龜甲膠對(duì)環(huán)磷酰胺引起的貧血大鼠的改善作用研究

胡海林，肖丹，2，王磊，何清湖，唐宇，*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院 湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.衡陽(yáng)東健藥業(yè)有限公司 湖南 衡陽(yáng) 421431；4.湖南醫(yī)藥學(xué)院 湖南 懷化 418000）

貧血是指單位容積循環(huán)血液中紅細(xì)胞、血紅蛋白含量低于正常參考值下限引起的一系列臨床綜合征。調(diào)查顯示，貧血影響著世界1/4 的人口，中國(guó)居民貧血的平均患病率為20.1%［1－2］。貧血發(fā)病緩慢，沒(méi)有特異性的臨床表現(xiàn)，是造成成年人生產(chǎn)力降低與青少年生長(zhǎng)發(fā)育異常的重要原因之一［3－4］。貧血在中醫(yī)學(xué)中多歸屬于“血虛”“虛勞”的范疇，多因先天不足、脾胃虛弱、后天失養(yǎng)等導(dǎo)致氣血生化不足，進(jìn)而引發(fā)一系列臟腑失養(yǎng)的虛弱病癥［5］。

龜甲膠是由烏龜腹甲經(jīng)煎煮、濃縮后制成的固體膠，其味咸、甘，性微寒，歸肝、腎、心經(jīng)，具有滋陰潛陽(yáng)、補(bǔ)血止血、益腎健骨的功效，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。本研究擬通過(guò)觀察龜甲膠對(duì)貧血大鼠模型的作用，研究龜甲膠改善貧血的效果與作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠72 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質(zhì)量180～220 g，采購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019－0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：430727201101698051。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)單位許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019－0009。自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室溫度18～26 ℃，濕度55%左右，每日常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要藥物及試劑

龜甲膠（湖南東健藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20200901）；注射用環(huán)磷酰胺（德國(guó)安道生，批號(hào)：0E387A）；利可君片（江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20030303）；EPO試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：B18031506）；GM－CSF 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：B19031507）；蘇木素、伊紅（Wellbio公司）。

1.3 主要設(shè)備

獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)：BC－2800vet）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，貨號(hào)：H1650R）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：PW－812）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：MB－530）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，貨號(hào)：DHP－500）。

1.4 分組造模與給藥

將72只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)表法分為空白組、模型組、利可君組、龜甲膠低劑量組、龜甲膠中劑量組和龜甲膠高劑量組。每組12 只，雌雄各半。除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（給藥劑量為400 mg/kg），每日1 次，連續(xù)3 d，從第4 天開(kāi)始改為隔日1 次，再行注射3 次，建立再生障礙性貧血大鼠模型。

造模成功后，按照人與大鼠的體表面積換算相應(yīng)劑量灌胃。空白組與模型組大鼠給予生理鹽水；利可君組給予用生理鹽水配置的40 mg/mL 利可君片溶液；龜甲膠低、中、高劑量組，分別給予0.063、0.126、0.252 g/mL 的龜甲膠藥液。各組大鼠分別以10 mL/kg的劑量給予相應(yīng)溶液灌胃，每日1次，連續(xù)15 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 外周血象測(cè)定

末次給藥24 h 后，以10%水合氯醛按照35 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，用手術(shù)剪沿大鼠下腹部正中剪開(kāi)，于腹主動(dòng)脈采血，以EDTA 抗凝后用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血中的白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）含量。

1.5.2 血清促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）測(cè)定

腹主動(dòng)脈采血后靜置2 h，以3 500 r/min 的速度離心20 min 后分離出血清，然后用移液槍吸取上層血清置于EP 管內(nèi)，冰箱內(nèi)保存待檢。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定大鼠血清中EPO的含量。

