MC38結(jié)腸癌小鼠腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化

張波揚(yáng),陳煥鵬,余文蘭,劉忠華,黃朝峰

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣州510642;2.中山大學(xué)人類(lèi)病毒研究所,廣州510080)

異質(zhì)性是惡性腫瘤的重要特征。目前，研究者多從腫瘤本身探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，如腫瘤干細(xì)胞理論、腫瘤遺傳學(xué)等，因此腫瘤曾一致被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)突變的體細(xì)胞遺傳?。?］。近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境免疫特征已經(jīng)被列入腫瘤十大特征之一［2］。探索腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)生的關(guān)系既能預(yù)測(cè)臨床預(yù)后，亦可評(píng)價(jià)放化療效果［3-4］。隨著單細(xì)胞測(cè)序和質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)等新技術(shù)的應(yīng)用，多種新型免疫細(xì)胞亞群得到鑒定，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞成為了研究的熱點(diǎn)之一。

腫瘤微環(huán)境主要是由免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)代謝重編程和低氧調(diào)控等方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［5］。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞主要分為淋巴系來(lái)源和骨髓來(lái)源，淋巴系來(lái)源的主要有CD8+T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）、CD4+T細(xì)胞（regulatory Tcells，Ths）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcells，DC），主要發(fā)揮抗腫瘤作用。髓系來(lái)源的主要是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）和髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC），主要發(fā)揮免疫抑制作用。腫瘤與其微環(huán)境之間的相互作用非常復(fù)雜，免疫浸潤(rùn)成分在每個(gè)腫瘤階段都發(fā)生了變化，特定的細(xì)胞對(duì)患者的生存影響深遠(yuǎn)。其中，T細(xì)胞一直是研究者關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，大多數(shù)T細(xì)胞密度隨腫瘤進(jìn)展而降低，T細(xì)胞的低密度浸潤(rùn)與不良預(yù)后相關(guān)［6-7］，這也是患者生存最重要的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［8-10］。過(guò)繼T細(xì)胞治療的新方法為患者帶來(lái)了新的希望，但是腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是高度不均勻的。除了淋巴系來(lái)源細(xì)胞，大部分髓系成分同樣具有代表性，然而分析Th1和CD8以外的免疫細(xì)胞如何影響臨床效果時(shí)常常得出矛盾的結(jié)果［6］。

目前，腫瘤與宿主免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系尚不明確。通過(guò)繪制動(dòng)態(tài)免疫圖譜的方式，為患者定制免疫特征圖譜，可以識(shí)別動(dòng)態(tài)生物標(biāo)志物，區(qū)分假性治療進(jìn)展，明確具有潛在反應(yīng)的患者，為個(gè)性化精準(zhǔn)治療提供動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方案［11］。本文采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)荷瘤小鼠不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，動(dòng)態(tài)觀察結(jié)腸癌發(fā)展的細(xì)胞學(xué)變化，繪制免疫微環(huán)境的時(shí)空變化景觀，以期為尋找預(yù)后生物標(biāo)志物和開(kāi)發(fā)新的治療方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠24只，體質(zhì)量為19～21 g，42～56日齡，來(lái)源于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（粵）2018-0002］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為44007200068714。動(dòng)物飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境［SYXK（粵）2019-0136］。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合3R原則，經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)2019D086）。

1.2 儀器設(shè)備和試劑

流式細(xì)胞儀（型號(hào)：BD-LSRF fortessa）購(gòu)自美國(guó)BD公司，小鼠結(jié)腸癌MC38細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI 1640（C11875500BT）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。大鼠抗小鼠pecific blue-CD45（48-0451-82）、pecy7-CD3（25-0031-82）、percpcy5.5-CD4（45-0042-82）、APC-CD8（17-0081-83）、PE-NK1.1（12-5941-82）、pecy7-CD11b（25-0112-82）、APC-Ly6G

