辣椒素激活TRPV1/鈣蛋白酶- 1通路改善血管再狹窄的研究

鄭波，王建，黃可，陳釗，羅小蘭，羅曉靜

(雅安市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，四川 雅安 625000)

支架介入治療是目前治療血管狹窄最常用的方法，但冠狀動脈、頸動脈和外周動脈經(jīng)皮介入治療術(shù)后再狹窄比例非常高[1]，這嚴(yán)重影響了介入治療患者的預(yù)后。有研究表明，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖及遷移是再狹窄的主要原因[2]，但目前尚無有效藥物可遏制再狹窄過程中VSMCs的增殖及遷移，因此仍需深入研究相關(guān)機制。辣椒素(capsaicin)是從辣椒屬茄科植物中提取的天然香草素類胡蘿卜素[3- 5]，既往發(fā)現(xiàn)它在心臟肥大、動脈粥樣硬化、高血壓等多種心腦血管疾病中均發(fā)揮保護作用[6]，其天然受體瞬時受體電位香草素受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是一種優(yōu)先選擇Ca2+的陽離子通道，可調(diào)節(jié)炎癥因子鈣蛋白酶，而鈣蛋白酶亞型1(鈣蛋白酶- 1)是誘導(dǎo)再狹窄過程的主要分子，但辣椒素是否通過此途徑調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移尚無報道。本研究初步探索辣椒素對血管再狹窄的可能作用及其機制，旨在為血管再狹窄的防治提供新的治療靶點及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

SPF級雄性C57BL6/J野生型(WT)小鼠40只，6～8周齡，體重(23.51±2.00)g，健康狀況良好，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供。辣椒素、10%胎牛血清、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；兔抗小鼠抗α- 肌動蛋白單克隆抗體、兔抗小鼠PCNA一抗和二抗、兔抗小鼠鈣蛋白酶- 1一抗和二抗購自美國Abcam公司；血小板源性生長因子(platelet- derived growth factor- BB, PDGF- BB)購自美國R&D公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒- 8(CCK- 8)購自中國江蘇Beyotime公司；Boyden小室購自美國BD公司；蛋白質(zhì)測定試劑購自美國加利福尼亞州Bio- Rad公司；GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組 小鼠安置于溫度和濕度控制適宜、12 h/12 h晝夜循環(huán)的房間內(nèi)，投喂標(biāo)準(zhǔn)實驗動物飼料，自由獲取飲用水。適應(yīng)性喂養(yǎng)后將20只小鼠隨機分為空白組和辣椒素組各10只，頸動脈結(jié)扎后分別用標(biāo)準(zhǔn)飼料(空白組)或含0.01%辣椒素的飼料(辣椒素組)喂養(yǎng)14 d。為進一步探索辣椒素發(fā)揮作用的內(nèi)在機制，另將20只辣椒素干預(yù)小鼠分為標(biāo)準(zhǔn)組和使用TRPV1抑制劑5′- 碘樹脂毒素(iRTX)干預(yù)的抑制劑組。所有實驗均按照國家衛(wèi)生研究院實驗動物使用指南進行，并經(jīng)雅安市人民醫(yī)院動物護理與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 從消化后的主動脈中分離小鼠VSMCs，將細(xì)胞在5%CO2、37 ℃的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含Hepes緩沖液、100 U·ml-1青霉素、 0.1 mg·ml-1鏈霉素、谷氨酰胺和10%胎牛血清。用抗α- 肌動蛋白單克隆抗體(1∶80)對VSMCs進行免疫染色。在血清饑餓24 h后使用融合的第2代或第3代細(xì)胞進行所有實驗。將VSMCs分為空白對照組和使用PDGF- BB預(yù)處理的生長因子組，再分組分別加入生理鹽水、辣椒素(1 mmol·L-1)培養(yǎng)24 h，即形成標(biāo)準(zhǔn)對照組、辣椒素對照組、生長因子組和生長因子辣椒素組4組。

1.2.3 誘導(dǎo)頸動脈再狹窄 用40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，經(jīng)頸正中切口解剖出左頸動脈，用6- 0絲線結(jié)扎左頸動脈分支處的近心端，而右頸動脈作為內(nèi)部對照[7]。分別在0、1、2、3和4周時麻醉和處死各組小鼠以獲取其頸動脈。

