miR-146a-5p 表達與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎腸道損傷嚴重程度的相關(guān)研究

陳江龍，陳 砼，呂志寶，王雪莉，盛慶豐

1.上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院普外科，上海 200062；2.上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科，上海 200062

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是發(fā)生在新生兒特別是早產(chǎn)兒中的一種較為常見的死亡率較高的胃腸道急癥。研究［1-3］顯示，NEC 在全世界活產(chǎn)兒中的總發(fā)病率為0.03%～0.24%，在胎齡22～28 周早產(chǎn)兒的發(fā)病率為7%～13%，在出生體質(zhì)量低于1 500 g 的早產(chǎn)兒中的發(fā)病率約為6.9%。且另有研究［4］發(fā)現(xiàn)NEC患兒的死亡率極高，即平均約為40%；盡管針對新生兒的營養(yǎng)和支持技術(shù)不斷提升，但該類患兒的死亡率仍超過30%。目前，有關(guān)NEC 的發(fā)病機制尚未被明確，臨床治療手段有限，一般以禁食、胃腸減壓、抗感染、營養(yǎng)支持等保守治療為主；一旦發(fā)生胃腸道穿孔壞死，只能采取手術(shù)治療，且效果并不理想。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由19～25 個核苷酸組成的非編碼RNA。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在NEC 的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，如miRNA 可參與調(diào)控NEC 發(fā)病過程中的炎癥通路、與NEC 的預(yù)后相關(guān)、可作為NEC 的早期診斷指標等［5-7］。近年來的研究［8-11］發(fā)現(xiàn)，miR-146a是一種抗炎性miRNA（包括miR-146a-5p、miR-146a-3p），可參與調(diào)控新生動物腸道固有免疫與腸道炎癥。本研究通過檢測NEC 患兒腸道中miR-146a-5p 的表達水平，分析其與腸道組織病理評級之間相關(guān)性，并比較miR-146a-5p 高表達與低表達患兒在不同臨床資料中的分布，為NEC 腸道損傷程度提供判定指標，并為闡明NEC腸道損傷的機制提供新的研究思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象及其資料、標本收集

選擇2014 年1 月—2018 年12 月于上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院救治的NEC 患兒和腸閉鎖（intestinal atresia，IA）患兒為研究對象。收集NEC 患兒的外科手術(shù)腸道組織標本17 例，分別于標本的炎癥缺血壞死邊緣處、手術(shù)腸道切口邊緣處取一小塊組織，記為NEC 炎癥組（NECinflamed 組）和NEC 未受影響組（NEC-unaffected 組），所有標本的取材均需避免完全壞死處的組織。收集IA 患兒的外科手術(shù)腸道組織標本22 例，設(shè)為對照組（即為IA組）。

同時，收集上述患兒的臨床資料，包括性別、孕周、出生體質(zhì)量、喂養(yǎng)方式、C 反應(yīng)蛋白濃度（C-reaction protein，CRP）、中性粒細胞和淋巴細胞比率（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、腸道切除長度、住院天數(shù)和預(yù)后情況等。

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：2018RY027-E01），所有標本的獲取均已取得患兒監(jiān)護人的同意并簽署了知情同意書。