1.5.3 RT－qPCR法檢測(cè)腎臟EPO mRNA表達(dá)

采用Trizol提取腎臟組織總RNA，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用SYBR 染料法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析60～95 ℃，每0.5 ℃一循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)，以β－actin 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。目的基因的序列及引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT－qPCR反應(yīng)引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5.4 脾臟組織細(xì)胞病理形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

取大鼠脾臟組織，多聚甲醛固定，24 h 后脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察脾臟組織細(xì)胞病理形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先檢測(cè)各組數(shù)值符合正態(tài)分布，然后進(jìn)行單因素方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者采用Dunnett－t3檢驗(yàn)。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果2.1 各組大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比較

與空白組比較，模型組大鼠WBC、RBC、HGB 降低（P＜0.01），PLT 升高（P＜0.01）；與模型組相比，龜甲膠各組WBC、RBC、HGB 均升高（P＜0.01），利可君組大鼠WBC、RBC、HGB 升高（P＜0.01），給藥各組PLT改善不明顯（P＞0.05）；龜甲膠低劑量組對(duì)大鼠WBC升高顯著高于龜甲膠中、高劑量組（P＜0.05），各個(gè)劑量龜甲膠組之間RBC 和HGB 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比較（±s）

表2 各組大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05；與低劑量組比較，**P ＜0.05。

組別空白組模型組利可君組龜甲膠低劑量組龜甲膠中劑量組龜甲膠高劑量組PLT/（×1012/L）6.84±1.31 11.99±2.51*16.66±5.38 17.37±5.56 15.26±3.22 18.00±4.37 n 12 8 8 1 0 9 11 WBC/（×109/L）10.87±2.21 1.94±0.72*19.60±6.18 22.88±9.51△14.15±5.38△**17.87±4.80△**RBC/（×1012/L）6.76±0.35 4.18±0.86*5.75±0.61△6.00±0.57△5.43±0.51△6.12±0.41△HGB/（g/L）148.75±10.51 99.61±8.86*128.88±9.57△130.10±3.75△124.67±10.90△131.17±12.53△

2.2 各組大鼠血清EPO的含量比較

與空白組相比較，模型組大鼠血清中EPO 含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，龜甲膠各組及利可君組大鼠血清中EPO 含量顯著增高（P＜0.01）；龜甲膠中、高劑量組較龜甲膠低劑量組增加更明顯，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 各組大鼠脾臟組織細(xì)胞病理形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

空白組大鼠脾臟結(jié)構(gòu)致密，白髓與紅髓結(jié)構(gòu)清楚且分界明顯，淋巴小結(jié)邊界清晰，淋巴細(xì)胞排列致密整齊，細(xì)胞未見(jiàn)明顯的分裂分化現(xiàn)象。模型組大鼠脾臟結(jié)構(gòu)紊亂，紅髓與白髓界限模糊不清，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分裂分化現(xiàn)象。與模型組比較，利可君組及龜甲膠各組大鼠的脾臟均得到不同程度的修復(fù)，白髓與紅髓結(jié)構(gòu)與界限較為明顯，細(xì)胞分裂分化現(xiàn)象比較少見(jiàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠脾臟組織細(xì)胞病理形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，×100）

2.4 各組大鼠腎臟EPO mRNA表達(dá)水平比較

與空白組相比較，模型組大鼠腎臟中EPO mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，利可君組及龜甲膠各組大鼠腎臟中EPO mRNA 表達(dá)均顯著上升（P＜0.05），龜甲膠中劑量組腎臟EPO mRNA 表達(dá)較龜甲膠高、低劑量組提升更多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 龜甲膠對(duì)大鼠血清EPO含量及腎臟EPO mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 龜甲膠對(duì)大鼠血清EPO含量及腎臟EPO mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05。

組別空白組模型組利可君組龜甲膠低劑量組龜甲膠中劑量組龜甲膠高劑量組腎臟EPO mRNA 0.137±0.046 0.021±0.006*0.153±0.027△0.130±0.037△0.231±0.082△0.103±0.020△n 12 8 8 1 0 9 11血清EPO（ng/mL）0.339±0.046 0.021±0.039*0.464±0.100*△0.412±0.120△0.459±0.180*△0.455±0.151*

