手性衍生化試劑PPZ - Pro - NHS的合成及其在D/L - 氨基酸分離中的應用

馮磊寧， 張波， 金佑熙， 金彪， 金東日*

( 1.延邊大學 理學院， 吉林 延吉 133002； 2.吉林煙草工業(yè)有限責任公司 延吉卷煙廠， 吉林 延吉 133001；3.延邊大學 分析測試中心， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

L- 氨基酸是構成人體中某些生物酶和活性蛋白質分子的重要物質，目前已在食品、醫(yī)藥以及化妝品等領域被廣泛應用[1].2002年， N.Fujii在動物和人體中發(fā)現(xiàn)了D- 氨基酸[2]，隨后經其他學者進一步研究發(fā)現(xiàn)D- 氨基酸與人體的某些疾病密切相關,如阿爾茲海默癥、抑郁癥和精神分裂癥等[3-6]，但人體過量攝取D- 氨基酸會引發(fā)中毒.氨基酸是眾多藥物合成的中間物質原料[7].在選用氨基酸合成藥物時，為使藥物形成單一對映體，通常選用D- 氨基酸或L- 氨基酸;然而非天然氨基酸絕大部分都是以外消旋體形式存在的，因此建立一種能夠對D/L- 氨基酸進行高效的分離分析方法具有重要意義.

研究表明，高效液相色譜法(HPLC)分離測定氨基酸具有速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，已成為目前分離分析對映體化合物的主要方法之一[8].HPLC分離對映體化合物的方法可分為直接法(手性流動相法和手性固定相法)和間接法(手性衍生試劑(CDR)法)[9-10]，其中間接法更適合于分離分析氨基酸[11].目前，利用間接法分離分析氨基酸時使用的衍生化試劑主要有N-[1- 氧代 -5-(三苯基膦)戊基]-(R)-1,3- 噻唑烷基 -4-N- 羥基琥珀酰亞胺酯溴鹽[12]、(±)-1-(9- 芴基)氯甲酸乙酯[13]、焦谷氨酸丁二酰亞胺酯(l - PGA - OSu)[14]和(S)-2,5- 二氧吡咯烷 -1- 基 -1-(4,6- 二甲氧基 -1,3,5- 三嗪 -2- 基)吡咯烷 -2- 羧酸鹽(DMT -(S)- Pro - OSu)[15]等，但這些衍生化試劑都存在反應易生成多級衍生物、反應條件需要密閉避光、衍生化試劑水解產物影響分離、衍生化試劑制備繁瑣等問題[16].2021年， Jin等[17]合成了一種手性衍生化試劑(S)-1-(5-(4- 甲基哌嗪 -1- 基)-2,4- 二硝基苯基)吡咯烷 -2- 羧酸(PPZ - Pro)，但研究發(fā)現(xiàn)PPZ - Pro與氨基酸進行衍生化反應時，氨基酸之間會縮合生成副產物肽，即PPZ - Pro不適用于氨基酸的衍生化反應；為此，本文在PPZ - Pro基礎上設計合成了一種新的衍生化試劑(S)-2,5- 二氧吡咯烷 -1- 基 -1-(5-(4- 甲基哌嗪 -1- 基)-2,4- 二硝基苯基)吡咯烷 -2- 羧酸酯(PPZ - Pro - NHS).PPZ - Pro - NHS可在溫和的反應條件下選擇性地與氨基酸反應生成氨基酸衍生物.利用HPLC法將PPZ - Pro - NHS應用于19種氨基酸的分離中顯示，其可有效實現(xiàn)19種氨基酸對映體的分離.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

SPD -16高效液相色譜儀，日本島津制作所；AV Ⅲ - Ascend 500 HD超導傅里葉核磁共振譜儀，布魯克公司； 1200RRLC - 6410B液相 - 串聯(lián)四級桿液質儀，安捷倫公司； FD - ID - 50冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司； N -100旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司; FD - ID - 50冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司； X - 5顯微熔點測定儀 - 控溫型，北京泰克儀器有限公司.

