干制黃芪莖葉對(duì)SD大鼠致畸性研究

李慧，崔瑩，馬德志，張可勇，李靜輝，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

黃芪莖葉是豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］或膜莢黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.］的地上嫩莖和葉部分，作為中藥材黃芪的附加產(chǎn)品，長(zhǎng)期被用于藥用和食用。黃芪莖葉的藥用記載最早見于魏晉時(shí)期陶弘景所著的《名醫(yī)別錄》，其中記載了黃芪莖葉的別名“芰草”以及其功能主治為“療渴及筋攣，癰腫，疽瘡”，后《本草正義》中注釋為“黃耆莖葉療渴，亦升清滋液之功。治筋攣者，亦稟溫和之性……與根之偏于補(bǔ)益者，固自有別耳”，表明黃芪莖葉與黃芪根的功效有所差異。

研究顯示黃芪莖葉中含有多種生物活性成分。張艷等［1］對(duì)黃芪莖葉中的主要成分及營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示黃芪莖葉中總皂苷含量為23.35 mg/g，多糖含量為27.04 mg/g，黃酮含量為5.61 mg/g，且微量元素含量與根部含量接近，具有藥物與營(yíng)養(yǎng)的雙重價(jià)值。黎映瓊等［2］對(duì)不同產(chǎn)地黃芪根、莖、葉中的4 種異黃酮成分進(jìn)行了含量比較，結(jié)果表明不同部位四種成分含量差異較大，其中芒柄花苷和芒柄花素在莖葉中的積累量高于根中，這為后續(xù)黃芪莖葉的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。程合理［3］采用HPLC－ELSD 的方法測(cè)定了黃芪根和莖葉中黃芪甲苷的含量，結(jié)果顯示黃芪莖葉中黃芪甲苷的含量明顯高于黃芪根。目前，黃芪莖葉的成分已較為明確，相關(guān)研究也受到了廣泛的關(guān)注［4－7］，且有藥理學(xué)研究顯示，黃芪莖葉具有良好的抗衰老、抗炎、保護(hù)肝臟、保護(hù)心血管和抗氧化等作用［8－11］。

除藥用外，其食用歷史也有600年之久，在明代《救荒本草》《野菜博錄》《本草綱目》中均有其食用方法的記載，如：“黃芪莖葉食法，采嫩苗葉煠熟，換水浸淘去苦味，油鹽調(diào)食”。隨著人們健康意識(shí)的不斷提升，越來越多的人將黃芪莖葉作為健康食品的重要原料，尤其在我國(guó)黑龍江大興安嶺、內(nèi)蒙古等地多見。

作為有廣泛應(yīng)用前景的天然綠色原料之一，目前對(duì)其致畸性等毒理學(xué)的研究相對(duì)較少。因此，開展黃芪莖葉致畸性試驗(yàn)對(duì)黃芪莖葉的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗(yàn)樣品為蒙古黃芪與膜莢黃芪的地上部分，采收后自然晾干。采用熱回流提取濃縮裝置對(duì)樣品進(jìn)行提取，料液比1∶15，加水浸泡30 min，微沸條件下提取5 h（分2 次，每次2.5 h），提取后的殘?jiān)尤?5%的乙醇提取4 h（分2次，每次2 h），最終將過濾液合并。

合并后的濾液采用噴霧干燥塔直接干燥為粉末，條件為180 ℃，流速2 L/h，負(fù)壓0.04 Mpa。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)的健康SD 雌性大鼠180 只，雄性30 只，體質(zhì)量（200±20）g，生產(chǎn)許可證號(hào)和使用許可證號(hào)分別為SCXK（浙）2014－0001 和SYXK（浙）2011－0166。飼養(yǎng)環(huán)境室溫為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，于不銹鋼籠中飼養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 劑量和分組

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（包括最大可灌胃濃度和灌胃體積）設(shè)置干制黃芪莖葉低、中、高三個(gè)劑量組的給藥劑量分別為3.75、7.50、15.00 g/kg，陰性對(duì)照組給予蒸餾水。按照前期樣品提取率分別稱取樣品9、18、36 g，各加300 mL蒸餾水混勻，4 ℃冰箱保存。

