濕熱證動(dòng)物模型造模方法的文獻(xiàn)挖掘研究?

陳佳美， 朱 青,2， 樸勝華,2△， 郭 姣,2

(1.廣東藥科大學(xué)，廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心， 廣州 510006；2.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510006)

濕熱證是臨床常見(jiàn)證候，以身熱不揚(yáng)、口渴不欲多飲、大便泄瀉、小便黃、舌紅苔黃膩、脈滑數(shù)等為主要表現(xiàn)，以病情纏綿、病程較長(zhǎng)為特點(diǎn)?！吨嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)》載病76種21種疾病[1]。既往濕熱證與急性感染性疾病關(guān)系密切，如急性病毒性肝炎[2]、急性胰腺炎[3]、登革熱[4]等。近年來(lái)，隨著疾病譜的改變，濕熱證越來(lái)越多見(jiàn)于慢性非傳染性疾病[5]，如2 型糖尿病及其并發(fā)癥[6，7]、慢性肝病[8]、慢性胃炎[9]、腎炎[10]等。但濕熱證參與疾病進(jìn)展的生物學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚，公認(rèn)的、可以模擬臨床的濕熱證動(dòng)物模型的構(gòu)建，是開(kāi)展相關(guān)研究的基礎(chǔ)工作和關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

自1988年，郭金龍首次通過(guò)肥甘飲食和人工濕熱環(huán)境成功模擬濕阻證[11]，后續(xù)學(xué)者在此基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)。濕熱證動(dòng)物模型涉及到動(dòng)物種類、干預(yù)因素、評(píng)價(jià)指標(biāo)等多方面，具體方法多達(dá)數(shù)十種，但目前尚無(wú)公認(rèn)、成熟的濕熱證造模方法，因此亟需對(duì)目前已發(fā)表文獻(xiàn)中濕熱證動(dòng)物模型造模方法進(jìn)行系統(tǒng)的梳理和分析?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)提取近20年濕熱證動(dòng)物模型文獻(xiàn)中的文本信息，從動(dòng)物種類、干預(yù)因素、相關(guān)疾病、評(píng)價(jià)指標(biāo)等幾方面進(jìn)行文本信息挖掘，以期為濕熱證造模方法提供客觀數(shù)據(jù)支撐。

1 濕熱證動(dòng)物模型文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量及機(jī)構(gòu)分布情況

濕熱證動(dòng)物模型文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析表明，2000年前濕熱證動(dòng)物模型相關(guān)文獻(xiàn)研究較少，從2000年逐漸增多，2005～2014的10年間文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量激增，但近5年文獻(xiàn)數(shù)量又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖1)。濕熱證動(dòng)物模型研究機(jī)構(gòu)的構(gòu)成分析表明，濕熱證動(dòng)物模型研究機(jī)構(gòu)不僅包含廣州中醫(yī)藥大學(xué)、遼寧中醫(yī)學(xué)院、成都中醫(yī)藥大學(xué)等傳統(tǒng)中醫(yī)藥大學(xué),也包括南方醫(yī)科大學(xué)、成都軍區(qū)總醫(yī)院等綜合性醫(yī)學(xué)院校或機(jī)構(gòu)(見(jiàn)圖2)。

圖1 濕熱證文獻(xiàn)的發(fā)表時(shí)間(年)與數(shù)量

圖2 濕熱證模型涉及機(jī)構(gòu)分布

2 濕熱證動(dòng)物模型相關(guān)參數(shù)

2.1 動(dòng)物選擇

圖3-5示，濕熱證動(dòng)物模型的動(dòng)物種類、年齡和性別的統(tǒng)計(jì)分析表明，濕熱證動(dòng)物模型動(dòng)物種類涉及到SD大鼠、豚鼠、新西蘭兔等8種動(dòng)物，以sprague-dawley(SD)大鼠最常見(jiàn)；性別以雌雄各半應(yīng)用最廣，總體上雄性高于雌性。對(duì)濕熱證大鼠年齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，體質(zhì)量成為年齡的替代指標(biāo)，體質(zhì)量集中在180～220 g之間，以190～200 g區(qū)間頻次最多。

