內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物與自噬關(guān)系的研究進(jìn)展

李 藝，孫大偉，崔德榮

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海 200233

自噬（autophagy）由Ashford 和Porter 在1962 年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有“自吃”的現(xiàn)象后提出［1］，是指雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬小體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬是細(xì)胞應(yīng)激條件下支持生存的生理機(jī)制之一［2］。自噬具有多種生理功能，包括耐受饑餓，清除細(xì)胞內(nèi)折疊異常的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)聚合物、受損或多余的細(xì)胞器，促進(jìn)發(fā)育和分化，延長壽命，清除微生物等［3］。自噬功能障礙與眾多疾病相關(guān)，包括神經(jīng)系統(tǒng)的帕金森病、阿爾茨海默病，肌肉系統(tǒng)的Danon 病、溶酶體沉積癥，肺組織的囊性纖維瘤，胰腺的急性胰腺炎和糖尿病，消化組織的克羅恩病以及免疫組織的免疫相關(guān)反應(yīng)等［4］。

內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）最初被發(fā)現(xiàn)能夠協(xié)助內(nèi)體膜內(nèi)陷形成多泡體（multivesicular body，MVB），促進(jìn)被泛素標(biāo)記的膜蛋白的降解［5-6］。有關(guān)線蟲、蠅類和哺乳動(dòng)物的研究［7］表明，抑制ESCRT 的表達(dá)不僅阻礙內(nèi)體的形成，也導(dǎo)致未成熟自噬小體結(jié)構(gòu)的積累。ESCRT通過抑制自噬降解，參與多種神經(jīng)退行性疾病的形成［8-10］，說明ESCRT 對(duì)自噬的調(diào)控具有重要作用。本文就ESCRT 對(duì)巨自噬、微自噬的調(diào)控以及ESCRT 與自噬相關(guān)蛋白的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 自噬及自噬流

1.1 自噬的分類

根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)被運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同，將自噬過程分為3種：①巨自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的膜包繞待降解物形成自噬小體，然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物。②微自噬，溶酶體的膜直接包裹長壽蛋白等，并在溶酶體內(nèi)降解。③分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone mediated autophagy，CMA），胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化［11］。

巨自噬是游離膜包裹細(xì)胞質(zhì)的一部分（包括細(xì)胞器等）形成一個(gè)自噬小體，外膜與溶酶體相融合并將內(nèi)部物質(zhì)進(jìn)行降解。巨自噬可以是非選擇性的，通常在饑餓的條件下觀察到，細(xì)胞質(zhì)蛋白被催化分解為游離的氨基酸；也可以是選擇性的，由胞質(zhì)連接蛋白介導(dǎo)，將待降解物與自噬系統(tǒng)連接起來。這種機(jī)制對(duì)細(xì)胞分解代謝以及降解可能有害的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)（包括病原體，積聚的蛋白質(zhì)或者受損的細(xì)胞器）來說都是非常重要的。微自噬是溶酶體直接吞噬并消化胞質(zhì)中待降解物質(zhì)，其既可以不加區(qū)別地包裹細(xì)胞內(nèi)可溶性成分，也可以高度選擇性地降解特定的細(xì)胞器，例如線粒體、過氧化物酶體以及部分細(xì)胞核。CMA 是具有高度選擇性的，并且只能降解一些特定蛋白而不能降解細(xì)胞器，這些被降解的蛋白都含有特定的氨基酸序列且能被分子伴侶熱休克同源蛋白70（heat shock cognate protein 70，HSC70）或其復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合，隨后底物蛋白和分子伴侶復(fù)合物被直接運(yùn)送到溶酶體內(nèi)。

1.2 自噬流

當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激后，細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)胞質(zhì)成分被雙層膜包裹與胞質(zhì)分隔，形成自噬小體，隨后這些自噬小體和晚期內(nèi)體或溶酶體融合形成自噬溶酶體，在自噬溶酶體中將包裹的胞質(zhì)成分降解或循環(huán)再利用于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持。因此，自噬可以分為幾個(gè)步驟：雙層隔離膜的形成（成核），隔離膜的延伸（延伸），自噬小體的形成和運(yùn)輸（成熟），自噬小體與溶酶體之間的對(duì)接和融合（融合）以及降解溶酶體內(nèi)胞質(zhì)（降解）［12］，這一完整的過程稱之為自噬流（圖1）；其中，任何一個(gè)步驟阻斷都會(huì)造成自噬流受損。