1.2 NEC動物模型建立及組織標本獲取

選取5～7 日齡SPF 級C57BL/6J 新生小鼠24 只及母鼠6 只（購自上海杰思捷實驗動物有限公司），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004。采用隨機數(shù)字表將新生小鼠分為NEC 造模組和對照組，每組12 只。新生小鼠及母鼠均飼養(yǎng)于SPF 級動物房中，使用許可證號：SCXK（滬）2018-0004。母鼠飼以顆粒飼料，自由食水，12 h照明/12 h 黑暗，晝夜循環(huán)。采用人工配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激的方法飼養(yǎng)NEC 造模組新生小鼠［12-15］，具體操作如下：每4 h 喂養(yǎng)1 次人工配方奶（30%雅培動物配方奶），喂養(yǎng)后1 h 將新生小鼠置于氮氣罐中90 s 行缺氧處理，而后于4 ℃冰箱內(nèi)10 min行冷處理；每日需操作2次，連續(xù)處理4 d。嚴密觀察小鼠的生存狀況并記錄其每日的體質(zhì)量，如出現(xiàn)NEC 典型癥狀（嚴重腹脹、血便、發(fā)紺等），則斷頸處死小鼠；如無上述癥狀，則于96 h 后處死小鼠。對照組新生小鼠由母鼠喂養(yǎng)96 h后，斷頸處死。收集2組小鼠的末端回腸組織標本。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實驗動物管理及倫理委員會審批（審批號：2018040）。

1.3 組織標本的蘇木精-伊紅染色及病理評級

將各組新生小鼠的末端回腸組織標本及各組患兒腸道組織標本置于4%多聚甲醛中固定，而后行乙醇梯度脫水、石蠟包埋。切片厚度為4 μm。分別經(jīng)蘇木精、伊紅染色（武漢塞維爾生物科技有限公司），中性樹膠封片。于顯微鏡下鏡檢，并拍攝圖片進行分析。

采用雙盲法，參考Caplan 等［12］與Pisano 等［16］的評級方法，由2 位病理科醫(yī)師依據(jù)小鼠組織標本的蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H-E staining，H-E 染色）結(jié)果，獨立對腸道組織破壞程度進行病理評估。具體評級如下：0 級為腸道無損傷，腸組織黏膜絨毛、固有層等結(jié)構(gòu)清晰正常；1 級為腸道輕度損傷，絨毛尖部輕微損傷或輕微黏膜下層或固有層分離，炎性細胞浸潤；2 級為腸道中度損傷，部分絨毛丟失或中度黏膜下層或固有層分離，或黏膜下層和肌層水腫，較多炎性細胞浸潤；3 級為腸道中度損傷，重度黏膜下層或固有層分離，或嚴重黏膜下層和肌層水腫，大量炎性細胞浸潤；4 級為絨毛消失，腸壁全層壞死。當組織病理評級=1 級，認為可疑NEC 發(fā)生；≥2 級，認為新生小鼠NEC 造模成功。

1.4 組織標本中miR-146a-5p的定位及表達

采用原位雜交的方法檢測各組新生小鼠的末端回腸組織標本及各組患兒腸道組織標本中miR-146a-5p 的定位及表達，具體步驟參照RNA 熒光原位雜交試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）的說明書。實驗中所用探針序列為5′-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3′-FAM，濃度為1 μmol/L，孵育溫度為37 ℃，時間為16 h，可較好地避免脫靶效應(yīng)。隨后，于顯微鏡下觀察，將與DAPI 共表達的帶有綠色熒光信號的細胞記為陽性細胞；隨機選擇3 個視野，將陽性細胞數(shù)量的平均值作為該標本的陽性細胞統(tǒng)計數(shù)，其統(tǒng)計數(shù)即為miR-146a-5p 表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。定性資料以頻數(shù)表示，采用χ2檢驗或Fisher’s 精確概率法進行分析。采用Pearson相關(guān)系數(shù)對NEC 患兒腸道中miR-146a-5p 表達水平與腸道組織病理評級進行相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠組織標本的H-E染色與病理評級

對2 組新生小鼠的末端回腸組織標本進行H-E 染色，并由病理科醫(yī)師針對染色結(jié)果進行組織病理評級。結(jié)果（圖1）顯示，對照組小鼠的組織病理評級均為0 級，而NEC 造模組小鼠為1～4級不等（其中，1級雖為可疑NEC發(fā)生，但因該級小鼠也存在腸道損傷，因此將其歸為NEC造模組）。

