紫外分光光度法快速檢測百草枯中毒

陳姿如，杜書明

百草枯(paraquat, PQ)，是一種快速滅生性除草劑，可經(jīng)由皮膚、黏膜、呼吸道、消化道等進入人體，以肺部分布最多，損傷最大，肺纖維化伴呼吸衰竭是患者中毒后期死亡的主要原因，且因其在臨床上沒有特效解毒的手段，病死率高達80%以上[1，2]。我國2016年7月禁止生產(chǎn)和使用百草枯，但臨床上百草枯中毒案例依舊存在。中毒患者體內(nèi)百草枯濃度與病死率有著密切的關(guān)系，測定患者血漿中百草枯濃度不僅有助于準確診斷，并對制定合理的治療方案有重要意義。本實驗旨在探討使用合適的樣品前處理方法，建立靈敏、快速檢測百草枯中毒的紫外分光光度法，為基層醫(yī)院快速診斷百草枯中毒提供幫助。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 采用UV-2600紫外/可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；7820氣相色譜儀(山東魯南瑞紅化工儀器有限公司)，氮磷檢測器(NPD)，DB-5毛細色譜柱(30 m×0.23 mm×0.25 μm)，LC-LX-H165A高速離心機。試劑：保險粉(連二亞硫酸鈉)，碳酸氫鈉，飽和氫氧化鈉溶液(現(xiàn)配)，20%高氯酸甲醇溶液，20%硼氫化鈉溶液，環(huán)己烷化學(xué)試劑均為分析純，百草枯對照品購自上海甄準生物科技有限公司。

1.2 試驗方法 抽取患者靜脈血3 ml(同時做健康人對照)，3000 r/min高速離心后，取0.5 ml血漿于帶蓋的5 ml塑料試管中，加新鮮配制的20%高氯酸甲醇溶液0.2 ml 充分振蕩30 s混勻，以 12 000 r/min高速離心10 min。取上清液0.5 ml，加入碳酸氫鈉0.2 mg堿化和連二亞硫酸鈉0.5 mg顯色，再加飽和氫氧化鈉溶液0.1 ml增色，pH>14，采用50 μl微量比色池，設(shè)置200～700 nm波長自動掃描，以蒸餾水做基線測量，掃描待測液，百草枯吸收峰出現(xiàn)在紫外區(qū)(395±2)nm和可見光區(qū)(605±2)nm，空白液掃描不顯色，無吸收峰，記錄最大吸收峰(605±2)nm吸光度，查標準曲線或回歸方程求出血漿中百草枯含量。另取0.5 ml血漿加入20%高氯酸甲醇溶液高速離心取上清液加強和氫氧化鈉液0.1 ml，再加入20%硼氫化鈉溶液0.5 ml，于室溫反應(yīng)30 min，加入環(huán)己烷0.5 ml,振蕩30 s，高速離心，取上清液作為檢材樣品衍生液，供氣相色譜分析或氣相色譜質(zhì)譜法分析。

1.3 監(jiān)測指標及標準 檢驗血液中的百草枯，按我國公安部發(fā)布的標準(GA/T1629-2019)執(zhí)行。檢測、工作曲線、檢出限及回收率和精密度試驗結(jié)果，并對百草枯紫外測定方法的特異性和穩(wěn)定性進行分析。

1.4 檢測波長的選擇 配制0、5.0、10.0、15、20.0 μg/ml的百草枯水溶液，以蒸餾水做空白，取5個帶蓋的5.0ml塑料試管加不同濃度百草枯水溶液0.5 ml，空白管加蒸餾水0.5 ml，然后按照1.2血樣處理及試驗方法操作，百草枯最大吸收峰為(605±1)nm，以最大吸收峰定性定量。同時配置0.0、5.0、10.0、20.0μg/ml的百草枯血漿標本，按照1.2血樣處理及試驗方法操作，結(jié)果百草枯掃描可見光最大吸收光譜在(605±1)nm，血漿中的百草枯同樣在(605±2)nm處有最大吸收峰。

1.5 工作曲線和檢出限 精確稱取百草枯對照品100 mg置于100 ml定量瓶中，加蒸餾水配成1 mg/ml的百草枯標準貯存液，貯存液采用健康人血漿配制為0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0、20.0、40 μg/ml標準工作液，按照1.2血樣處理及試驗方法操作。根據(jù)吸光度值(y)和對應(yīng)的濃度(x)繪制標準曲線，百草枯濃度在0.05～40.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程(y)=0.0896+0.0102，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9992，檢測下限為0.05 μg/ml。