雌、雄大鼠同籠的比例為2∶1，以次日早晨陰道涂片是否見精子作為是否受精的評(píng)判指標(biāo)。隨后將受精鼠隨機(jī)分為4 組，并記錄體質(zhì)量，受精當(dāng)天確定為受孕第0天，每組不少于16只。

1.3.2 試驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

在受孕的第6～15 天，每天上午按劑量給予各組大鼠相應(yīng)受試物，并于受孕的第0、6、9、12、15、20 天記錄體質(zhì)量。于第20 天將母鼠處死，取出子宮稱重，并檢查記錄黃體數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎及死胎數(shù)。逐個(gè)記錄活胎鼠的體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、性別以及體質(zhì)量，觀察是否有畸形發(fā)生。將每窩胎鼠的一半浸入95%乙醇中固定3 周，淋洗后用2%氫氧化鉀處理3 d，后浸入茜紅素染色，透明后觀察骨骼是否發(fā)生畸形；另一半浸入Bouins溶液，以備觀察內(nèi)臟是否發(fā)生畸形。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干制黃芪莖葉對(duì)孕鼠一般情況及體質(zhì)量增長(zhǎng)情況的影響

試驗(yàn)過程中所有孕鼠均未見異常情況，體質(zhì)量增加正常，未見中毒現(xiàn)象，無(wú)死亡。低、中、高劑量組孕鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)狀況良好，與陰性對(duì)照組比較，受孕大鼠各時(shí)期的體質(zhì)量變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 干制黃芪莖葉對(duì)孕鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況的影響（±s）

表1 干制黃芪莖葉對(duì)孕鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況的影響（±s）

組別陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組受精鼠（n）20 20 20 20受孕鼠（n）16 17 16 16體質(zhì)量（g）第0天187.0±9.5 186.7±11.3 187.0±9.6 186.7±12.3第6天225.6±11.1 222.0±11.6 223.8±10.1 223.2±11.8凈增重（g）38.0±8.7 36.7±9.4 30.9±11.7 38.1±7.7第9天241.7±8.3 238.6±11.3 237.8±11.3 242.1±13.4第12天259.0±9.1 251.8±12.3 254.5±13.1 254.6±16.9第15天274.6±8.5 269.7±12.9 269.8±16.6 273.9±16.0第20天329.7±11.4 318.1±22.0 321.1±15.0 328.2±21.4增重（g）104.1±12.3 96.1±18.4 96.0±13.3 105.0±16.0

2.2 干制黃芪莖葉對(duì)孕鼠生殖功能的影響

與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量組孕鼠的著床、吸收胎等生殖功能的代表性指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明干制黃芪莖葉對(duì)孕鼠的生殖功能未產(chǎn)生損害性作用。見表2。

表2 干制黃芪莖葉對(duì)孕鼠生殖功能的影響

2.3 干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠的影響

2.3.1 對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量組受檢胎鼠的身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、體質(zhì)量和性別比指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響。見表3。

表3 干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響（±s）

表3 干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響（±s）

組別陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組檢查胎鼠數(shù)（n）171 167 170 172身長(zhǎng)（cm）3.68±0.11 3.69±0.09 3.68±0.08 3.70±0.05尾長(zhǎng)（cm）1.48±0.04 1.50±0.06 1.49±0.06 1.48±0.07體質(zhì)量（g）3.89±0.23 3.89±0.28 3.92±0.25 3.97±0.16雄∶雌1∶1.10 1∶0.97 1∶0.98 1∶0.96

2.3.2 對(duì)胎鼠畸變的影響

低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組胎鼠均無(wú)外觀畸形，表明在胎鼠發(fā)育過程中，用干制黃芪莖葉飼喂孕鼠不會(huì)引起胎鼠外觀畸形的發(fā)生。見表4。所有組別均觀察到少數(shù)胎鼠的胸骨發(fā)生缺失以及囟門增大現(xiàn)象，但經(jīng)與陰性對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明干制黃芪莖葉不會(huì)引起胎鼠骨骼畸形的發(fā)生。見表5。內(nèi)臟觀察顯示，低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組胎鼠均無(wú)內(nèi)臟畸形的發(fā)生（P＞0.05）。見表6。