圖1 2組小鼠末端回腸組織標本的H-E染色（×100）及組織病理評級Fig 1 H-E staining(×100)and histopathological grade of terminal ileum tissue samples of mice in the two groups

2.2 小鼠組織標本中miR-146a-5p的表達

采用原位雜交檢測2 組小鼠末端回腸組織標本中miR-146a-5p 的定位與表達，結(jié)果（圖2）顯示NEC 造模組小鼠的miR-146a-5p 主要表達于腸道固有層，且其在該組小鼠的表達水平高于對照組（P=0.000）。

圖2 原位雜交檢測2組小鼠末端回腸組織標本中miR-146a-5p的表達Fig 2 Expression of miR-146a-5p in terminal ileum tissue samples of mice in the two groups by in situ hybridization

2.3 患兒組織標本的H-E染色

對NEC 患兒和IA 患兒的腸道組織標本行H-E 染色，結(jié)果（圖3）顯示NEC炎癥組患兒的腸道組織絨毛斷裂或溶解、黏膜下層和肌層水腫、炎癥細胞浸潤及腸道全層溶解壞死等情況較NEC未受影響組和IA組更為嚴重。

圖3 3組患兒腸道組織標本的H-E染色（×100）Fig 3 H-E staining of intestinal tissue samples in the three groups(×100)

2.4 患兒組織標本中miR-146a-5p的表達

采用原位雜交檢測NEC 患兒和IA 患兒的腸道組織標本中miR-146a-5p 的定位與表達，結(jié)果（圖4）顯示所有患兒的miR-146a-5p均主要表達于固有層中，且其在NEC炎癥組的表達水平高于NEC 未受影響組和IA 組（均P=0.000）。

圖4 原位雜交檢測3組患兒腸道組織標本中miR-146a-5p的表達Fig 4 Expression of miR-146a-5p in intestinal tissue samples of children in the three groups by in situ hybridization

2.5 NEC 患兒miR-146a-5p 表達與腸道組織病理評級及臨床資料之間相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)系數(shù)對NEC患兒標本中miR-146a-5p表達水平與組織病理評級進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）顯示二者呈正相關(guān)（P=0.015，r=0.578）。根據(jù)NEC 患兒腸道組織標本中miR-146a-5p 的表達水平，將其分為高表達（陽性細胞數(shù)≥100 個）與低表達（陽性細胞數(shù)＜100個），并就其二者在不同臨床資料中分布進行比較，結(jié)果（表1）顯示miR-146a-5p高表達患兒中腸道切除長度≥5 cm的人數(shù)較miR-146a-5p低表達患兒更多（P=0.005）。

表1 NEC 患兒腸道組織標本中miR-146a-5p 高表達與低表達在不同臨床資料中的分布比較Tab 1 Comparison of high and low expression of miR-146a-5p in intestinal tissues samples of NEC children in different clinical data

圖5 NEC患兒腸道組織標本中miR-146a-5p表達水平與組織病理評級的相關(guān)性分析Fig 5 Correlation analysis between expression of miR-146a-5p and histopathological grade in intestinal tissues samples of children with NEC

3 討論

研究［17-20］顯示，早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量、配方奶喂養(yǎng)、感染與紅細胞輸注等是NEC 發(fā)生的主要危險因素。Bazacliu 等［21］發(fā)現(xiàn)，NEC 患兒存在著較多的短期及長期并發(fā)癥，如顱內(nèi)出血、短腸綜合征、神經(jīng)發(fā)育損害、全身發(fā)育不良或遲緩等。臨床上，NEC 以全身性系統(tǒng)性的瀑布炎性反應(yīng)和廣泛的腸道壞死穿孔為特征，可累及腸道出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤，黏膜下水腫出血，絨毛結(jié)構(gòu)破壞，嚴重者將出現(xiàn)腸道全層壞死穿孔［22］。NEC 腸道損傷包括2個方面：一是腸道組織結(jié)構(gòu)的完整性，即腸道破壞程度，反映了炎癥對腸道絨毛等屏障的破壞情況；本研究中我們采用基于H-E 染色的組織病理評級進行評估。二是腸道損傷范圍，即腸道穿孔壞死的長度；本研究中我們采用腸道切除長度加以分析。

