HBEGF部分通過LIF上調(diào)膠質(zhì)母細胞瘤細胞中PD-L1的表達水平

梁 博，王新軍，趙 楊，王建業(yè)，周少龍，楊 卓

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院 1. 神經(jīng)外科、2.藥學部，河南 鄭州 450052)

膠質(zhì)瘤屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見腫瘤，發(fā)病率、死亡率都較高，且目前臨床上治療效果不佳[1]。程序性死亡因子配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)水平升高是多種腫瘤細胞逃避T細胞殺傷的重要機制[2]，在膠質(zhì)母細胞瘤中，抑制PD-L1上調(diào)可阻斷T細胞殺傷的敏感性[3]。肝素結合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HBEGF)在膠質(zhì)母細胞瘤中表達和功能研究于1988年首次報道，在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達，體外實驗驗證HBEGF可以促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖，并誘導HBEGF mRNA表達，提示HBEGF可能以自分泌的方式促進膠質(zhì)瘤進展[4]；目前研究發(fā)現(xiàn)，HBEGF表達與肝細胞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌、黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細胞瘤的形成有關，但具體機制有待進一步確定[5]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)與白介素-6類似，作為免疫調(diào)節(jié)因子，可通過自分泌方式影響免疫功能[6]，研究發(fā)現(xiàn)，LIF在前列腺癌細胞中可能通過激活蛋白酪氨酸激酶1/信號轉導子與激活子3通路上調(diào)PD-L1基因表達，從而發(fā)揮癌細胞轉移和免疫功能[7]；子宮中HBEGF與LIF存在協(xié)同作用，促進子宮內(nèi)膜建立受容性[8]。但膠質(zhì)母細胞瘤中HBEGF、LIF、PD-L1 三者之間關系尚不清楚。因此，本研究以U251、U87細胞作為研究對象，探討三者之間的關系，以期為臨床上治療膠質(zhì)母細胞瘤提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑星形膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87均購自中國科學院細胞庫，目錄號分別為：TCHu 58、TCHu 138。一抗LIF、PD-L1、β-actin抗體和GAPDH、HBEGF、LIF中和抗體均購自荷蘭Hycult Biotech公司，批號分別為：HC4537、HC7584、HC1052、HM1022、HM4258、HM2015；HBEGF購自美國Abnova公司，批號：063201。規(guī)律間隔的短回文重復序列/核酸內(nèi)切酶9(CRISPR/Cas9)基因組編輯技術構建HBEGF基因敲除U251、U87細胞系(已鑒定，購自英國abcam公司)。

1.2 儀器7500型RT-qPCR儀由美國ABI公司提供；Tanon 4100型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)由上海Tanon科技有限公司提供。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組U251使用含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基、U87使用含10%胎牛血清的低限量Eagle培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞狀態(tài)，待細胞密度達90%時1 ∶3傳代培養(yǎng)，部分細胞置于液氮中保種，部分進行實驗。實驗1：在正常U251、U87細胞中，實驗分為空白組(NC group，不做處理)、抗GAPDH組(anti-mGAPDH group，添加GAPDH中和抗體)、抗HBEGF組(anti-hHBEGF group，添加HBEGF中和抗體)(正常細胞密度至90%時1 ∶3傳代，收集此時細胞記為passage 0，添加抗GAPDH組添加終濃度為10 μg·L-1GAPDH中和抗體，抗HBEGF組添加終濃度為10 μg·L-1HBEGF中和抗體培養(yǎng)細胞，每天觀察細胞狀態(tài)，細胞密度90%時1 ∶3比例傳代，傳代1次記為passage 1，2次為passage 2，3次為passage 3，檢測細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平)；實驗2：實驗分為空白組(NC group，正常細胞)、HBEGF對照組(mock group，正常細胞轉染空載體mock)、HBEGF敲除組(HBEGF KD group，HBEGF敲除細胞)，分別在上述細胞基礎上添加HBEGF(HBEGF對照組使用HBEGF敲除的陰性對照穩(wěn)定細胞系，HBEGF敲除組使用敲除HBEGF的細胞系。5 μL HBEGF質(zhì)粒DNA、10 μL Lipofectamine 2000分別用250 μL無血清、無抗生素細胞培養(yǎng)液稀釋，室溫靜置15 min后二者混合形成DNA-Lipofectamine 2000混合物，將混合物添加上述空白組、HBEGF對照組、HBEGF敲除組37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，6 h后更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，不添加DNA-Lipofectamine 2000混合物以及添加DNA-Lipofectamine 2000混合物各組檢測細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平)；實驗3：在HBEGF敲除細胞系中，實驗分為對照組(control group，不做處理)、HBEGF組(HBEGF group，添加HBEGF)、HBEGF+抗GAPDH組(HBEGF+anti-mGAPDH group，添加HBEGF和GAPDH中和抗體)、HBEGF+抗LIF組(HBEGF+anti-LIF group，添加HBEGF和LIF中和抗體)(HBEGF敲除細胞系中密度至80%時，HBEGF+抗GAPDH組和HBEGF+抗LIF組分別添加終濃度為10 μg·L-1的GAPDH、HBEGF中和抗體，細胞傳代3代。除對照組外，其余各組添加HBEGF DNA-Lipofectamine 2000混合物孵育6 h，更換為對應培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，檢測細胞中PD-L1 mRNA和蛋白水平)。每個實驗重復孔均為6個，實驗重復4次。