（17-9668-80）、PE-F4/80（12-4801-82）和pecy7-CD206（25-2061-82）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，F(xiàn)ITC-Ly6C（553104）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，percpcy5.5-CD11c（65-0114-U100）和APC-MHCⅡ（20-5321-U100）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Tonbo Biosciences公司。PBS和D-PBS為實(shí)驗(yàn)室配制，膠原酶2（V900892）、膠原酶4（V900893）、DNA脫氧核糖核苷酸酶1（D4513）和透明質(zhì)酸酶（H3884）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

調(diào)整小鼠結(jié)腸癌MC38細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，均于C57BL/6J小鼠右側(cè)腹股溝處行一次性皮下注射（0.1 mL/只）。24只小鼠均可觀察到腫瘤生長(zhǎng)，在肉眼可觀測(cè)腫瘤大?。ù蠹s荷瘤1周）后，每周觀察一次并使用游標(biāo)卡尺記錄皮下腫瘤的長(zhǎng)寬數(shù)值，腫瘤體積＝長(zhǎng)×寬2/2。每周記錄一次小鼠體質(zhì)量。每周隨機(jī)選取6只小鼠，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平。

1.4 腫瘤組織單細(xì)胞懸液的制備

采用脫頸椎法處死小鼠后，剝離腫瘤組織，冰浴10 min，用1×PBS洗2次，剪碎腫瘤，加入膠原酶2（1 mg/mL）、膠原酶4（1 mg/mL）、透明質(zhì)酸酶（100 U/mL）和DNA脫氧核糖核苷酸酶1（100 U/mL），消化30 min。70μm篩網(wǎng)過(guò)濾腫瘤組織，1×PBS洗1次，終止消化。1×PBS洗1次，吸取10μL細(xì)胞懸液用1×PBS稀釋10倍，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平

將單細(xì)胞懸液調(diào)整至細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL，每管吸取100μL細(xì)胞懸液準(zhǔn)備流式染色。檢測(cè)分3組，先用抗小鼠CD45抗體4℃避光孵育10 min，然后組1加入抗小鼠CD3、CD4、CD8、NK1.1抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，組2加入抗小鼠CD11b、Ly6C、Ly6G抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，組3直接加入抗小鼠CD11c、F4/80、CD206、MHCⅡ抗體和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體。4℃避光孵育30 min后，1×PBS洗1次，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。各免疫細(xì)胞分子標(biāo)志定義如下：CD3+T細(xì) 胞（CD45+CD3+），CD4+T細(xì) 胞（CD45+CD3+CD4+），CD8+T細(xì)胞（CD45+CD3+CD8+），NK細(xì)胞（CD45+CD3－NK1.1+），DC（CD45+CD11c+），總的巨噬細(xì)胞（macrophage，后用Mφ表示）（CD45+F4/80+），Ⅰ型Mφ（CD45+F4/80+MHCⅡ+），Ⅱ型Mφ（CD45+F4/80+CD206+），MDSC（CD45+CD11b+），單核MDSC（M-MDSC）（CD45+CD11b+Ly6C+），粒 細(xì) 胞MDSC（G-MDSC）（CD45+CD11b+Ly6G+）。流式數(shù)據(jù)使用Flowjo-V10軟件分析處理，單位體積浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)＝各亞群細(xì)胞數(shù)/腫瘤體積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行分析。將荷瘤2～4周時(shí)的數(shù)據(jù)分別與荷瘤1周時(shí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，所有計(jì)數(shù)資料以±s表示；組間比較采用方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠腫瘤體積變化及腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)變化

相比荷瘤1周，荷瘤2周和3周時(shí)的小鼠腫瘤體積均明顯增大（P＜0.05），荷瘤4周時(shí)顯著增大（P＜0.000 1），提示腫瘤體積迅速增長(zhǎng)，增長(zhǎng)速率不斷加快（圖1A）。記錄荷瘤4周的6只小鼠體質(zhì)量，結(jié)果顯示在荷瘤1～4周時(shí)未見(jiàn)顯著變化（圖1B）。

