖和果膠等大分子糖類推測(cè)適用于多種生防制劑的病害防治功能強(qiáng)化。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)R. paludigenum通過(guò)分泌CAZymes等蛋白質(zhì)與番茄果實(shí)開展互利合作，控制病原微生物在果實(shí)傷口等位置的發(fā)育，有效保持了采后果蔬的健康狀態(tài)。其中，R. paludigenum需要通過(guò)分泌低濃度的寡聚半乳糖醛酸酶等糖基水解酶、多糖裂解酶等蛋白，在不損傷果實(shí)組織的情況下與番茄果實(shí)建立宿主關(guān)系；同時(shí)，通過(guò)分泌高濃度的幾丁質(zhì)酶等糖基水解酶，抑制B. cinerea生長(zhǎng)與發(fā)育。不過(guò)，由幾丁質(zhì)水解酶酶解病原真菌細(xì)胞壁所產(chǎn)生的寡糖分子進(jìn)一步引發(fā)的宿主免疫響應(yīng)可能會(huì)同時(shí)對(duì)拮抗微生物和病原微生物的生存造成威脅。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的指數(shù)式發(fā)展，植物（果蔬）微生物組學(xué)成為學(xué)科熱點(diǎn)和交叉前沿。有益微生物及其組合促進(jìn)植物在各種環(huán)境下保持健康狀態(tài)，深入了解其功能和作用機(jī)制，將在采后貯藏保鮮中有著巨大的應(yīng)用潛力。