豬偽狂犬病病毒TK/gE/gI缺失株的構(gòu)建及與Montanide Gel 01佐劑聯(lián)合免疫效果評價

顏志斌，陳美靜，唐 棟，任小波，吳曉燕，紀秋云，劉家齊，何淑菲，琚春梅 (華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州 510642)

偽狂犬病病毒(PRV)屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬[1]。PRV可引起妊娠母豬流產(chǎn)、成年豬的呼吸系統(tǒng)疾病及仔豬的神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡[2-4]。自2011年以來，在接種了Bartha-K61疫苗的豬群中出現(xiàn)了偽狂犬病(PR)的暴發(fā)[5]。經(jīng)基因組測序研究發(fā)現(xiàn)，本輪PR暴發(fā)是由新的變異毒株所引起[6]。同時有研究表明，Bartha-K61疫苗不能對新的PRV變異株提供完全有效的保護[7]。因此，迫切需要研發(fā)更有效的針對PRV變異株的疫苗以提高豬群的抵抗力。

TK基因是PRV的主要毒力基因，同時也是病毒增殖的非必需基因，缺失后不但可使病毒的毒力大大降低，而且對病毒的增殖特性影響很小[8]，因此可以通過缺失TK基因來制備PRV弱毒疫苗。同時，通過添加適當?shù)淖魟梢允挂呙绲拿庖咝Ч@著提升。本試驗選用的佐劑Montanide Gel 01(MG01)是一種聚合物佐劑，現(xiàn)有研究表明，牛皰疹病毒、大腸桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗與MG01聯(lián)合使用時，其免疫效果明顯增強[9-11]。

1 材料與方法

1.1 毒株與試劑PRV gE/gI雙基因缺失突變株rPRV-AH-gE-/gI-為前期研究中所構(gòu)建[12]。PRV流行毒株PRV-AH[13]、BHK-21細胞、EscherichiacoliDH5α、pEGFP-N1質(zhì)粒均由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物學教研室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、Hind Ⅲ及pMD18-T均購自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent 購自Invitrogen公司；低熔點瓊脂糖購自Sigma公司；病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒均購自Omega公司；PCR Mix試劑、DNA Marker、無縫克隆試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司。

1.2 實驗動物4周齡SPF雌性昆明小鼠，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 引物設計以GenBank登錄的PRV ZJ01(GI：32187339)基因組為參考序列，用Primer 5.0軟件分別設計TK基因的上臂(TK-LA)與下臂(TK-RA)的克隆引物TK-LA-F/TK-LA-R、TK-RA-F/TK-RA-R，及用于TK基因檢測的鑒定引物TK-F/TK-R。以GenBank登錄的pEGFP-N1(GI：1377911)序列為參考序列，設計出擴增EGFP完整表達盒的無縫克隆引物EGFP-Sosoo-F/EGFP-Sosoo-R(表1)。

表1 PCR引物信息

1.4 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定分別采用引物TK-LA-F/TK-LA-R、TK-RA-F/TK-RA-R，并以PRV-AH基因組DNA為模板對TK-LA、TK-RA進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物TK-LA與pMD18-T進行連接，得到質(zhì)粒pMD-TK-LA。將pMD-TK-LA以及PCR產(chǎn)物TK-RA經(jīng)Pst Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切后進行連接，得到質(zhì)粒pMD-TK-LA-RA。采用引物EGFP-Sosoo-F/EGFP-Sosoo-R，以pEGFP-N1為模板，對EGFP完整表達盒進行克隆。用無縫克隆連接試劑盒將EGFP完整表達盒與pMD-TK-LA-RA進行無縫克隆連接，得到質(zhì)粒pMD-TK-LA-EGFP-RA(圖1A)。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-TK-LA-RA、pMD-TK-LA-EGFP-RA進行酶切及測序鑒定。

1.5 重組病毒的構(gòu)建及鑒定采用Lipofectamine 2000 Reagent將pMD-TK-LA-EGFP-RA轉(zhuǎn)染BHK-21細胞中，4 h后將rPRV-AH-gE-/gI-接種已轉(zhuǎn)染細胞，使pMD-TK-LA-EGFP-RA和rPRV-AH-gE-/gI-在BHK-21細胞中進行同源重組。48 h 后收獲細胞培養(yǎng)液，再接種于BHK-21細胞中，并進行3～4次的空斑純化，得到rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-。將純化后的rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-接種于BHK-21細胞中，待細胞病變約90%時收獲病毒，并提取病毒DNA。用鑒定引物TK-F/TK-R對病毒DNA進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測以及測序鑒定。用上述方法，將pMD-TK-LA-RA與rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-進行同源重組，空班純化后得到rPRV-AH-TK-/gE-/gI-，提取病毒DNA進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測以及測序鑒定。重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-構(gòu)建圖如圖1B所示。

