化合物Q-1對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖的抑制作用及其意義

伍沙沙，王 延，徐 婷，劉曉龍，錢海兵

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州省道地藥材性效用一致性研究中心，貴州 貴陽 550025)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種發(fā)病機制未知、對多個關(guān)節(jié)有影響的慢性、全身性自身免疫反應的疾病，主要病理表現(xiàn)為持續(xù)性的、慢性的滑膜炎性增生和形成的大量血管翳，導致關(guān)節(jié)損傷及不可逆性破壞，最終使得關(guān)節(jié)功能喪失[1]。在RA的發(fā)病過程中，涉及多種類型細胞之間的相互作用，其中成纖維樣滑膜細胞起關(guān)鍵作用。該細胞可異常增殖、遷移、侵襲至血管及關(guān)節(jié)，也能在炎癥環(huán)境下發(fā)生能量代謝異常，反過來促進其活化和滑膜炎癥[2-3]。因此，抑制成纖維樣滑膜細胞的活力，阻止其被活化，是治療RA的關(guān)鍵，對RA藥物的開發(fā)具有重要作用。

化合物Q-1來源于苗藥鐵筷子，是ACX庫中未發(fā)現(xiàn)的全新化合物Q-1，課題組初步研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、有效控制人RA成纖維滑膜細胞增殖的作用[4-5]。因此，本研究采用人RA成纖維樣滑膜細胞株(MH7A)為研究對象，建立TNF-α引起的細胞炎癥模型，基于NF-κB和MAPK信號通路來探索化合物Q-1的作用及機制，為化合物Q-1開發(fā)為RA的治療藥物提供理論支撐和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞人類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞株(MH7A)，購自吉妮歐生物公司。

1.2 藥物、試劑與儀器化合物Q-1為實驗室自制(純度為98%以上)，甲氨蝶呤(MTX)(Sigma 公司，批號BCBN2516V)；胎牛血清(FBS)(BI公司，批號2033119)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibico公司，批號8120500)；二甲亞楓(DMSO)(Solarbio公司，批號1012D031)；人TNF-α重組蛋白(Peprotech公司，批號041525E1319)；CCK-8試劑盒(Bioss公司，批號AI04156754)；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒、兔抗人p38蛋白抗體(Abcam公司，批號分別為GR3323551-1，GR3336678-1，GR3215674-8)；兔抗人p-p38 、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白抗體(CST公司，批號分別為4511T，4812S，2859T，8242T，3033T，4695T，4370T，9252T，4668T)；兔抗人GADPH蛋白抗體(杭州賢至公司，批號AB-P-R 001)；山羊抗兔HRP二抗(Bioss公司，批號019116)。二氧化碳培養(yǎng)箱、1510全自動酶標儀(Thermo Fisher Scientic)；SM-CJ-2F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)；TS-100倒置成像顯微鏡、BX53F電子顯微鏡(OLYMPUS)；ST16R臺式冷凍離心機(Thermo)；CT100R離心機(天美科技有限公司)；Western Blot裝置(BIO-RAD)；超靈敏多功能化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光機(Bio-Rad ChemiDocTMTouch)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)MH7A細胞在含10%胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，濕度為100%。當細胞長到培養(yǎng)瓶80%以上時，常規(guī)傳代，取5-10代細胞用于實驗。

2.2 CCK-8法檢測化合物Q-1對MH7A細胞增殖-毒性影響將MH7A細胞接種于96孔板，每孔10 000個，設(shè)空白孔(無細胞組)、對照孔(不加藥物組)和藥物組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜后，每孔加入不同濃度化合物Q-1及MTX[6]，每組設(shè)5個復孔。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h。用酶標儀測定450 nm處的各孔吸光度(OD)值。計算MH7A細胞存活率和抑制率：細胞存活率/%=(OD實驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)× 100%，細胞抑制率/%=(OD對照孔-OD實驗孔)/(OD對照孔-OD空白孔)× 100%。