圖1 自噬流過程及其內(nèi)體途徑Fig 1 Schematic illustration of autophagic flux and its endosome pathway

2 ESCRT與自噬的關(guān)系

2.1 ESCRT概述

ESCRT 主要負(fù)責(zé)膜的剪切［13-14］，在許多細(xì)胞生理過程中都發(fā)揮著重要的作用，包括胞質(zhì)分裂、神經(jīng)元修建、質(zhì)膜修復(fù)、質(zhì)膜出芽小泡的形成、核被膜維護(hù)、內(nèi)體分揀和細(xì)胞自噬、病毒復(fù)制和出芽等［15］。

ESCRT 由4 個(gè)亞復(fù)合物（ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ，以及ESCRT-Ⅲ）以及一些輔助蛋白［液泡分選蛋白4 （vacuolar protein sorting 4，VPS4）、VTA1（vesicle trafficking 1）等］組成（表1）。其在內(nèi)體膜上的招募順序已經(jīng)確定，首先是位于最上游的ESCRT-0 招募ESCRT-Ⅰ，隨后ESCRT-Ⅰ和-Ⅱ在內(nèi)體上結(jié)合，ESCRT-Ⅱ通過激活ESCRT-Ⅲ亞單位VPS20 實(shí)現(xiàn)ESCRT-Ⅲ聚合。最后VPS4拆解ESCRT-Ⅲ復(fù)合物以實(shí)現(xiàn)其亞單位的回收利用。ESCRT-Ⅲ是最終促進(jìn)膜結(jié)構(gòu)變化的亞復(fù)合物，而上游組件ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ負(fù)責(zé)招募ESCRT-Ⅲ到細(xì)胞內(nèi)的特定位點(diǎn)［16］。各亞復(fù)合物對(duì)自噬的影響也不盡相同，干擾ESCRT-0 的表達(dá)對(duì)自噬結(jié)構(gòu)形成影響最小，而抑制ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致自噬結(jié)構(gòu)形成障礙，尤其是在干擾ESCRT-Ⅲ和VPS4的表達(dá)后，表明它們是自噬結(jié)構(gòu)形成中最重要的ESCRT成分［17］。

表1 酵母和人類的ESCRT復(fù)合物及其相關(guān)分子同源基因命名對(duì)照Tab 1 Nomenclature of ESCRT and ESCRT-associated orthologs between yeast and human

2.2 ESCRT與巨自噬

巨自噬過程可以分為5個(gè)階段，包括自噬誘導(dǎo)、自噬小體成核、自噬小體膜延伸、自噬小體雙層膜閉合、自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體［18］。ESCRT 相關(guān)基因突變體中普遍存在自噬小體的積累［7］，可由以下2種原因?qū)е拢阂皇亲允杉せ?，自噬流增?qiáng)，自噬小體形成增多；二是自噬流受阻，自噬小體尚未來得及降解而造成堆積。

在形成成熟自噬小體之前，雙層膜需要閉合，這個(gè)過程與ESCRT 調(diào)控的膜剪切在空間結(jié)構(gòu)上基本相同。為了區(qū)分閉合和未閉合的自噬小體雙層膜，Takahashi 等［17］發(fā)明了HaloTag-LC3自噬小體閉合實(shí)驗(yàn)，在共聚焦顯微鏡下通過不同顏色的熒光表達(dá)來區(qū)分雙層膜閉合前后的自噬小體。在抑制ESCRT-Ⅲ亞單位CHMP2A的表達(dá)后，鏡下觀察到未閉合的自噬小體數(shù)目明顯增加，而成熟的自噬小體數(shù)目減少，說明CHMP2A 的表達(dá)缺失阻礙了自噬小體雙層膜的關(guān)閉，ESCRT在雙層膜閉合階段有直接的參與作用。Zhen 等［19］隨后發(fā)現(xiàn)另一ESCRT-Ⅲ亞單位——CHMP4B，在雙層膜閉合前被招募到未成熟的自噬小體周圍；活細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察到CHMP4B 短暫地停留了1～2 min，而在干擾上游分子CHMP2A 的表達(dá)后，CHMP4B 的停留時(shí)間顯著延長。上述研究提示，自噬小體雙層膜的閉合可能需要多個(gè)ESCRT 亞單位協(xié)同作用參與調(diào)節(jié)，但是由于目前的siRNA 篩選只能針對(duì)單個(gè)ESCRT 基因，因此下一步研究可著眼于ESCRT 聯(lián)合突變對(duì)自噬小體雙層膜閉合的影響，更充分全面地驗(yàn)證ESCRT各亞單位在其中扮演的角色。