1.2 實驗試劑

乙腈(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；二氯甲烷(分析純)、甲醇(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司；甲酸(色譜級)、L- 脯氨酸(99.0%)、1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(98.0%)、D/L- 纈氨酸(98.0%)、D/L- 蘇氨酸(>98.0%)、D/L- 半胱氨酸(97.0%)、D/L- 谷氨酸(>92.0%)、D/L- 苯丙氨酸(>98.0%)、D/L- 絲氨酸(98.0%)、D/L- 丙氨酸(99.0%)、D/L- 天冬氨酸(98.0%)、D/L- 精氨酸(98.0%)、D/L- 組氨酸(98.0%)、D/L- 異亮氨酸(98.0%)、D/L- 賴氨酸(99.0%)、D/L- 脯氨酸(99.0%)、D/L- 甲硫氨酸(99.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺(>99.0%)、N- 羥基琥珀酰亞胺(>98.0%)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無水硫酸鎂(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司； D/L- 酪氨酸(99.0%)，北京伊諾凱科技有限公司； D/L- 谷氨酰胺(>98.0%)，阿達瑪斯試劑有限公司； D/L- 亮氨酸(>98.0%)，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司； D/L- 天冬酰胺(98.0%)、D/L- 色氨酸(98.0%)、L- 纈氨酸、L- 蘇氨酸、L- 半胱氨酸、L- 酪氨酸、L- 谷氨酸、L- 苯丙氨酸、L- 絲氨酸、L- 丙氨酸、L- 天冬氨酸、L- 谷氨酰胺、L- 精氨酸、L- 組氨酸、L- 異亮氨酸、L- 賴氨酸、L- 天冬酰胺、L- 亮氨酸、L- 色氨酸、L- 脯氨酸、L- 甲硫氨酸，吉爾生化(上海)有限公司；按文獻[17]方法制備PPZ - Pro；實驗用水為超純水，由延邊大學理學院化學實驗樓超純水制造系統(tǒng)制備.

1.3 PPZ - Pro - NHS的合成及表征

在含有30 mL二氯甲烷的100 mL茄形瓶中分別加入PPZ - Pro (379 mg，1 mmol)、 N- 羥基琥珀酰亞胺(NHS)(0.126 6 g，1.1 mmol)和EDC(0.210 9 g，1.1 mmol)和，超聲震蕩1 min后在室溫下(25 ℃)攪拌反應12 h.反應結束后，用5 mL的超純水對反應后所得的溶液進行洗滌萃取(萃取3次).收集(含有PPZ - Pro - NHS)二氯甲烷層后向其中加入無水MgSO4，并在4 ℃溫度下靜置2 h.過濾去除MgSO4，在2～4 ℃的溫度下對溶液進行減壓濃縮，得到黃色黏液狀產物.冷凍干燥該黃色黏液狀產物，得到黃色的固體粉末(PPZ - Pro - NHS)161.8 mg，產率為34%.PPZ - Pro - NHS的m.p.為107.2～107.5 ℃，色譜純度為95.3%.ESI - MS:m/z=477.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz,MeOD) δ 8.54(s,1H), 6.33(s,1H), 5.14(t,J=7.3 Hz,1H), 3.65～3.42(m,2H), 3.32(t,J=4.9 Hz,4H), 2.86(s,4H), 2.71(t,J=3.0 Hz,4H), 2.54(s,3H), 2.35(ddt,J=13.1,9.0,6.8 Hz,1H), 2.26～2.03(m,3H).13C NMR(500 MHz,MeOD) δ 174.82(s), 170.07(d,J=255.4 Hz), 150.40(d,J=57.8 Hz), 146.31(d,J=56.7 Hz), 129.26(s), 106.04(s), 63.62(s), 55.10(d,J=4.9 Hz), 53.06(d,J=19.5 Hz), 50.85(s), 45.27(s), 31.87(s), 26.34(s), 25.92(d,J=42.5 Hz).

1.4 標準溶液的配制

稱取47.6 mg(0.1 mmol) PPZ - Pro - NHS置于10 mL的容量瓶中，然后用乙腈將其溶解并定容至10 mL，由此得到10 mmol/L的PPZ - Pro - NHS標準溶液.