從荷瘤1周時(shí)開(kāi)始，每周隨機(jī)選擇6只小鼠剖檢取材并進(jìn)行流式檢測(cè)。結(jié)果顯示，CD45+細(xì)胞比例在荷瘤2周時(shí)較1周時(shí)明顯降低（P＜0.001），荷瘤3周時(shí)顯著降低（P＜0.000 1），荷瘤4周時(shí)雖明顯降低（P＜0.01），但略有回升趨勢(shì)（圖1C）。

為排除腫瘤大小差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，計(jì)算單位體積內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)（各亞群細(xì)胞數(shù)/mm3）以比較單位體積腫瘤內(nèi)的細(xì)胞學(xué)變化。結(jié)果顯示，單位體積腫瘤內(nèi)CD45+細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周時(shí)無(wú)明顯變化（P＞0.05），荷瘤3周時(shí)降低（P＜0.05），荷瘤4周時(shí)顯著降低（P＜0.001）（圖1D）。CD45是白細(xì)胞共同抗原的標(biāo)志，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育、功能調(diào)節(jié)及信號(hào)傳遞中具有重要意義，被廣泛用作浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的整體標(biāo)志物。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，荷瘤1～4周時(shí)CD45+細(xì)胞水平整體呈現(xiàn)驟降趨勢(shì)，但在荷瘤3周后趨于穩(wěn)定（圖1D）。

圖1腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)變化Figure 1 Variations in tumor growth curves and immune cell infiltration

2.2 荷瘤小鼠腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相比荷瘤1周時(shí)，總CD3+T細(xì)胞比例在荷瘤2周下降（P＜0.05），荷瘤3周時(shí)顯著降低（P＜0.000 1），荷瘤4周時(shí)有明顯回升（P＞0.05）（圖2A）；CD4+T細(xì)胞比例在荷瘤2～4周時(shí)均顯著上升（P＜0.000 1，圖2B）；CD8+T細(xì)胞比例在荷瘤2周及3周時(shí)顯著下降（P＜0.01），荷瘤4周時(shí)下降極顯著（P＜0.000 1）（圖2C）。相比荷瘤1周時(shí)，單位體積腫瘤內(nèi)總CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周時(shí)保持平穩(wěn)（P＞0.05），荷瘤3周和4周時(shí)均顯著降低（P＜0.01）（圖2D）；單位體積腫瘤內(nèi)CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2～4周時(shí)均顯著上升（P＜0.01，圖2E）；單位體積腫瘤內(nèi)CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周時(shí)無(wú)明顯變化（P＞0.05），荷瘤3周及4周時(shí)均降低（P＜0.05）（圖2F）。

2.3 荷瘤小鼠腫瘤NK細(xì)胞與DC浸潤(rùn)變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相比荷瘤1周時(shí)，NK細(xì)胞比例在荷瘤2周及3周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05），荷瘤4周時(shí)下降（P＜0.05），在荷瘤后總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖3A）；DC比例在荷瘤2周及3周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05），荷瘤4周時(shí)顯著上升（P＜0.01，圖3B）。相比荷瘤1周時(shí)，單位體積腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05），荷瘤3周及4周時(shí)顯著下降（P＜0.000 1，圖3C）；單位體積腫瘤內(nèi)DC浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤后2周及3周時(shí)無(wú)明顯變化（P＞0.05），荷瘤4周時(shí)下降（P＜0.05，圖3D）。

圖2荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞變化Figure2 Variationsin theproportion of infiltrating T cellsin thetumor

2.4 荷瘤小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相比荷瘤1周時(shí)，總的巨噬細(xì)胞（用Mφ表示）比例在荷瘤1周～4周后無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖4A）；Ⅰ型Mφ比例在荷瘤1周到4周無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖4B）；Ⅱ型Mφ比例在荷瘤2周及3周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05），但荷瘤4周時(shí)下降（P＜0.05）（圖4C）。相比荷瘤1周時(shí)，單位體積腫瘤內(nèi)總Mφ浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周時(shí)顯著降低（P＜0.05），荷瘤3周及4周時(shí)降低極顯著（P＜0.000 1）（圖4D）；單位體積腫瘤內(nèi)Ⅰ型Mφ浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05），荷瘤3周及4周時(shí)下降（P＜0.05）（圖4E）；單位體積腫瘤內(nèi)Ⅱ型Mφ浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周及3周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05），荷瘤4周時(shí)下降（P＜0.05）（圖4F）。