高級(jí)真核細(xì)胞中，自噬小體在與溶酶體融合之前可以和早期或晚期內(nèi)體結(jié)合形成自噬內(nèi)體。有研究［20］證實(shí)，ESCRT 的突變導(dǎo)致自噬小體積累的另一個(gè)可能原因是自噬內(nèi)體形成障礙。ESCRT 相關(guān)AAA-ATP 酶SKD1（即VPS4 的小鼠同源蛋白）能夠?qū)SCRT 從內(nèi)體膜上解離下來，并參與自噬內(nèi)體的成熟過程。HeLa 細(xì)胞中過表達(dá)SKD1可以抑制內(nèi)體向自噬小體的運(yùn)輸，這一過程發(fā)生在溶酶體融合之前，同時(shí)晚期內(nèi)體的標(biāo)記蛋白溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acid，LBPA）不再出現(xiàn)在自噬小體結(jié)構(gòu)中，說明自噬內(nèi)體的形成受阻，繼而提示SKD1能夠調(diào)控自噬小體和內(nèi)體的融合，ESCRT 在這一階段有參與作用。在果蠅的卵巢卵泡細(xì)胞和脂肪體中抑制VPS4 的表達(dá)后也得到了相同的結(jié)果［21］，即VPS4 的缺失能夠影響自噬通路?？梢娫谧允蛇M(jìn)程中，ESCRT 的ATP酶VPS4也發(fā)揮重要作用。之后的實(shí)驗(yàn)研究中，研究人員降低了VPS28 （ESCRT-Ⅰ）、VPS25 （ESCRT-Ⅱ） 或VPS32（ESCRT-Ⅲ）的表達(dá)，同樣觀察到了自噬小體數(shù)目的增加。上述研究提示，ESCRT 各亞單位（ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ）及其ATP 酶VPS4 在自噬內(nèi)體成熟的過程中都是不可缺少的。

成熟自噬小體形成后，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，完成降解。有研究［21］發(fā)現(xiàn)，ESCRT復(fù)合物可以促進(jìn)自噬小體與溶酶體的融合。溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1，LAMP1）是溶酶體的標(biāo)記物，在野生型幼蟲的自噬溶酶體能夠觀察到LAMP1 與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-自噬相關(guān)基因8（autophagy related gene 8，ATG8）（自噬標(biāo)記分子）的共定位，而在沉默VPS25 的表達(dá)后，GFP-ATG8 聚集的結(jié)構(gòu)和LAMP1 標(biāo)記的結(jié)構(gòu)并不相同，提示在沒有功能性ESCRT 的情況下，自噬小體和溶酶體之間缺乏融合，無法完成下一步的降解，導(dǎo)致自噬小體堆積。利用mCherry-GFP-LC3B自噬雙標(biāo)系統(tǒng)也可以觀察自噬小體和溶酶體的融合。在腫瘤易感基因101（tumor susceptibility 101，TSG101）或VPS24 敲低表達(dá)的細(xì)胞中，指示自噬溶酶體的紅色熒光減少，而指示自噬小體的黃色熒光增多，這表明自噬小體與溶酶體融合減少，ESCRT功能障礙會(huì)抑制自噬溶酶體的形成。