A.質(zhì)粒pMD-TK-LA-RA與pMD-TK-LA-EGFP-RA的構(gòu)建；B.重組病毒rPRV-AH-TK-gE-/gI-的構(gòu)建圖1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與重組病毒的構(gòu)建圖

1.6 重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的生物學特性

1.6.1重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的遺傳穩(wěn)定性分析 將rPRV-AH-TK-/gE-/gI-接種于BHK-21細胞中，待細胞病變完全后收獲，并接種于新的BHK-21細胞中，如此反復將病毒傳代至20代。分別將第1，5，10，15，20代收獲的病毒液進行病毒DNA提取，用引物TK-F/TK-R進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6.2重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的生長特性測定 將rPRV-AH-TK-/gE-/gI-和PRV-AH以0.01 MOI(multiple of infection)的病毒量接種BHK-21細胞，并于接毒后1，8，16，24，32，40，48，56，64，72 h收獲病毒，并對各個時間點的病毒進行滴度測定，用Reed-Muench法計算出TCID50，并根據(jù)結(jié)果繪制病毒的一步生長曲線。

1.7 動物試驗將4周齡昆明小鼠隨機分為7組(A～G組)，每組8只。A～D組的小鼠分別在后腿肌肉接種106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-、105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-、106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01、105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01。E組為商品化弱毒疫苗HB-2000對照組，F(xiàn)組接種DMEM作為未免疫對照組，G組接種DMEM+MG01作為佐劑對照組。A～G組每只小鼠的接種量均為100 μL，MG01佐劑的含量為10%。在試驗0，21 d分別對小鼠進行免疫接種。在首免后0，14，28，42 d對小鼠進行采血，并用中和試驗檢測血清中和抗體水平。在首免后0，2，4，6周分別測量各組小鼠體質(zhì)量，并計算各組平均體質(zhì)量。在首免后42 d對小鼠進行PRV-AH強毒攻擊，攻毒劑量為106TCID50，攻毒后對小鼠進行14 d的觀察，記錄小鼠死亡情況并繪制生存曲線。

1.8 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prismversion 6.0進行統(tǒng)計分析。通過t檢驗對不同組別之間的數(shù)據(jù)進行分析。統(tǒng)計學上顯著性分別表示為*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定將pMD-TK-LA-RA分別經(jīng)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ和Pst Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得片段大小分別為3 829，729 bp和3 428，1 140 bp(圖2A)，其中729 bp為TK-LA，1 140 bp片段為TK-RA，表明重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-TK-LA-RA構(gòu)建正確。

將pMD-TK-LA-EGFP-RA經(jīng)EcoR Ⅴ單酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果獲得片段大小為4 568，1 799 bp(圖2B)，其中1 799 bp片段為EGFP完整表達盒，表明重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMD-TK-LA-EGFP-RA構(gòu)建正確。

A.pMD-TK-LA-RA的酶切鑒定(M.DL5000 DNA Marker；1.pMD-TK-LA-RA/EcoR Ⅰ+Pst Ⅰ；2.pMD-TK-LA-RA/Hind Ⅲ+Pst Ⅰ;3.pMD-TK-LA-RA質(zhì)粒)；B.pMD-TK-LA-EGFP-RA的酶切鑒定(M.DL10000 DNA Marker；1.pMD-TK-LA-EGFP-RA；2.pMD-TK-LA-EGFP-RA/EcoR Ⅴ)圖2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.2 重組病毒的鑒定重組病毒rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-、rPRV-AH-TK-/gE-/gI-經(jīng)空斑純化后，接種BHK-21細胞，并在熒光顯微鏡下進行觀察。結(jié)果顯示，rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-感染細胞發(fā)出綠色熒光，而rPRV-AH-TK-/gE-/gI-感染細胞無綠色熒光出現(xiàn)，表明rPRV-AH-TK-/gE-/gI-中已成功缺失EGFP基因(圖3)。

a.白光視野；b.紫外光視野圖3 重組病毒的熒光鑒定

提取rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-和rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的基因組DNA，并以其為模板，用鑒定引物TK-F/TK-R分別進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得條帶大小分別為2 159，329 bp(圖4)，表明rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-已成功缺失TK基因，并在缺失部位插入篩選標記EGFP基因，rPRV-AH-TK-/gE-/gI-中已成功缺失TK基因和EGFP基因。

M.DL5000 DNA Marker；1.rPRV-AH-TK-/gE-/gI-；2.rPRV-AH-TK-/EGFP+/gE-/gI-；3.PRV-AH；4.BHK-21細胞圖4 重組病毒的PCR鑒定