2.5 荷瘤小鼠腫瘤髓源性抑制細(xì)胞浸潤(rùn)變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相比荷瘤1周時(shí)，CD11b+細(xì)胞比例在荷瘤后總體未呈現(xiàn)明顯變化（P＞0.05，圖5A）；M-MDSC比例在荷瘤2周和3周時(shí)無(wú)明顯變化（P＞0.05），荷瘤4周時(shí)明顯上升（P＜0.05），整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖5B）；G-MDSC比例在荷瘤后2周及4周均明顯下降（P＜0.05），整體呈下降趨勢(shì)（圖5C）。相比荷瘤1周時(shí)，單位體積腫瘤內(nèi)CD11b+及M-MDSC細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤1周到4周時(shí)無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖5D和5E）；單位體積腫瘤內(nèi)G-MDSC浸潤(rùn)數(shù)在荷瘤2周及3周時(shí)無(wú)明顯變化（P＞0.05），荷瘤4周時(shí)明顯下降（P＜0.05），總體呈下降趨勢(shì)（圖5F）。

圖3荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)自然殺傷（NK）細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）變化Figure 3 Variations of the infiltrating natural killer（NK）cells and dendritic cells（DCs）in the tumor

圖4荷瘤小鼠腫瘤中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞（Mφ）變化比較Figure4 Comparison of variationsin theproportion of infiltrating macrophages（Mφ）in thetumor

圖5荷瘤小鼠腫瘤中浸潤(rùn)的髓源抑制性細(xì)胞（MDSC）變化比較Figure 5 Comparison of changes in the proportion of infiltrating myeloid-derived suppressor cells（MDSC）in the tumor

3 討論

大多數(shù)腫瘤都有一個(gè)分步進(jìn)展的過(guò)程，包括一系列組織學(xué)、形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)的變化，這些變化隨著時(shí)間的推移而改變或累積［12］。腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用貫穿了腫瘤發(fā)展全過(guò)程。目前，關(guān)于癌癥免疫的研究主要集中在外周血、脾內(nèi)或淋巴結(jié)，而對(duì)腫瘤內(nèi)部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的復(fù)雜情形尚知之甚少。本研究檢測(cè)幾種具有代表性的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平在結(jié)腸癌發(fā)展進(jìn)程中的瘤內(nèi)變化景觀，旨在為結(jié)腸癌免疫學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，CD8+T細(xì)胞水平穩(wěn)步下降至不可逆的水平，個(gè)別樣本浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)極低，而CD4+T細(xì)胞比例在荷瘤早期就已迅速增長(zhǎng)并持續(xù)累積，單位體積中浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)了近8倍。T細(xì)胞浸潤(rùn)水平在荷瘤1周及2周時(shí)有增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨后快速下降，這與CD4+T細(xì)胞的飛速增長(zhǎng)保持一致，腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞幾乎都是CD4+表型。已有研究表明，Th1細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素（interleukin）-2、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）等，通過(guò)干擾內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4等，誘導(dǎo)TAMs產(chǎn)生M2表型，并通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子激活體液免疫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）通過(guò)直接表達(dá)抑制性細(xì)胞因子，或間接消耗IL-2，抑制CD8+T細(xì)胞的激活與增殖［13］。而腫瘤內(nèi)的Th2細(xì)胞浸潤(rùn)水平往往遠(yuǎn)高于Th1細(xì)胞，即產(chǎn)生了Th1/Th2漂移的現(xiàn)象［14］。本研究結(jié)果支持CD4+T細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中產(chǎn)生Th1/Th2漂移的假設(shè)，所產(chǎn)生的免疫抑制狀態(tài)嚴(yán)重影響了CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和活化效率，并發(fā)現(xiàn)M-MDSC和CD4+T細(xì)胞的高水平浸潤(rùn)與CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞水平的下降具有一定的相關(guān)性。另外，總T細(xì)胞比例在顯著降低后出現(xiàn)反彈，這可能與NC細(xì)胞在荷瘤3周及4周的顯著上升有關(guān)，這也體現(xiàn)了機(jī)體免疫在腫瘤發(fā)展整個(gè)過(guò)程中的頑強(qiáng)抗衡。然而盡管腫瘤體積飛速增長(zhǎng)，單位體積浸潤(rùn)DC細(xì)胞數(shù)也沒(méi)有表現(xiàn)出急劇下跌的趨勢(shì)。曾有報(bào)告稱(chēng)，腫瘤相關(guān)樹(shù)突狀細(xì)胞（tumor-associated dendritic cells，TADC）在抗原提呈、誘導(dǎo)同種異體反應(yīng)性和分泌IL-2等方面的能力均顯著下降，其表面分子以及聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)也明顯降低，相反它們具有促進(jìn)MDSC累積和促使髓系細(xì)胞分化為F4/80+TAM的作用［15］。事實(shí)上，大多數(shù)實(shí)體瘤都能通過(guò)產(chǎn)生IL-6、VEGF、CSF-1等細(xì)胞因子來(lái)抑制DC的分化和成熟，這種未成熟的TADC同樣高表達(dá)CD11c，并在腫瘤內(nèi)迅速累積，通過(guò)激活精氨酸酶1（arginase1，ARG1）和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS），進(jìn)一步加深免疫抑制作用。