分別稱取D/L- 亮氨酸、L- 亮氨酸、D/L- 異亮氨酸、L- 異亮氨酸、D/L- 丙氨酸、L- 丙氨酸、D/L- 色氨酸、L- 色氨酸、D/L- 脯氨酸、L- 脯氨酸、D/L- 纈氨酸、L- 纈氨酸、D/L- 甲硫氨酸、L- 甲硫氨酸、D/L- 苯丙氨酸、L- 苯丙氨酸、D/L- 絲氨酸、L- 絲氨酸、D/L- 蘇氨酸、L- 蘇氨酸、D/L- 谷氨酰胺、L- 谷氨酰胺、D/L- 半胱氨酸、L- 半胱氨酸、D/L- 賴氨酸、L- 賴氨酸、D/L- 精氨酸、L- 精氨酸、D/L- 組氨酸、L- 組氨酸、D/L- 天冬氨酸、L- 天冬氨酸、D/L- 谷氨酸、L- 谷氨酸各0.1 mmol，將其分別轉移至10 mL的容量瓶中后用乙腈溶劑(V(水)∶V(乙腈)=7∶3)將其定容至10 mL，由此得到10 mmol/L的上述溶液的標準溶液.

分別稱取D/L- 酪氨酸、L- 酪氨酸、D/L- 天冬酰胺和L- 天冬酰胺各0.1 mmol，將其分別轉移至100 mL的容量瓶中后用乙腈溶劑(V(水)∶V(乙腈)=7∶3)將其定容至100 mL，由此得到1 mmol/L的上述溶液的標準溶液.

吸取280 μL的三乙胺(TEA)(2 mmol)置于10 mL的容量瓶中，然后用乙腈將其稀釋至10 mL，由此得到200 mmol/L的三乙胺溶液.上述所有溶液均在4 ℃下密封保存.

1.5 衍生化反應

分別取100 mmol/L TEA(120 μL)、10 mmol/L PPZ - Pro - NHS(40 μL)和1 mmol/L氨基酸(40 μL)并將其加入到1.5 mL聚丙烯離心管中.用漩渦混合器震蕩1 min后將離心管放入到到恒溫(25 ℃)金屬浴裝置內反應40 min.反應結束后，取反應液2 μL進行HPLC - UV檢測.

1.6 色譜條件

色譜柱為Mightsil RP - 18 GP (150 mm×4.6 mm， 3 μm)；流動相A為水溶液(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸)，流動相B為甲醇(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸)；流速為0.3 mL/min；柱溫為25 ℃；UV檢測器波長為354 nm；進樣量為2 μL.

2 結果與討論

2.1 PPZ - Pro - NHS的結構認定

在二氯甲烷溶劑中， PPZ - Pro與NHS反應生成PPZ - Pro - NHS.根據(jù)反應液中各組分的水溶性(PPZ - Pro、EDC和NHS易溶于水，PPZ - Pro - NHS易溶于二氯甲烷)，以水為萃取劑萃取未反應的PPZ - Pro、NHS和EDC.由此得到的PPZ - Pro - NHS的色譜純度如圖1所示.由圖1可以看出，其色譜純度達到95.3%.利用核磁共振波譜法(1H NMR、13C NMR)和質譜(MS)對其結構進行表征顯示，該物質為目標物PPZ - Pro - NHS.

圖1 PPZ - Pro - NHS的色譜純度

2.2 PPZ - Pro - NHS與氨基酸發(fā)生衍生化反應的條件

圖2為PPZ - Pro - NHS與氨基酸的反應式.由圖2可以看出，在堿性介質(TEA)中PPZ - Pro - NHS與氨基酸反應生成的是穩(wěn)定的衍生物.在TEA介質中，本文以D - Leu和L - Leu作為氨基酸模型，探究反應介質濃度、反應溫度和反應時間對該衍生化反應的影響.

圖2 PPZ - Pro - NHS與氨基酸的反應

1)反應介質(TEA)的濃度對衍生化反應的影響.在25 ℃下，選取5個不同濃度的TEA溶液(分別為0、50、100、150、200 mmol/L)分別與D - Leu和L - Leu進行衍生化反應(反應時間均為40 min)，其結果如圖3所示.由圖3可以看出：當TEA濃度小于100 mmol/L時，D - Leu和L - Leu衍生物的峰面積隨TEA濃度的增加而增大；當TEA濃度大于100 mmol/L時，各衍生物峰面積基本保持恒定.因此，本文將100 mmol/L TEA溶液作為最佳反應介質.