1.6 回收率和精密度試驗 采用空白血樣加標的方式進行回收試驗，分別添加0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml共四個水平，每個水平單獨測定5次，回收率為85.0%～94.0%，變異系數(shù)均小于4.8%，見表1。

表1 百草枯回收率和精密度試驗 (n=5；μg/ml)

1.7 百草枯測定方法的特異性和穩(wěn)定性 選取百草枯中毒患者與健康人血漿各20人份，為中毒組與對照組，均加入20%高氯酸甲醇溶液高速離心，分離血漿蛋白，操作按照1.2血樣處理及試驗方法進行。中毒組的血漿中百草枯最大吸收峰均為(605±1)nm，對照組不顯色，掃描無吸收峰，表明方法的特異性良好。上清液加入連二亞硫酸鈉、碳酸氫鈉后顯藍色，但藍色會很快褪色，當(dāng)加入飽和氫氧化鈉液后，會明顯增加藍色深度，提高了試驗方法的靈敏度。穩(wěn)定性試驗：每隔2 min掃描一次吸光度，觀察吸光度的變化，10 min內(nèi)無褪色，10 min后開始逐漸褪色，表明該試驗在顯色10 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，所以應(yīng)在10 min內(nèi)完成比色，即可提高試驗結(jié)果的精密度和準確度。

1.8 監(jiān)測指標及標準結(jié)果對比 為了證實該方法的準確性、可靠性，配置0.0、1.0、5.0、10.0 μg/ml的百草枯血漿標本，按1.2樣品處理及試驗方法操作。同時按照GA/T1629-2019監(jiān)測指標及標準配制試劑，對同一樣品進行衍生化氣相色譜法分析和百草枯顯色紫外分光光度法分析，結(jié)果見表2。

表2 不同檢測方法測定血液百草枯的結(jié)果

2 討 論

堿性的連二亞硫酸鈉可將百草枯還原成藍色的自由基，臨床上利用百草枯這一理化性質(zhì)，已應(yīng)用于尿液中的百草枯測定[3-6]。由于血液單位體積內(nèi)百草枯含量明顯低于尿液[7]，且送檢血液量也較少，且誤服百草枯后送檢樣本多為血液，血液中的百草枯測定往往需要氣相色譜法，液質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法等貴重儀器檢測，基層醫(yī)院實驗室很難做到，采用常規(guī)百草枯顯色測定，準確性較差。所以如何準確、快速檢測血液中的百草枯含量，對臨床救治非常重要。本研究對傳統(tǒng)血液百草枯測定方法進行了改進和探討，在血液離心后取血漿0.5 ml加20%高氯酸甲醇溶液后再次高速離心，上清液用碳酸氫鈉堿化和連二亞硫酸鈉顯色后，再加飽和氫氧化鈉溶液0.1 ml增色，pH>14，使血液中的百草枯測定靈敏度明顯提高，顯色穩(wěn)定性增強，結(jié)果顯示，飽和氫氧化鈉溶液對百草枯測定方法的穩(wěn)定性、靈敏度至關(guān)重要，只要準確把握顯色時間，在10 min內(nèi)完成比色，即可保證試驗方法的準確性。

本研究還以蒸餾水做基線測量，在200～700 nm波長自動掃描百草枯，可以排除血漿基質(zhì)對基線測量的干擾，防止出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百草枯吸收峰出現(xiàn)在紫外區(qū)(395±2)nm和可見光區(qū)(605±2)nm。選擇(605±2)nm為定性定量主峰，按本方法操作一旦在(605±2)nm處出現(xiàn)最大吸收峰，就表明血液中百草枯成分的存在。本研究通過百草枯回收率和精密度試驗顯示：樣品加標回收率為85.0%～94.0%，方法變異系數(shù)均小于4.9%，表明能夠滿足臨床中毒診斷的需要。百草枯濃度在0.05～40.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量檢測下限為0.05 μg/ml。

氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法等采用的儀器價格昂貴，樣品前處理繁瑣用時長，不適合突發(fā)事件的檢測，致使基層醫(yī)院乃至三甲醫(yī)院開展血液百草枯測定受限[4-6]。2018—2020年我院毒檢科共檢測265例百草枯中毒患者，誤服中毒92.1%(244/265)，意外中毒7.9%(21/265)。并抽取其中的100例進行兩種方法對比試驗，結(jié)果證明采用紫外分光光度法與氣相色譜法測定百草枯濃度檢測結(jié)果相同，數(shù)據(jù)準確可靠，無1例漏診誤診。證明紫外分光光度法準確性高，且避免了氣相色譜衍生化中繁瑣的操作過程[8]，操作快速、簡便, 值得臨床推廣應(yīng)用。