現(xiàn)有報(bào)道集中于探究ESCRT突變體中自噬流的改變。近來1 篇有關(guān)阿爾茨海默病的報(bào)道［22］驗(yàn)證了疾病發(fā)生發(fā)展過程中， TAU 蛋白/MAPT （microtubule associated protein tau）的積累引起ESCRT-Ⅲ亞單位IST1 表達(dá)下降。進(jìn)而導(dǎo)致自噬小體與溶酶體融合障礙以及自噬小體增多。因?yàn)樽允闪髡系K本身就會(huì)引起TAU 蛋白積累，研究人員在人Mapt轉(zhuǎn)基因小鼠上調(diào)了IST1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不僅減輕了自噬缺陷，TAU 蛋白的積累也減少了，認(rèn)知功能得到改善。說明通過在自噬相關(guān)疾病中探究并調(diào)控ESCRT 相關(guān)分子的表達(dá)，可以延緩疾病進(jìn)展。目前，類似上述研究的報(bào)道較少，有望成為新的重點(diǎn)研究方向。

以上報(bào)道表明，ESCRT 參與了巨自噬中自噬小體雙層膜閉合、自噬小體和內(nèi)體融合以及自噬溶酶體的形成等過程，對(duì)自噬流的通暢發(fā)揮了重要的功能。溶酶體形成也是自噬流過程中必不可少的一步，而MVB 是溶酶體形成過程中出現(xiàn)的小體，提示ESCRT 功能障礙也可能影響溶酶體發(fā)生，但現(xiàn)有的研究無法提供直接證據(jù)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 ESCRT與微自噬

目前，微自噬的膜動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制尚未被闡明，但已有研究表明這個(gè)過程中有ESCRT 相關(guān)分子的參與。動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體在植物細(xì)胞和酵母中被稱為液泡。液泡是細(xì)胞質(zhì)中泡狀的結(jié)構(gòu)，內(nèi)含液體，周圍有薄膜使液泡與細(xì)胞質(zhì)分開。有研究［23］證明，酵母細(xì)胞的膜蛋白VPH1在液泡腔中可通過微自噬進(jìn)行降解；ESCRT的通道蛋白VPS27 在微自噬激活后，轉(zhuǎn)位于液泡膜上，在VPS27表達(dá)減少的細(xì)胞中VPH1的降解減少，而在重新表達(dá)VPS27的重要分子結(jié)構(gòu)域后VPH1的降解恢復(fù)；繼而表明VPH1 進(jìn)入液泡進(jìn)行降解需要VPS27 的參與，ESCRT在微自噬過程中能夠協(xié)助待降解物進(jìn)入液泡，與其中的膜重塑過程密切相關(guān)，起到關(guān)鍵性作用。

有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微自噬的最新研究［24-25］報(bào)道，ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ蛋白和VPS4蛋白的敲低會(huì)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微自噬，其中驗(yàn)證的ESCRT 分子包括VPS2 （ESCRT- Ⅲ）、 VPS23 （ESCRT-Ⅰ）、 VPS24（ESCRT-Ⅲ）、SNF7（ESCRT-Ⅲ）等；并且發(fā)現(xiàn)SNF7 能夠短暫地與含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組件的內(nèi)陷囊泡頸部相結(jié)合，提示ESCRT 可能通過調(diào)控溶酶體膜最后的剪切參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微自噬過程中。

還有研究人員在鼠樹突狀細(xì)胞的內(nèi)體中發(fā)現(xiàn)了一種類似于微自噬的降解機(jī)制［26］。與發(fā)生在溶酶體的CMA 不同，這種被稱為內(nèi)體微自噬（endosomal microautophagy，eMI）的機(jī)制出現(xiàn)在MVB 形成過程中，依賴于ESCRT-Ⅰ和Ⅲ來形成囊泡，由分子伴侶HSC70介導(dǎo)蛋白降解物的分選，并通過靜電作用與內(nèi)體膜相互識(shí)別，在晚期內(nèi)體中降解或者與溶酶體融合。在降低TSG101（ESCRT-Ⅰ）和VPS4 的表達(dá)后，晚期內(nèi)體對(duì)胞質(zhì)蛋白的攝取和降解均減少，溶酶體內(nèi)卻沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，這說明阻礙MVB 的生成確實(shí)會(huì)影響待降解物運(yùn)輸?shù)絻?nèi)體。在黑腹果蠅中也存在這種機(jī)制，研究［27］顯示其可以通過延長饑餓時(shí)間來誘導(dǎo)eMI。之后科研人員在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了新的eMI［28］——一種特殊的線粒體清除途徑，待降解的線粒體在ESCRT 的參與下進(jìn)入早期內(nèi)體。內(nèi)體成熟后，將線粒體運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解，在這個(gè)過程中ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ都有參與。