圖3 TEA濃度對衍生化反應的影響

2)反應時間對衍生化反應的影響.在反應溫度為25 ℃和反應介質為100 mmoL/L TEA條件下，將D - Leu和L - Leu分別反應10、20、30、40、50、60 min，其結果如圖4所示.由圖4可以看出，反應時間為40 min時衍生化反應的產率最高，因此本文選定40 min為最佳反應時間.

圖4 反應時間對衍生化反應的影響

3)反應溫度對衍生化反應的影響.在反應介質為100 mmol/L TEA和反應時間為40 min的條件下，選取不同的反應溫度(分別為10、20、30、40、50、60 ℃)進行D - Leu和L - Leu的衍生化反應，結果如圖5所示.由圖5可以看出，在不同溫度下均能夠順利地進行衍生化反應，因此本實驗選擇常溫(25 ℃)作為反應溫度.

圖5 反應溫度對衍生化反應的影響

2.3 HPLC分離D/L - 氨基酸

為分離不同氨基酸，本文使用6種不同的流動相比例(A與B的體積比分別為49∶51、55∶45、58∶42、60∶40、70∶30、75∶25)對19種氨基酸進行了分離.

圖6(a)是D/L- 組氨酸衍生物的色譜圖.圖6(a)中有3個峰，其色譜保留時間分別為5.5、6.1、24.4 min.其中保留時間為5.5 min和6.1 min的峰是D/L- 組氨酸衍生物產生的峰，保留時間為24.4 min的峰是反應后剩余的衍生化試劑PPZ - Pro - NHS產生的峰.為了確認D- 組氨酸和L- 組氨酸的流出順序，對L- 組氨酸與PPZ - Pro - NHS反應后的產物進行了HPLC分析，結果如圖6(b)所示.由圖6(b)可以看出， L- 組氨酸在色譜柱上先流出，其分離度(Rs)為1.38.表1為19種氨基酸衍生物的保留時間(tR)、Rs和流動性條件.由表1可知，大部分氨基酸的Rs大于1.5， 其中L- 氨基酸先流出的是Ser、Thr、Glu、Lys、Cys、Gln、Asp和Asn， D- 氨基酸先流出的是Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、His、Arg、Tyr和Ala.

圖6 組氨酸衍生物的高效液相色譜圖

表1 19種氨基酸的保留時間、分離度和流動相條件

表2是PPZ - Pro - NHS和文獻[14-15]報道的手性衍生化試劑對19種氨基酸的分離度.由表2可以看出，文獻[14-15]采用的色譜柱雖然比本實驗所用的色譜柱的柱效更高，但L - PGA - Osu沒能分離出Ser、Thr、Glu、Lys、Cvs、Gln、Asp、Asn、His和Arg， DMT -(S)- Pro - Osu沒能分離出Ser和Cys.這表明，本文制備的手性衍生化試劑PPZ - Pro - NHS對氨基酸對映體的分離能力優(yōu)于文獻[14-15]報道的衍生化試劑.

表2 不同衍生化試劑對氨基酸對映體的分離度

注: -為未分離出氨基酸對映體.

3 結論

本文利用(S)-1-(5-(4- 甲基哌嗪 -1- 基)-2,4- 二硝基苯基)吡咯烷 -2- 羧酸(PPZ - Pro)和N- 羥基琥珀酰亞胺(NHS)成功地合成了一種新的手性衍生化試劑PPZ - Pro - NHS.PPZ - Pro - NHS可在溫和的反應條件下選擇性地與氨基酸反應生成氨基酸衍生物.利用反相高效液相色譜儀對PPZ - Pro - NHS與氨基酸反應生成的氨基酸衍生物進行色譜分析顯示，19種氨基酸衍生物在常規(guī)C18色譜柱上均具有較好的分離度(1.05～6.08)，因此本文合成的PPZ - Pro - NHS在氨基酸對映體和手性藥物的分離和分析方面具有較好的應用前景.