1.2.4 VSMCs增殖測定 將PDGF- BB溶解在0.05%二甲基亞砜凍存液中，并在無血清DMEM中進一步稀釋，用CCK- 8測定評估PDGF- BB對VSMCs增殖的影響。簡而言之，在存在或不存在PDGF- BB(10 ng·ml-1)的情況下，將VSMCs接種于96孔板(每孔1×104個細(xì)胞)中培養(yǎng)24 h，然后向每個孔中加入0.2 mg·ml-1的CCK- 8試劑，并在37 ℃下孵育4 h，通過酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值來評估細(xì)胞增殖。

1.2.5 細(xì)胞遷移分析 在細(xì)胞遷移分析中，使用24個涂有纖連蛋白的聚碳酸酯膜的改良Boyden小室(8 μm孔徑)。簡言之，在下層小室中用含或不含PDGF- BB(10 ng·ml-1)的無酚紅DMEM填充。將涂有50 mg·ml-1纖連蛋白的濾膜固定在下層小室的頂部，使VSMCs(每孔1×105個細(xì)胞)遷移6 h，并用棉簽從膜上側(cè)除去未遷移的細(xì)胞。將膜下側(cè)的細(xì)胞用4,6- 二氨基- 2- 苯吲哚染色，并在熒光顯微鏡下每個小室隨機選擇5個視野觀察，所得數(shù)據(jù)表示每個視野的遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 免疫組化染色測定PCNA陽性細(xì)胞 在鹽水灌注后，用4%多聚甲醛固定頸動脈并包埋在石蠟中，將薄切片(4～5 μm)用蘇木精- 伊紅(HE)染色，使用Image- Pro Plus軟件測量頸動脈的內(nèi)膜厚度和中膜厚度。石蠟切片使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；微波修復(fù)切片內(nèi)組織抗原之后，均勻滴加0.3%雙氧水，常溫孵育10 min；滴加5%牛血清白蛋白封閉液，常溫溫育10 min；加PCNA一抗(1∶100)，4 ℃濕盒中孵育過夜，37 ℃復(fù)溫1 h，再加二抗(1∶50)于37 ℃濕盒溫孵30 min；滴加鏈霉素-過氧化物酶溶液(1∶150)，37 ℃下孵育30 min。每兩步之間均使用PBS沖洗3次，每次3 min。滴加DAB染色溶液，37 ℃下孵育10 min，鏡下(100倍)觀察細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕色(結(jié)果中圖片顯示黑色)為陽性細(xì)胞，通過預(yù)設(shè)采樣程序得到平均吸光度值和陽性面積，PCNA陽性細(xì)胞率=平均吸光度值×陽性面積所占百分比×100%。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測鈣蛋白酶- 1的表達(dá) 在RIPA緩沖液中裂解頸動脈組織或VSMCs，用蛋白質(zhì)測定試劑定量蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白樣品，電壓80 V 開始電泳，當(dāng)?shù)鞍子局练蛛x膠、濃縮膠分界線時，將電壓調(diào)至 120 V，待蛋白泳至凝膠底部時關(guān)閉電源、將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h，再加一抗(鈣蛋白酶- 1：1∶3 000；GAPDH：1∶3 000)4 ℃孵育慢搖過夜；TBST洗脫3次，每5 min 1次，加二抗(1∶5 000)，并以化學(xué)發(fā)光法顯跡，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進行密度掃描，用Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 辣椒素減輕血管再狹窄程度

頸動脈結(jié)扎14 d后檢測內(nèi)膜厚度/中膜厚度(I/M)值。與空白組相比，辣椒素組的I/M值明顯降低(P<0.01，圖1A)。PCNA陽性細(xì)胞是細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，結(jié)果顯示，與空白組相比，辣椒素組的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.01，圖1B)。上述結(jié)果表明，辣椒素減輕了小鼠血管再狹窄的病變程度。

2.2 辣椒素抑制PDGF- BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖與遷移

為確定血管再狹窄的潛在機制，我們分離培養(yǎng)了小鼠原代VSMCs。4組細(xì)胞增殖和遷移的結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(分別F=8.43和F=9.12，均P<0.01)。CCK- 8檢測結(jié)果提示，PDGF- BB顯著誘導(dǎo)了VSMCs的增殖(P<0.01，圖2 A)，而辣椒素可顯著抑制由此產(chǎn)生的VSMCs的增殖(P<0.01，圖2A)。細(xì)胞遷移結(jié)果表明，PDGF- BB顯著誘導(dǎo)了VSMCs的遷移(P<0.01，圖2 B)，而辣椒素可顯著抑制由此產(chǎn)生的VSMCs的遷移(P<0.01，圖2 B)。上述結(jié)果表明，辣椒素可能通過抑制VSMCs增殖和遷移來預(yù)防血管再狹窄的發(fā)生。