1.4 RT-qPCR檢測細胞中LIF、PD-L1 mRNA水平TRIzol法提取細胞中總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR儀檢測細胞中HBEGF、LIF、PD-L1 mRNA水平。LIF F 5′-CCGCATAGTCGTGTACCTT-3′、R 5′-ATTTGGGTTTAGCGATGC-3′，PD-L1 F 5′-GGTGGTGCCGACTACAA-3′、R 5′-TAGCCCTCAGCCTGACAT-3′，β-actin F 5′-CCCAGCACAATGAAGAAGATCAA-3′、R 5′-GATCCACACGGAGTACTTG-3′。20 μL反應體系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA(50 mg·L-1)，F(xiàn)/R(均為10 μmol·L-1)各0.5 μL，8 μL ddH2O；反應條件：94 ℃、60 s；95 ℃、30 s，(HBEGF：61 ℃、40 s，LIF：58 ℃、60 s，PD-L1：60 ℃、20 s)，40個循環(huán)；72 ℃、5 min。2-ΔΔCt法計算HBEGF、LIF、PD-L1相對表達水平。

1.5 蛋白免疫印跡實驗檢測細胞中LIF、PD-L1蛋白水平收集細胞至離心管中，蛋白裂解液冰上裂解細胞10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min，上清液為收集細胞總蛋白。每孔上樣蛋白20 μg、上樣體積20 μL，凝膠電泳分離蛋白、經(jīng)聚偏氟乙烯膜轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉膜2 h后，對應加入一抗LIF、PD-L1、β-actin，4 ℃孵育過夜；加入對應二抗室溫孵育1 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

2 結果

2.1 基于GDC TCGA-GBM數(shù)據(jù)集分析HBEGF、LIF和PD-L1 mRNA相關性本次包含155例膠質(zhì)母細胞瘤樣本轉錄組測序數(shù)據(jù)。通過xena browser獲取GDC TCGA-GBM數(shù)據(jù)集中樣本類型為原發(fā)性膠質(zhì)瘤的樣本中HBEGF、LIF和PD-L1 3個基因的mRNA表達數(shù)據(jù)。Pearson分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤組織中HBEGF與LIF、HBEGF與PD-L1、LIF與PD-L1 mRNA兩兩間均呈正相關性(r=0.525、0.404、0.501，P均<0.05)，如Fig 1。

Fig 1 Correlation analysis of HBEGF, LIF and PD-L1 mRNA based on GDC TCGA-GBM data set

2.2 HBEGF中和抗體處理對細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平的影響傳代(0、1)代，空白組、抗GAPDH組、抗HBEGF組U251和U87細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。傳代2代，在U87細胞中，分別與空白組、抗GAPDH組相比，抗HBEGF組PD-L1 mRNA和蛋白、LIF蛋白水平降低(P<0.05)。傳代3代，在U251和U87細胞中，分別與空白組、抗GAPDH組相比，抗HBEGF組LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。見Fig 2、3,提示HBEGF對膠質(zhì)母細胞瘤U251、U87中LIF、PD-L1表達起到維持作用。

Fig 2 Effect of HBEGF neutralizing antibody treatment on levels of LIF and PD-L1 mRNA in cells n=6)

Fig 3 Effect of HBEGF neutralizing antibody treatment on levels of LIF and PD-L1 protein in cells n=6)

2.3 敲除HBEGF對HBEGF蛋白表達情況及Sanger測序結果分別在U251、U87細胞中敲除HBEGF，敲除HBEGF細胞中HBEGF蛋白表達水平降低(P<0.05),見Fig 4。在U251細胞中，在HBEGF外顯子3中敲除5′-ATTCCAGCCGCCTGTTCTTC-3′，20個堿基,見Fig 5。

Fig 4 Effect of knocking out HBEGF on levels of HBEGF protein in cells n=6)

Fig 5 Sanger sequencing results of knocking out HBEGF gene in U251 cells

2.4 敲除HBEGF對細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平的影響在U251、U87細胞中，分別與空白組、HBEGF對照組相比，HBEGF敲除組細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)；在空白組、HBEGF對照組、HBEGF敲除組中添加HBEGF后，LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。Fig 6、7提示，敲除HBEGF后膠質(zhì)母細胞瘤U251、U87中LIF、PD-L1表達降低，而添加HBEGF后可促進LIF、PD-L1的表達。