圖3 濕熱證動(dòng)物模型種類使用情況頻次分布

圖4 濕熱證動(dòng)物模型性別分布

圖5 濕熱證大鼠初始體質(zhì)量情況分布

2.2 濕熱證動(dòng)物模型的干預(yù)因素

表1圖6示，濕熱證的誘因包括內(nèi)濕、外濕、體質(zhì)、外邪和化學(xué)因素。其誘因的相關(guān)干預(yù)因素統(tǒng)計(jì)分析表明，濕熱證干預(yù)因素以高脂高糖飲食、濕熱環(huán)境、病毒/細(xì)菌、酒精、中藥干預(yù)、化學(xué)因素為常見(jiàn)，其占比分別為92.1%、91.3%、66.1%、22.8%、9.4%、8.6%；其他因素占2.3%，包括游泳，冷水浸泡等。

表1 濕熱證模型涉及的相關(guān)干預(yù)方法

圖6 濕熱證模型干預(yù)因素頻次分布

濕熱環(huán)境的溫度、濕度分析表明，溫度以32 ℃使用頻率最多，其次是35 ℃(見(jiàn)圖7)，相對(duì)濕度以95 %使用頻率最多(見(jiàn)圖8)。對(duì)生物因子種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌使用次數(shù)最多(見(jiàn)圖9)。僅少數(shù)文獻(xiàn)對(duì)飲食的配方進(jìn)行詳細(xì)描述，但文獻(xiàn)分析中發(fā)現(xiàn)，濕熱證動(dòng)物模型飲食的物理狀態(tài)各有不同，分析發(fā)現(xiàn)固態(tài)高脂高糖飼料使用最廣泛(見(jiàn)圖10)。

圖7 濕熱證動(dòng)物模型溫度使用頻次分布

圖8 濕熱證動(dòng)物模型濕度范圍使用頻次分布

圖9 濕熱證模型生物因子種類分布

圖10 濕熱證模型飲食物質(zhì)形態(tài)構(gòu)成分布

2.3 濕熱證動(dòng)物模型的分類及疾病分布

表2-4示，濕熱證動(dòng)物模型中38.6 %(49/127)為病證結(jié)合模型，61.4 %(78/127)為單純中醫(yī)證候模型。證候模型的分類按頻次依次為：脾胃濕熱證、溫病濕熱證、大腸濕熱證、濕熱證、肝膽濕熱證；病證結(jié)合動(dòng)物模型涉及6大類疾病，按頻次依次為消化系統(tǒng)疾病、傳染病、皮膚病、呼吸系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、代謝病，以及不同類型濕熱證造模方法及優(yōu)缺點(diǎn)。

表2 濕熱證動(dòng)物模型分類比較

表3 濕熱證病證結(jié)合動(dòng)物模型的疾病分布

2.4 濕熱證動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

目前濕熱證臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)主要包括《中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)證候部分(修訂版)》《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》。以上3個(gè)濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)均是基于濕熱證臨床癥狀及體征來(lái)評(píng)判。由于人與鼠的種屬差異性，動(dòng)物模型僅模擬部分臨床的癥狀、體征。目前濕熱證動(dòng)物模型從癥狀、體征、微觀指標(biāo)三個(gè)維度進(jìn)行評(píng)價(jià)(見(jiàn)表5)，其中癥狀是最廣泛使用的評(píng)價(jià)手段，體征檢測(cè)相對(duì)癥狀觀察費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故較少應(yīng)用；而臨床和動(dòng)物模型上證據(jù)一致的微觀指標(biāo)，其應(yīng)用尚未得到公認(rèn)，仍需進(jìn)一步探索。

表4 常見(jiàn)疾病的濕熱證動(dòng)物模型造模方法及優(yōu)缺點(diǎn)

表5 濕熱證動(dòng)物模型評(píng)價(jià)維度及指征

3 討論

濕熱證動(dòng)物模型文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量自2000年逐步增加，2005～2014年迅猛發(fā)展，表明國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥事業(yè)的大力支持以及學(xué)術(shù)界對(duì)濕熱證候的重視，推動(dòng)濕熱證動(dòng)物模型研究不斷向前發(fā)展。雖然濕熱證領(lǐng)域越來(lái)越受到重視，但濕熱證動(dòng)物模型尚未取得重大突破，其發(fā)展陷入瓶頸，因此近5年濕熱證動(dòng)物模型研究漸漸陷入頹勢(shì)。濕熱證研究機(jī)構(gòu)涉及不同地域，且傳統(tǒng)中醫(yī)藥大學(xué)和綜合性大學(xué)均對(duì)濕熱證開(kāi)展了研究，表明濕熱證候不僅是中醫(yī)藥界關(guān)注的領(lǐng)域，同時(shí)也是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重視的方向。居于南方的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)對(duì)濕熱證動(dòng)物模型研究更多，可能與嶺南地區(qū)特殊的地理環(huán)境、氣候條件及濕熱證高發(fā)有關(guān)。