2.3 重組病毒的生物學特性試驗取rPRV-AH-TK-/gE-/gI-第1，5，10，15，20代病毒進行DNA提取，并用引物TK-F/TK-R進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果均獲得條帶大小為329 bp的片段(圖5A)，表明重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

將rPRV-AH-TK-/gE-/gI-和PRV-AH分別以0.01 MOI接種于BHK-21細胞，接種后于多個時間點收獲病毒并進行病毒滴度測定，繪制一步生長曲線。結(jié)果顯示，rPRV-AH-TK-/gE-/gI-在各時間點上的病毒滴度與親本毒株PRV-AH相近，經(jīng)統(tǒng)計學分析無顯著性差異(圖5B)，表明TK基因缺失后，對rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的增殖無明顯影響。

A.rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的遺傳穩(wěn)定性檢測(M.DL5000 DNA Marker；1～5.第1，5，10，15，20代病毒；6.PRV-AH；7.BHK-21細胞)；B.病毒的生長曲線圖5 重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的遺傳穩(wěn)定性及生長曲線

2.4 重組病毒的安全性評價重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫小鼠與其他試驗組小鼠在攻毒前均未表現(xiàn)任何臨床癥狀。在首免后0，2，4，6周分別測量各組小鼠體質(zhì)量，并計算各組平均體質(zhì)量，結(jié)果顯示，重組病毒rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫小鼠與其他試驗組小鼠的平均體質(zhì)量在統(tǒng)計學上差異不顯著，表明rPRV-AH-TK-/gE-/gI-作為弱毒疫苗對小鼠是安全的(圖6)。

圖6 免疫后不同時間各試驗組小鼠體質(zhì)量變化情況

2.5 重組病毒及其與MG01聯(lián)合免疫效果評價各試驗組小鼠中和抗體水平如圖7所示。各組小鼠的平均抗體水平在首免后逐漸升高。在首免后42 d時，105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組抗體水平低于商品疫苗組(P<0.01)，而106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組的抗體水平與商品疫苗組相近。通過與MG01聯(lián)合免疫，105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01免疫組的抗體水平與商品疫苗組相近，而106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01免疫組的平均抗體水平顯著高于商品疫苗組(P<0.000 1)，約為商品疫苗組的6倍。當免疫劑量為106TCID50時，rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01免疫組小鼠的血清抗體水平顯著高于rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組(P<0.000 1)；在免疫劑量為105TCID50時，rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01免疫組中和抗體水平略高于rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組(P<0.05)。

A～C.分別為首免后14，28，42 d圖7 免疫后不同時間各組小鼠血清中和抗體水平檢測結(jié)果

在首免后42 d，用106TCID50PRV-AH對各組小鼠進行攻毒，攻毒后觀察14 d，記錄各組小鼠臨床癥狀及死亡時間并繪制生存曲線。結(jié)果顯示，無論是106TCID50或105TCID50的免疫劑量，在rPRV-AH-TK-/gE-/gI-+MG01聯(lián)合免疫組，小鼠存活率均為100%。106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組的存活率為62.5%，而105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-組的存活率僅為12.5%。商品疫苗組的存活率為37.5%，介于106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組和105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組之間(圖8)。

圖8 106 TCID50 PRV-AH攻毒后各組小鼠的生存曲線

3 討論

本研究成功構(gòu)建了rPRV-AH-TK-/gE-/gI-，結(jié)果顯示，病毒的TK基因缺失后對其生長特性無顯著影響，這也與TK基因的特性一致。從小鼠動物試驗結(jié)果可以看出，106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組小鼠無論是中和抗體水平，還是攻毒保護效果均優(yōu)于105TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫組，表明106TCID50rPRV-AH-TK-/gE-/gI-免疫劑量對小鼠的免疫效果更好。在rPRV-AH-TK-/gE-/gI-與MG01聯(lián)合免疫時，106TCID50免疫劑量誘導的中和抗體水平遠高于105TCID50，但兩者對106TCID50PRV-AH強毒攻擊的保護力均為100%，且均高于rPRV-AH-TK-/gE-/gI-單獨免疫組，表明MG01佐劑在提高PRV弱毒疫苗免疫效果方面具有良好的作用，其作用效果與弱毒疫苗免疫劑量密切相關。

綜上所述，本研究以PRV變異株為親本株構(gòu)建了弱毒疫苗候選毒株 rPRV-AH-TK-/gE-/gI-，并評價了Montanide Gel 01佐劑對rPRV-AH-TK-/gE-/gI-的免疫增強作用效果，研究結(jié)果為研制針對PRV變異株的弱毒疫苗奠定了基礎，同時結(jié)合PRV gE鑒別診斷方法的使用，有利于豬場PR的凈化與根除。