a 與標(biāo)準(zhǔn)對照組比較，P<0.01； b 與生長因子組比較，P<0.01

2.3 辣椒素抑制VSMCs中鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性

4組VSMCs中鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(分別F=12.05和F=11.92，均P<0.01)。用蛋白質(zhì)印跡法測定特異性光譜蛋白分解產(chǎn)物(SBDPs)的部分表達(dá)，表明鈣蛋白酶- 1具有活性，且蛋白質(zhì)印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)對照組相比，PDGF- BB可顯著增加鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性(P<0.01，圖3)。與生長因子組相比，生長因子辣椒素組細(xì)胞鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性顯著降低(P<0.01，圖3)。上述結(jié)果提示，辣椒素能夠抑制VSMCs中鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性。

a 與標(biāo)準(zhǔn)對照組比較，P<0.01; b 與生長因子組比較，P<0.01

2.4 TRPV1抑制劑逆轉(zhuǎn)辣椒素的抗血管再狹窄作用

經(jīng)TRPV1抑制劑iRTX和辣椒素同時處理過的小鼠頸動脈I/M值和PCNA細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果顯示，抑制劑組的I/M值和PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.01，圖4A、B)。同時蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)組相比，抑制劑組鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性明顯增加(P<0.01，圖4C、D、E)。上述結(jié)果表明，TRPV1抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了辣椒素的抗血管再狹窄作用，鈣蛋白酶- 1可能是其關(guān)鍵介導(dǎo)分子。

a 與標(biāo)準(zhǔn)組比較，P<0.01

3 討 論

血管狹窄疾病在心血管疾病中占比極高，支架介入后再狹窄限制了治療的有效性，而VSMCs異常增殖和遷移形成新內(nèi)膜被認(rèn)為是再狹窄的主要原因[2，8- 10]。辣椒素已被證明在胃腸和心血管等多種疾病中有一定益處[11- 13]?；诖?，本研究進一步探究辣椒素在血管再狹窄中的作用及其機制，以期為血管再狹窄的治療和改善患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)辣椒素可降低結(jié)扎后頸動脈I/M值以及PCNA陽性細(xì)胞數(shù)，表明辣椒素可以改善血管再狹窄，提示辣椒素可作為其重要防治策略來深入研究[14]。與Zhang等[15]研究結(jié)果一致，本研究分離培養(yǎng)小鼠原代VSMCs，發(fā)現(xiàn)辣椒素顯著抑制了PDGF- BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移。TRPV1是辣椒素的天然受體，同樣表達(dá)于VSMCs上，既往研究發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)VSMCs增殖和遷移，可加速血管損傷后的再內(nèi)皮化，抑制新生內(nèi)膜的形成[6，16- 18]。本研究進一步應(yīng)用TRPV1抑制劑iRTX及辣椒素處理小鼠后，頸動脈I/M值及PCNA陽性細(xì)胞數(shù)均顯著升高。這些結(jié)果表明，抑制TRPV1阻斷了辣椒素的血管再狹窄保護作用，提示TRPV1直接參與了辣椒素的抗血管再狹窄作用。

此外，Ca2+和Na+離子可通過TRPV1流入細(xì)胞，從而觸發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，但此通道優(yōu)先選擇Ca2+離子[19- 20]。而鈣蛋白酶作為一個鈣依賴性的細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶家族，能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、遷移和凋亡等多個過程[21]。越來越多的證據(jù)表明，鈣蛋白酶在血管再狹窄中發(fā)揮重要作用，且鈣蛋白酶- 1是誘導(dǎo)再狹窄過程的主要分子。已有的研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素的受體TRPV1可調(diào)節(jié)鈣蛋白酶[22- 24]，但是該調(diào)節(jié)關(guān)系是否影響血管再狹窄發(fā)生尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素干預(yù)后VSMCs中鈣蛋白酶- 1的表達(dá)及活性均降低，提示鈣蛋白酶- 1是辣椒素/TRPV1有效的下游調(diào)節(jié)靶點。

綜上，辣椒素可通過TRPV1/鈣蛋白酶- 1通路抑制VSMCs異常增殖和遷移，并降低小鼠頸動脈再狹窄后I/M值，改善血管再狹窄。該辣椒素抗血管再狹窄作用的研究，可為臨床血管再狹窄的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。