3 討論

環(huán)磷酰胺作為臨床上常用的一種烷化劑類化療藥物，能夠通過(guò)發(fā)生烷化反應(yīng)抑制DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，造成骨髓抑制，從而導(dǎo)致貧血［6－7］。環(huán)磷酰胺腹腔注射造成大鼠貧血的方法簡(jiǎn)單易行，時(shí)間短，模型穩(wěn)定［8］。本研究中模型組大鼠血常規(guī)檢測(cè)顯示，外周血中WBC、RBC、HGB 含量下降，這與錢(qián)宏梁等［9］的研究結(jié)果相似。筆者認(rèn)為PLT含量的增加可能與對(duì)模型組及給藥各組行腹腔注射及灌胃時(shí)，引起大鼠劇烈掙扎導(dǎo)致小血管破裂，從而激活大鼠凝血系統(tǒng)有關(guān)。

明代倪朱謨?cè)凇侗静輩R言》中記載，龜甲膠能治療一切陰虛血虛之證［10］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血是機(jī)體的重要組成部分，血液的生成主要有兩方面：一是水谷精微化赤而形成血液，二是精血互生，腎主骨生髓，精髓化生為血。龜甲膠，味咸、甘，性微寒，歸肝、腎、心經(jīng)，因此常用來(lái)治療血虛證［11－13］。研究發(fā)現(xiàn)，龜甲膠中含有大量的有益于人體的礦物元素，如Fe、Zn 以及人體所必需的蛋白質(zhì)、氨基酸等［14－16］。本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)給環(huán)磷酰胺造成貧血的大鼠灌服不同劑量的龜甲膠溶液，與模型組相比，龜甲膠組大鼠血象中WBC、RBC、HGB 均升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高劑量組大鼠RBC、HGB 升高更明顯，低劑量組WBC 升高更明顯，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

EPO又稱紅細(xì)胞刺激因子，是一種由165個(gè)氨基酸組成、分子量為34 000的內(nèi)源性酸性糖蛋白激素，主要來(lái)源于胎兒時(shí)期的肝臟，出生后主要在腎臟合成，其生物學(xué)作用主要是促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟［17－18］。本研究結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠血清中EPO含量和腎組織中EPO mRNA的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比較，利可君組和龜甲膠低、中、高劑量組大鼠血清中EPO含量和腎組織中EPO mRNA 的表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。這可能是因?yàn)榄h(huán)磷酰胺具有細(xì)胞毒性，腹腔注射后損傷了大鼠的腎臟細(xì)胞，其中EPO mRNA表達(dá)降低，導(dǎo)致血液中EPO含量也相應(yīng)降低。通過(guò)灌服不同劑量的龜甲膠后，龜甲膠中的成分對(duì)腎臟及骨髓進(jìn)行了修復(fù)，EPO mRNA 表達(dá)升高，合成更多的EPO 入血。并且脾臟是人體最常見(jiàn)的免疫造血器官之一，造血功能低下會(huì)導(dǎo)致脾臟中骨髓細(xì)胞的積聚［19］。各組大鼠脾臟組織細(xì)胞病理形態(tài)顯示，與空白組相比，模型組大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，紅髓與白髓界限模糊不清，通過(guò)給予龜甲膠溶液后，各組大鼠脾臟的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)均得到不同程度的修復(fù)。

綜上所述，龜甲膠能夠顯著改善大鼠因環(huán)磷酰胺腹腔注射而導(dǎo)致的貧血，增加外周血中WBC、RBC 和HGB 的含量，提高大鼠腎臟中EPO mRNA 表達(dá)和血液中EPO 的含量，這為龜甲膠治療貧血的機(jī)制研究與臨床應(yīng)用提供了一定的思路與理論基礎(chǔ)。