表4 干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠外觀畸形的影響

表5 干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠骨骼畸形的影響

表6 干制黃芪莖葉對(duì)胎鼠內(nèi)臟畸形的影響

3 討論

黃芪莖葉的藥用和食用歷史悠久，近年來，關(guān)于黃芪莖葉的基礎(chǔ)研究大多集中在主要成分、藥理作用等方面。雖然黃芪莖葉在醫(yī)療保健方面的作用已得到廣泛認(rèn)可，但相關(guān)的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和支持資料較少，尤其是關(guān)于致畸的研究。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，PARK等［12］對(duì)黃芪莖葉喂養(yǎng)90 d 的小鼠進(jìn)行了試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示劑量為5 000 mg/kg 時(shí)仍未見毒性；宮新城等［13］用黃芪莖葉煎劑浸料飼喂懷孕6 d的小鼠，結(jié)果表明在飼料中加入黃芪莖葉可以明顯提高仔鼠的出生體質(zhì)量和生長(zhǎng)速度，后代體質(zhì)明顯好于對(duì)照組。李永［14］對(duì)黃芪茯苓制劑灌胃大鼠后的生殖毒性和胚胎致畸性進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示復(fù)方黃芪茯苓制劑無(wú)明顯致畸作用。朱玉平等［15］研究了黃芪甲苷對(duì)SD大鼠的致畸作用，結(jié)果表明黃芪甲苷在1.0 mg/kg 劑量時(shí)對(duì)SD 大鼠有一定母體毒性和胚胎毒性，但在受試劑量下無(wú)胎兒毒性，也無(wú)明顯的致畸作用。孫建琴等［16］對(duì)黃芪復(fù)方營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行了大鼠致畸試驗(yàn)，結(jié)果顯示該營(yíng)養(yǎng)液對(duì)孕鼠無(wú)母體毒性、胚胎毒性和致畸作用。朱江波等［17］研究了黃芪甲苷對(duì)大鼠和兔的生殖毒性作用，表明了黃芪甲苷在1.0 mg/kg 條件下對(duì)兔有胚胎毒性，無(wú)致畸作用。丁伯良等［18］利用膜莢黃芪莖葉粉進(jìn)行小鼠毒性反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示日糧中搭配20%的莖葉粉時(shí)，小鼠于第32天中毒死亡，中毒癥狀類似瘋草中毒。然而多篇文獻(xiàn)報(bào)道，蒙古黃芪和膜莢黃芪莖葉中并不含有可導(dǎo)致中毒的物質(zhì)，其產(chǎn)生的結(jié)果可能是由于實(shí)驗(yàn)時(shí)給小鼠誤服了黃芪屬中其他形態(tài)上類似于膜莢黃芪的有毒植物［19］。本研究在試驗(yàn)劑量下未見大鼠母體毒性和致畸作用，與現(xiàn)有研究成果結(jié)果類似，但結(jié)合既往相關(guān)研究來看，仍需在一定程度上嚴(yán)格把控使用劑量。

隨著人們生活健康水平的提升，天然的食療保健產(chǎn)品逐漸受到更多的關(guān)注，在這種形勢(shì)下，科學(xué)合理地綜合開發(fā)富含生物活性有效成分、氨基酸、維生素的黃芪莖葉，使人們通過膳食方式提升免疫力，促進(jìn)身體健康，具有重要和深遠(yuǎn)的社會(huì)意義。天然植物原料的致畸試驗(yàn)是指通過觀察該原料在動(dòng)物母體吸收后對(duì)胚胎的正常發(fā)育和器官形成的影響作用，對(duì)該原料作為食品應(yīng)用的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中將干制黃芪莖葉提取物用于大鼠致畸試驗(yàn)，受孕大鼠無(wú)中毒現(xiàn)象發(fā)生，對(duì)大鼠的體質(zhì)量、受孕情況、活胎/吸收胎/死胎率和平均活胎數(shù)等均無(wú)顯著影響；對(duì)胎鼠骨骼畸形和內(nèi)臟畸形的發(fā)生均無(wú)明顯影響。低、中、高劑量組胎鼠的體質(zhì)量、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)等與陰性對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異。