2.5 LIF中和抗體處理對HBEGF處理HBEGF敲除細胞中PD-L1的影響與對照組相比，HBEGF組PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)；與HBEGF組、HBEGF+抗GAPDH組相比，HBEGF+抗LIF組PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)，見Fig 8、9。提示LIF中和抗體處理可部分削減HBEGF處理對HBEGF敲低的膠質(zhì)母細胞瘤細胞中PD-L1表達的誘導作用，HBEGF誘導LIF是HBEGF誘導并維持PD-L1表達的一個中間過程。

3 討論

膠質(zhì)母細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性，由腫瘤細胞及成膠質(zhì)細胞瘤干細胞組成，這些細胞易存在耐藥性且存在腫瘤復發(fā)性，治療具有一定難度。臨床上常用藥物為替莫唑胺，替莫唑胺作為一種烷基化學治療劑，可誘導DNA鏈斷裂，但使用患者通常表現(xiàn)出耐藥性，為治療膠質(zhì)母細胞瘤增加難度[9]。免疫治療顛覆傳統(tǒng)治療方法，成為目前研究熱點，可以提高血液中T細胞比例，延長中位生存時間，具有巨大潛力，但仍處于初步階段[10]。PD-L1作為一種重要的免疫抑制蛋白，可在癌細胞中高表達，通過細胞介導癌細胞免疫逃逸。PD-L1或PD-1或二者的特異性阻斷劑可恢復T細胞功能并導致癌細胞死亡，但受腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤微環(huán)境影響，在許多類型的實體瘤中，PD-L1免疫抑制檢查點治療受到限制[11]。

HBEGF具有與表皮生長因子(epithelial growth factor，EGF)相似的生物活性，可促進細胞分裂、促進癌細胞存活或生長，參與癌細胞轉移、入侵過程，且分布廣泛，可作為臨床上靶向因子，是臨床上惡性腫瘤治療的新途徑[12]。HBEGF可能以自分泌的方式促進膠質(zhì)瘤進展[13]?？笻BEGF抗體作為活性成分的癌癥治療劑和增殖抑制劑，可用于治療胃癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、腦瘤等多種癌細胞，抗HBEGF抗體對于癌細胞增殖、遷移、浸潤具有強烈的抑制作用，且已申請專利；在結腸癌中，EGF促進結腸癌干細胞中PD-L1的產(chǎn)生和運輸[14]。LIF是一種多生物學功能趨化性細胞因子，為白介素-6家族成員之一，因最早發(fā)現(xiàn)可促進小鼠M1型白血病細胞分化并抑制其增殖而命名[15]，具有廣泛的生物學活性，在膠質(zhì)瘤中作為生長因子，其水平升高可促進膠質(zhì)瘤細胞分化[16]。且LIF調(diào)控PD-L1的表達，進而影響腫瘤遷移、侵襲過程[17]。本研究通過分析GDC-TCGA GBM數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，HBEGF基因在膠質(zhì)母細胞瘤組織中的mRNA表達水平與PD-L1及LIF的mRNA表達水平，顯示HBEGF與LIF正相關系數(shù)為0.525、HBEGF與PD-L1正相關系數(shù)為0.404、LIF與PD-L1正相關系數(shù)為0.501，P均<0.000 1，相關系數(shù)在0.3-0.7之間具有良好的相關性，且與PD-L1相比，LIF與HBEGF相關性更強；與HBEGF相比，LIF與PD-L1相關性強，提示HBEGF與LIF關系緊密通過PD-L1發(fā)揮作用。HBEGF中和抗體處理后U251、U87細胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平隨著細胞傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，提示HBEGF通過自分泌方式影響LIF、PD-L1的表達。敲除HBEGF后可顯著降低LIF、PD-L1 mRNA和蛋白的表達，而進一步添加HBEGF后LIF、PD-L1 mRNA和蛋白表達升高，提示HBEGF處理可顯著恢復HBEGF敲低的膠質(zhì)母細胞瘤細胞中PD-L1和LIF的表達水平。LIF中和抗體處理后PD-L1水平降低，提示HBEGF處理后升高的PD-L1水平可被LIF中和抗體降低，但卻不能完全改變PD-L1。以上結果顯示，HBEGF可能部分通過誘導LIF表達/分泌來維持膠質(zhì)母細胞瘤中PD-L1的表達水平。

綜上所述，在膠質(zhì)母細胞瘤中，HBEGF部分通過LIF上調(diào)PD-L1的表達，本文首次驗證了膠質(zhì)母細胞瘤中HBEGF、LIF、PD-L1 三者之間的關系，為臨床上治療膠質(zhì)母細胞瘤提供一定參考。