既往研究［23］發(fā)現(xiàn)，miR-146a 在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的炎癥性腸病中參與腸道免疫與腸道屏障功能的調(diào)節(jié)；該方法誘導(dǎo)動物模型的原理及腸道的病理狀態(tài)與本研究NEC 造模極為相似。Chassin等［8］發(fā)現(xiàn)，在新生小鼠腸道中miR-146a可介導(dǎo)保護性的內(nèi)源性免疫耐受反應(yīng)。本課題組的前期研究［24］發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p 可通過抑制巨噬細胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3［nucleotide-binding oligomerization domain（NOD） -like receptors family， pyrin domain containing 3，NLRP3］炎癥小體的激活來抑制NEC 腸道炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮NEC腸道的保護作用。He等［25］亦發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以保護腸道以避免發(fā)生缺血再灌注損傷。因此，上述研究均提示miR-146a具有腸道保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，作為抗炎性miRNA，miR-146a-5p在腸道中的表達水平與腸道組織結(jié)構(gòu)完整性（組織病理評級）和損傷范圍（腸道切除長度）相關(guān)?？寡仔砸蛩嘏c損傷程度一同升高表明，可能是機體試圖通過上調(diào)miR-146a-5p的表達來抑制腸道炎癥，但炎癥已超出miR-146a-5p的調(diào)控范圍；亦或是miR-146a-5p 主要表達于M1 型巨噬細胞，參與炎癥瀑布反應(yīng)，因此炎癥反應(yīng)越重則miR-146a-5p 的表達越高。有研究［8，10，26］發(fā)現(xiàn)，miR-146a 可通過靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）與白細胞介素-1 受體相關(guān)激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）調(diào)控Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號通路的激活狀態(tài)，而TLR4、TRAF6、IRAK1 均為核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路的上游節(jié)點，且該通路可調(diào)控白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-10、IL-1β等眾多炎癥因子，因此miR-146a間接參與了調(diào)控炎癥因子的表達。鑒于miR-146a-5p 對巨噬細胞和炎癥通路的復(fù)雜調(diào)控作用，本研究認為其在NEC 腸道炎癥中的調(diào)控同樣是較為復(fù)雜的。

miR-146a-5p 高表達與組織病理評級的相關(guān)性提示，NEC患兒出現(xiàn)miR-146a-5p高表達與腸道損傷嚴重程度相關(guān)，因此miR-146a-5p 高表達的患兒需進行更積極的抗炎治療和更頻繁的影像學(xué)、實驗室檢查，以觀測病情進展。然而在臨床上，對患者的早期診斷常依賴于對血、尿、糞等較易獲取的標本中的miR-146a-5p 進行檢測，而非腸道組織。在本研究中，我們未采集NEC 患兒的外周血，而新生小鼠的外周血量非常有限，不足以進行miR-146a-5p 檢測。因此，在后續(xù)研究中或可通過其他方法（如提高miRNA 在外周血中的檢測靈敏度）檢測外周血中miR-146a-5p的表達，以期作為NEC 早期診斷或提示病情嚴重程度的指標之一。

本研究尚存在一些不足之處：①樣本量較小。②采用的NEC 患兒腸道組織標本存放時間較長，且取材時間間隔亦較長，使得miRNA 降解程度不一，進而導(dǎo)致miRNA檢測可能存在誤差。

綜上所述，miR-146a-5p 的高表達與腸道組織結(jié)構(gòu)破壞程度和損傷范圍相關(guān)，提示miR-146a-5p參與了NEC的發(fā)生與發(fā)展，但具體的分子機制仍有待進一步探索。