2.3 Transwell遷移實驗①均勻接種MH7A細胞于T25培養(yǎng)瓶，隨機分為5組，孵育過夜。給藥干預24 h后，分別消化細胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×108L-1。②在Transwell小室的下室加入20% FBS培養(yǎng)基800 μL，上室加入150 μL細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個復孔。③取出 Transwell 小室，PBS洗凈，甲醇固定15 min。④0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，清水反復清洗多次后，用濕棉簽輕輕擦去上室底部膜表面上的細胞。⑤利用手術(shù)刀片摘取Transwell 膜，將底部朝上瞭干。放于載玻片上，加入中性樹膠封片，在高倍鏡(100×)下選取中間和四周5個視野拍照。⑥采用ImageJ 軟件計數(shù)，計算穿過小室下室膜的細胞數(shù)，取平均值，計算遷移率，細胞遷移率/%=實驗組遷移細胞數(shù)平均值/對照組遷移細胞數(shù)平均值 × 100%。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)將MH7A細胞以5×107個·L-1密度均勻接種在24孔板，隨機分為6組，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，加入相應藥物干預24 h，收集細胞上清液-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書進行測定。將相關(guān)樣品加入酶板，貼上覆膜，室溫避光振搖1 h。之后洗板3次，加入TMB顯影液，避光搖10 min，加入終止液，酶標儀450 nm處測定。

2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測① 細胞總蛋白提?。壕鶆蚪臃NMH7A細胞于T75培養(yǎng)瓶，隨機分為6組。培養(yǎng)過夜，加入相應藥物干預24 h，按照分組加或不加TNF-α溶液使終濃度為10 μg·L-1，刺激30 min。用預冷的PBS清洗細胞2次，消化，離心，得細胞沉淀，加入混合裂解液(2% Triton100 ∶PMSF ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑=99 ∶1 ∶1 ∶1)，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心25 min，所得上清即為蛋白原液。②BCA法測定蛋白濃度，稀釋到同一濃度并分裝，保存在-80 ℃ 冰箱。③凝膠電泳：使用BIO-RAD的免染膠，恒壓100 V進行電泳。④轉(zhuǎn)膜：半干轉(zhuǎn)法。在25 V、2.5 A條件下轉(zhuǎn)膜6 min。⑤封閉：5% BSA溶液室溫下封閉1 h。⑥抗體孵育：加入相對應的一抗溶液，放在4 ℃冰箱孵育過夜，d 2回收一抗，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗溶液室溫下孵育1 h。同樣方法洗膜洗3次。⑦ECL顯影，得到蛋白條帶。采用Bio-Rad ChemiDocTMTouch系統(tǒng)的Image Lab分析軟件對蛋白條帶進行灰度分析。以GADPH作為標準，將各組蛋白的灰度值均一化。使用均一化后的灰度值計算，得到蛋白相對表達水平，即蛋白相對表達水平=各組蛋白灰度值/正常組蛋白灰度值。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測化合物Q-1對MH7A細胞增殖-毒性影響結(jié)果如Tab 1所示，與空白組相比，MH7A細胞的存活率隨著化合物Q-1濃度增加而明顯降低，抑制率隨著化合物Q-1濃度增加而明顯升高(P<0.05)。為確?；衔颭-1對細胞活力有抑制作用且無毒，選擇100、50、25 mg·L-1濃度的化合物Q-1和5 μmol·L-1MTX作為后續(xù)實驗的濃度。

Tab 1 Effects of compound Q-1 on proliferation and

3.2 化合物Q-1對MH7A細胞遷移能力的影響如Tab 2、Fig 1所示，與空白組比較，各給藥組的遷移細胞數(shù)明顯減少，細胞遷移率明顯下降(P<0.01)，提示化合物Q-1和MTX對MH7A的遷移能力有抑制作用。

Tab 2 Effect of compound Q-1 on migration of MH7A n=5)

Fig 1 Effect of compound Q-1 on migration of MH7A

3.3 化合物Q-1對MH7A細胞上清液中TNF-α和IL-6表達的影響結(jié)果見Tab 3，與空白組相比，TNF-α組細胞上清液中的TNF-α、IL-6含量均升高(P<0.01)，說明炎癥因子釋放增加，造模成功；與TNF-α組相比，各給藥組明顯降低TNF-α、IL-6含量(P<0.01)，且呈濃度依賴性。

Tab 3 Effects of compound Q-1 on expression of TNF-α and IL-6 in supernatant of MH7A n=3)

3.4 化合物Q-1對TNF-α誘導的MH7A細胞p65、p-p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達水平的影響結(jié)果見Tab 4、Fig 2，經(jīng)TNF-α誘導后，p65、p-p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達均有所增加。給予藥物干預后，以上蛋白表達均有所下降，其中MTX和25 mg·L-1的化合物Q-1可明顯下調(diào)p-p65的表達(P<0.05)，100、50 mg·L-1的化合物Q-1可明顯降低p65、p-p65、p-IκBα蛋白的表達(P<0.05)，但所有給藥組對于IκBα蛋白的表達水平無明顯影響(P>0.05)。提示化合物Q-1主要通過抑制磷酸化后p65和IκBα蛋白表達，有效抑制NF-κB通路的異常激活，阻止炎癥反應的發(fā)生。