SD大鼠是濕熱證動(dòng)物模型最廣泛采用的動(dòng)物，可能與大鼠血樣較易采集，表征較易觀察等因素，但大鼠是否是濕熱證最適宜的模型，還需要更多地對(duì)比研究提供證據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，在輪狀病毒感染所致的大腸濕熱證動(dòng)物模型中，BALB/c小鼠較Wistar大鼠更貼近大腸濕熱證模型[23]。比較登革熱病毒感染的4周齡BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠濕熱證模型，發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠在血小板、肝損傷、血脂方面變化更明顯[24]。不同種屬和品系的動(dòng)物對(duì)同一致病因素易感性不同，不同疾病最適宜的濕熱證動(dòng)物種屬還需要進(jìn)一步研究。在性別的選擇上，濕熱證動(dòng)物模型雄性動(dòng)物總體高于雌性動(dòng)物，可能與雌性發(fā)情周期會(huì)引起不良的實(shí)驗(yàn)影響，且雄性動(dòng)物受高脂飲食影響更為顯著有關(guān)[25]。

目前濕熱證動(dòng)物模型大多使用“外濕”+“內(nèi)濕”的造模方法，可同時(shí)復(fù)合“外邪”或“體質(zhì)”因素，單因素化學(xué)藥物干預(yù)造模較少。高脂高糖飲食是內(nèi)濕形成的重要因素，其物理狀態(tài)分為液態(tài)和固態(tài)兩種，在濕熱證的造模中以固體飼料為主，但固態(tài)飼料是否是最佳選擇尚缺乏相應(yīng)的研究證據(jù)。飲食物理狀態(tài)的不同可造成喂食方式與攝取量的差異，如濕熱證模型進(jìn)食量減少的前提下，液體灌服方式更能確保動(dòng)物的攝食量，且研究表明液體飲食可增加食物攝入量，從而增加體內(nèi)脂肪[26]。高脂高糖飲食是公認(rèn)的造成肥胖、糖脂代謝紊亂的有效方法，而濕和水液代謝障礙密切相關(guān)，脂肪和糖的過(guò)量攝入對(duì)水液代謝的影響尚不完全清楚，但研究發(fā)現(xiàn)肥胖不僅僅是脂肪組織的過(guò)度聚積，同時(shí)也是一種低度的慢性炎癥狀態(tài)[27]。而炎癥與水液代謝障礙密切相關(guān)。在炎癥介質(zhì)等多種因素作用下，毛細(xì)血管膜對(duì)液體和溶質(zhì)的通透性增加，血管與間質(zhì)的液體交換出現(xiàn)障礙，可使液體積聚導(dǎo)致水腫，從而產(chǎn)生一系列病理反應(yīng)。

“外濕”是誘發(fā)濕熱證的重要條件，造模箱用于提供濕熱環(huán)境，在濕熱證動(dòng)物造模中具有重要作用。其溫度集中在30 ℃～35 ℃、濕度在90 %～95 %之間，溫度32 ℃使用頻率最多，相對(duì)濕度以95 %使用頻率最多，但尚無(wú)對(duì)不同溫度、濕度的最優(yōu)設(shè)定值進(jìn)行的研究。研究表明，造模持續(xù)日期越長(zhǎng)其模型越穩(wěn)定，但其模型也僅持續(xù)4周[28]。但造模過(guò)程中濕熱環(huán)境、每日持續(xù)時(shí)長(zhǎng)和持續(xù)日期尚無(wú)定論，最佳條件還需進(jìn)一步深入探索。部分研究者用游泳或冷水浸泡作為外濕環(huán)境成功誘發(fā)濕熱證，表明濕度因素可能相對(duì)溫度更有益于濕熱證的形成。細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素作為“外邪”在機(jī)體內(nèi)通過(guò)快速炎癥效應(yīng)，以促進(jìn)濕熱證的形成，但對(duì)于慢性非感染性疾病、生物因子誘導(dǎo)的濕熱證“病理過(guò)程”與研究本意相悖。