TAMs是占比最大的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，也是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和抗治療的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，總Mφ的細(xì)胞比例始終維持在較高水平。通常認(rèn)為，M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complex-Ⅱ，MHCⅡ）分子等，發(fā)揮抗腫瘤作用；M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)ARG1和CD206等，發(fā)揮促腫瘤作用；然而腫瘤微環(huán)境中的Ⅰ型巨噬細(xì)胞往往可轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛐停?6］。本研究結(jié)果中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)整體下降，但Ⅰ型Mφ細(xì)胞數(shù)的下滑速度顯著快于于Ⅱ型Mφ，未發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的顯著Ⅱ型漂移現(xiàn)象。實(shí)際上，TAMs完全不同于普通巨噬細(xì)胞，其具有抑制T細(xì)胞功能發(fā)揮、促進(jìn)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分化以及促腫瘤血管生成的作用，從而形成了促腫瘤生長(zhǎng)的旁分泌循環(huán)。

MDSC與免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)，可通過(guò)分泌炎性因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和腫瘤血管生成，但由于其異質(zhì)性和非成熟性，目前對(duì)該細(xì)胞群的定義一直存在爭(zhēng)議［17］。本研究以CD11b+細(xì)胞標(biāo)志腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的MDSC，發(fā)現(xiàn)MDSC整體水平始終居高不下。于是本研究進(jìn)一步分析GMDSC和M-MDSC的浸潤(rùn)水平，發(fā)現(xiàn)G-MDSC浸潤(rùn)水平穩(wěn)步下降，這可能是腫瘤內(nèi)的趨化因子CXC缺失引起。值得注意的是，M-MDSC的浸潤(rùn)水平穩(wěn)定上升，且占比遠(yuǎn)高于G-MDSC。由于G-MDSC和M-MDSC抑制T細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的途徑是相互獨(dú)立的，筆者推測(cè)浸潤(rùn)的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞主要是Ly6C+表型，M-MDSC可能是促瘤免疫和免疫逃逸的主角。

綜上所述，筆者推測(cè)，癌細(xì)胞一旦接種于小鼠，機(jī)體迅速做出抗腫瘤和促腫瘤的免疫應(yīng)答；腫瘤組織內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平整體下降，CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞水平的下降不斷削弱機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)。TADC和TAMs在促腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，CD4+T細(xì)胞和M-MDSC可能是促腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)，促腫瘤免疫逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展。