Tab 4 Expression of p65, p-p65, IκBα,

Fig 2 Effect of compound Q-1 on protein expression levels of p65, p-p65, IκBα and p-IκBα in MH7A induced by TNF-α

3.5 化合物Q-1對TNF-α誘導的MH7A細胞p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達水平的影響結(jié)果如Tab 5、Fig 3如示，在TNF-α的刺激下，p38、p-p38 、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表達均有所增加。各給藥組可降低TNF-α誘導的MH7A細胞p38、p-p38蛋白表達水平(P<0.05)，對ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達水平影響不大(P>0.05)。提示化合物Q-1可能主要對p38、p-p38蛋白表達起作用，從而抑制MAPK通路的激活，減輕MAPK通路介導的炎癥反應。

Fig 3 Effect of compound Q-1 on protein expression levels of p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK in MH7A induced by TNF-α

4 討論

RA發(fā)病機制復雜，成纖維樣滑膜細胞以及促炎細胞因子(TNF-α、IL-6等)在疾病進展中起著非常重要的作用，主要體現(xiàn)為促進RA免疫系統(tǒng)激活、滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞。在促炎細胞因子刺激下，滑膜細胞異常增殖活化，并表現(xiàn)出腫瘤樣行為，包括遷移、侵襲，是造成RA 患者滑膜組織增生和關(guān)節(jié)被破壞的主要原因[7]。與此同時，成纖維樣滑膜細胞可以分泌各種促炎細胞因子，反過來促進其增殖和釋放炎癥因子，讓更多的免疫細胞進入炎癥微環(huán)境，這樣就會形成一種惡性循環(huán)，持續(xù)促進RA滑膜炎的發(fā)展進程，從而導致軟骨損傷和關(guān)節(jié)破壞[8]。本研究表明，化合物Q-1可明顯抑制MH7A細胞的增殖和遷移，減少TNF-α、IL-6的表達，控制RA滑膜炎癥，減緩RA病程進展。

NF-κB信號通路炎癥研究的經(jīng)典通路之一，在RA 病理過程中發(fā)揮重要作用，早已被大家重視并得到公認。NF-κB信號通路可以調(diào)控炎性細胞因子的表達，并在炎性細胞因子刺激下持續(xù)激活，從而介導炎癥反應[3]。在正常情況下，NF-κB受到IκB家族蛋白的抑制，在受到細胞外信號刺激如TNF-α等刺激后，導致IκBα上游激酶如IKK 的活化，激活的 IKK可磷酸化IκBα，使其被泛素化降解，釋放NF-κB進入細胞核啟動轉(zhuǎn)錄，誘導促炎細胞因子的產(chǎn)生[9]。抑制NF-κB途徑的主要效應單位NF-κB p65和IκBα可以減輕炎癥反應，改善RA進程[10-11]。Western blot結(jié)果顯示，化合物Q-1可顯著下調(diào)由TNF-α引起的NF-κB p65、IκBα以及磷酸化的NF-κB p65、IκBα表達水平，表明化合物Q-1可能通過調(diào)控NF-κB信號通路的激活而阻止炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄啟動，從而發(fā)揮抗RA作用。

MAPK信號通路也是炎癥信號轉(zhuǎn)導通路之一，其中的經(jīng)典三條途徑是p38、JNK、ERK，可以調(diào)節(jié)成纖維樣滑膜細胞的生長、凋亡和分化，在RA滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞至關(guān)重要[12-13]。MAPK途徑經(jīng)TNF-α刺激活化，引起通路上相關(guān)蛋白磷酸化而介導炎癥反應[14]。本研究結(jié)果顯示，化合物Q-1可下調(diào)由TNF-α引起的p38及其磷酸化p38的蛋白表達水平，但對JNK和ERK以及磷酸化的JNK和ERK的表達蛋白無明顯影響，提示化合物Q-1主要通過調(diào)控p38、p-p38蛋白的表達而抑制MAPK信號通路激活，從而減少炎癥的發(fā)生起到抗RA作用。

綜上所述，化合物Q-1可能通過調(diào)控p65、IκBα介導的NF-κB信號通路和p38介導的MAPK信號通路，抑制MH7A細胞增殖、遷移，減少炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌從而減少炎癥的發(fā)生，減輕RA的癥狀改善RA進程。