為了更簡(jiǎn)易快捷地造成濕熱證，部分研究者根據(jù)濕熱證特征性表征如舌苔黃膩、黃疸等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇特定化學(xué)藥物進(jìn)行造模。如文杰等用膽胰管推注5%?；悄懰徕c造急性胰腺炎大鼠模型，出現(xiàn)舌苔厚膩的達(dá)42.6 %[29]；皮膚黃疸是肝膽濕熱證的典型表征，曹洪欣等用異硫氰酸α-萘酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)和四氯化碳(carbontetrachloride)成功模擬濕熱黃疸[30]。這類單一因素的模型復(fù)制方法雖然復(fù)制出明顯的中醫(yī)證候表征，但忽略了病因是證候形成的關(guān)鍵因素之一，其應(yīng)用存在一定的爭(zhēng)議。

本研究還發(fā)現(xiàn)，病證結(jié)合模型和單純中醫(yī)證候模型造模方法多有重合，如腹瀉病濕熱證[12]、大腸濕熱證[13]和溫病濕熱證[14]均使用相同的造模方法(高脂高糖飲食+濕熱環(huán)境+大腸埃希菌)，表明動(dòng)物模型模擬臨床同一證候不同亞型存在技術(shù)上的困難和瓶頸，需要臨床研究提供不同證候亞型之間特征的標(biāo)志物和表征，為證候動(dòng)物模型研究提供可借鑒的標(biāo)準(zhǔn)，從而促進(jìn)證候動(dòng)物模型的發(fā)展。濕熱證動(dòng)物模型主要涉及消化系統(tǒng)疾病、傳染病、代謝病等領(lǐng)域，這與濕熱證臨床研究結(jié)果一致[5]，但2型糖尿病濕熱證動(dòng)物模型尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)際上，越來(lái)越多的臨床研究表明，濕熱證是2型糖尿病的主要證候之一，其病證結(jié)合動(dòng)物模型研究也將成為未來(lái)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[7]。

臨床濕熱證診斷依據(jù)傳統(tǒng)“望聞問(wèn)切”四診信息。由于動(dòng)物與人在種屬上的固有差異，且在動(dòng)物身上只能用望診、聞診，因此尋找客觀、特異性的癥狀和指標(biāo)成為判斷濕熱證動(dòng)物模型造模成功與否的關(guān)鍵。目前，舌紅、苔黃膩是公認(rèn)的濕熱證診斷“金指標(biāo)”。在《中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)證候部分(修訂版)》《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中，濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)的共性診斷條目為舌紅、苔黃膩，可見(jiàn)舌診是濕熱證的關(guān)鍵診斷指標(biāo)。雖然舌診尚未普遍應(yīng)用于濕熱證動(dòng)物模型的診斷，但有研究者利用光學(xué)相干層析成像技術(shù)對(duì)動(dòng)物舌苔進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物舌苔厚度分布與正常人體的舌苔分布相吻合；且發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證大鼠舌苔厚度明顯升高，而舌體含液量則明顯降低，與濕熱證明顯相關(guān)[31]，表明舌診有潛力成為濕熱證動(dòng)物模型診斷指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，某些炎癥[32]、免疫反應(yīng)[33]、氧化應(yīng)激[34]、水液代謝[35]、血液流變學(xué)[36]、神經(jīng)內(nèi)分泌[37]的指標(biāo)與濕熱證密切相關(guān)，但此類指標(biāo)缺乏特異性，其應(yīng)用尚存在爭(zhēng)議。為更客觀的評(píng)價(jià)濕熱證動(dòng)物模型，亟需發(fā)掘濕熱證的特異性指標(biāo)協(xié)助診斷。

近年來(lái)，濕熱證獲得越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注，建立公認(rèn)、成熟的濕熱證動(dòng)物模型是重點(diǎn)也是難點(diǎn)。濕熱證動(dòng)物模型干預(yù)因素眾多，造模方法多樣，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，不斷細(xì)化各實(shí)驗(yàn)變量，進(jìn)一步探索更符合臨床實(shí)際的濕熱證動(dòng)物模型尤為重要，其中建立客觀、合理的濕熱證模型評(píng)價(jià)體系是濕熱證動(dòng)物模型研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著現(xiàn)代科技水平的不斷發(fā)展，在大數(shù)據(jù)和多組學(xué)技術(shù)的協(xié)同作用下，將有望發(fā)掘出濕熱證的特異性、客觀化指標(biāo)體系，進(jìn)一步促進(jìn)濕熱證動(dòng)物模型的發(fā)展。