這些研究成果均表明ESCRT 在微自噬中也參與了膜重塑、膜剪切等過程，并在其中發(fā)揮重要的作用，影響自噬進(jìn)程。

2.4 ESCRT與ATG蛋白的相互作用

自噬形成所需的20 多種基因被稱為ATG。ESCRT 也可以通過與ATG蛋白相互作用間接對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)。在自噬過程中，自噬調(diào)節(jié)因子可以與ESCRT 亞基相互聯(lián)系，促進(jìn)內(nèi)體成熟，進(jìn)而推動(dòng)自噬小體與MVB融合［29］。在一項(xiàng)有關(guān)基礎(chǔ)自噬的研究中［30］，研究人員通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)ESCRT 相關(guān)蛋白PDCD6IP/ALIX 與促進(jìn)自噬溶酶體形成的自噬復(fù)合物ATG12-ATG3有強(qiáng)大的相互作用，ALIX 在與ATG12-ATG3 結(jié)合后，會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，有利于它對(duì)內(nèi)體的成熟進(jìn)行調(diào)控；說明ESCRT除了直接參與自噬過程中膜融合、膜剪切的階段外，也可以和自噬相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬過程。

最近在植物中發(fā)現(xiàn)了一種ESCRT 亞單位——FREE1（FYVE domain protein required for endosomal sorting 1）［31］，F(xiàn)REE1 表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致異常MVBs 的產(chǎn)生，引起膜蛋白回收利用障礙。同時(shí)FREE1突變體內(nèi)自噬小體數(shù)目增加，自噬小體或自噬內(nèi)體與液泡的融合均發(fā)生障礙，說明FREE1影響了自噬進(jìn)程。進(jìn)一步研究［32］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)REE1通過N-末端結(jié)構(gòu)域與植物ESCRT-Ⅰ亞單位VPS23結(jié)合，調(diào)節(jié)MVBs的形成，并通過C-末端結(jié)構(gòu)域與調(diào)節(jié)植物自噬的特殊因子SH3P2（SH3 domain-containing protein 2）連接調(diào)控自噬。此外，免疫共沉淀結(jié)果也顯示它能和自噬相關(guān)蛋白ATG6以及SH3P2相互作用［33］。研究人員推測FREE1可能是通過SH3P2招募到自噬小體，促進(jìn)自噬小體成熟或者募集參與內(nèi)體和自噬小體融合的調(diào)節(jié)因子，表明ESCRT亞單位可通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白進(jìn)而影響自噬流。

3 總結(jié)與展望

自噬功能障礙與許多人類疾病（如癌癥、神經(jīng)退行性變、免疫性疾病等）相關(guān)，因此增加對(duì)自噬調(diào)節(jié)機(jī)制的理解至關(guān)重要。ESCRT 通過對(duì)自噬的調(diào)節(jié)，參與疾病的發(fā)展，這無疑為自噬機(jī)制以及相關(guān)疾病的研究開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。同時(shí)在微觀上，通過研究ESCRT 在自噬小體雙層膜閉合、自噬小體與內(nèi)體或溶酶體融合等過程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，進(jìn)一步理解了巨自噬和微自噬的相關(guān)膜動(dòng)力分子學(xué)機(jī)制。雖然已有研究證實(shí)了ESCRT在不同類型自噬進(jìn)程中的膜閉合、膜剪切以及膜融合等階段發(fā)揮了重要功能，多個(gè)ESCRT 亞單位可協(xié)同作用參與其中，但目前沒有研究涉及ESCRT 亞單位聯(lián)合突變對(duì)自噬產(chǎn)生的影響，ESCRT 對(duì)自噬前信號(hào)通路以及溶酶體形成的調(diào)節(jié)機(jī)制也尚未闡明，并且有關(guān)自噬相關(guān)疾病中ESCRT 亞單位表達(dá)改變的研究也較少。通過深入探究兩者間的相互聯(lián)系，ESCRT 有望成為調(diào)控自噬流的新靶點(diǎn)。