ATP生物熒光增幅法在食品微生物污染檢測中的應用

魏姣姣 黃喜海

摘 要：由于食品表面非目標源的干擾，食品微生物污染檢測的結果存在一定偏差，為此，本文提出一種基于ATP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法，利用微生物的繁殖特性，將營養(yǎng)物質進行熒光標記，通過統(tǒng)計顯微環(huán)境下熒光ATP的增幅，判定檢測食品中是否存在微生物，避免直接統(tǒng)計受到的干擾，以此實現(xiàn)對食品微生物污染的有效檢測。

關鍵詞：微生物污染;微生物檢測;ATP生物熒光增幅法;熒光標記

食品安全問題的來源是多方面的，不僅包括原料質量、加工技術、生產環(huán)境，更主要的是對其的保管與儲存[1]。對于部分特殊的食品，微生物污染是主要影響產品質量的因素，而出現(xiàn)微生物污染的環(huán)節(jié)也是多樣性的，從原材料的產出到產品銷售，中間的任意環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)微生物污染[2]。在食品被污染的前期，并不會在外觀上表現(xiàn)出明顯的變化，但食品本身很可能已經變質，如果不能及時檢出，在市面上被銷售，極有可能產生嚴重的食品安全問題[3]。傳統(tǒng)的微生物檢測主要是對檢測物品進行微生物培養(yǎng)，不僅對檢測操作的要求較高，檢測周期也相對較長，這與現(xiàn)階段快節(jié)奏的生活方式并不契合，且其檢測結果也具有一定的失準性，效果并不理想[4]。ATP生物熒光增幅法作為近些年來逐漸被關注的微生物檢測方法，不但具有較高的檢測效率，同時操作更加便捷，在檢測領域得到了廣泛應用。

基于此，本文提出基于ATP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法。使用ATP熒光對營養(yǎng)物質進行標記，通過統(tǒng)計培養(yǎng)過后ATP熒光的增幅判斷食品中是否存在微生物污染，通過實驗驗證了該方法的有效性，以期為食品的微生物污染檢測提供有價值的參考。

1 食品微生物污染檢測

1.1 熒光染色標記

在傳統(tǒng)的食品微生物檢測中，主要是通過對樣本進行細菌培養(yǎng)的方式判定其是否被污染，通過培養(yǎng)結果分析微生物存在的可能性，結果的可靠性相對較低[5]。本文將ATP生物熒光增幅法應用于微生物污染檢測中。

對營養(yǎng)物質進行熒光標記，一般情況下，當食品中出現(xiàn)微生物污染時，隨著微生物的衍生，其需要不斷吸取食品中的營養(yǎng)物質作為其生存的基礎，此時的食品可以理解為是微生物的營養(yǎng)基，本文利用這一特點，在使用中加入包含熒光劑成分的高濃度營養(yǎng)物質。當食品中有微生物時，可以通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)移動的熒光，由于營養(yǎng)液自身也是非靜態(tài)的，直接統(tǒng)計的結果存在一定偏差，利用動態(tài)熒光的增加程度，可以實現(xiàn)對微生物數(shù)量的準確判斷。需要注意的是，在對營養(yǎng)物質進行熒光染色時，要避免熒光在食品表面的印染，當其對食品本身產生染色作用時，會影響最終的統(tǒng)計結果，因此，本文選用ATP作為染色材料。

1.2 ATP熒光增幅分析

ATP生物熒光增幅檢測法本質上是利用了微生物的生存需求和繁衍的基本原理，在完成對營養(yǎng)物質的標記后，在（37.5±0.5）℃的溫度環(huán)境中，培養(yǎng)2 h，再使用沖洗液對其表面進行沖洗，此時需要注意沖洗的力度不應過大，否則會造成含有ATP熒光的微生物被全部沖走，無法進行后續(xù)的檢測工作。沖洗完成的待檢食品需要在相對濕度為（60±5）%的環(huán)境中靜置10 min直至其表面處于干燥狀態(tài)。此時通過顯微鏡觀察食品表面是否存在ATP熒光成分，如果不存在，則表明食品不存在微生物污染，如果存在，記錄觀察到的微生物數(shù)量。完成后再重新將其置于（37.5±0.5）℃的溫度環(huán)境培養(yǎng)2 h。完成后重復上面的操作，沖洗、晾干，再次在顯微環(huán)境下觀察ATP熒光的數(shù)量，統(tǒng)計其實際增量。如果ATP熒光的數(shù)量未出現(xiàn)變化，同樣表明檢測食品沒有出現(xiàn)微生物污染的情況，如果出現(xiàn)明顯的增幅，則表明存在微生物。結合其增幅與時間的關系，推斷微生物的總量。本文將ATP熒光增幅作為最終檢測結果的判定依據(jù)，避免了鹽、其他化學物質和游離態(tài)在食品中的干擾，使檢測結果具有更高的準確性。

2 應用測試

對本文提出的微生物檢測方法進行實際應用測試。并將文獻[2]和文獻[3]提出的檢測方法作為對照組，通過對比3種方法的檢測結果，分析本文方法的效果。

2.1 樣本設置

本文將復蘇的HFSCs細胞在DM EM/F12培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，共分為3組，另外取3個DM EM/F12培養(yǎng)基，進行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，白假絲酵母菌的培養(yǎng)，同樣將其置于分別接種到DM EM/F12培養(yǎng)基中，并將其置于溫度為（37.5±0.5）℃，相對濕度為（60±5）%的環(huán)境中，時間為2 h。最后取3個DM EM /F12培養(yǎng)基，直接置于溫度為（37.5±0.5）℃，相對濕度為（60±5）%的環(huán)境中培養(yǎng)2 h，將其作為陰性對照組。

2.2 實驗過程

選擇典型支原體污染試驗樣本作為陽性對照。含

HFSCs玻片在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，吸取培養(yǎng)液，用PBS沖洗，用冷空氣干燥，用固定液固定5 min。將制備的ATP Hoechst3342工作染料添加到固定細胞中，并在室溫下染色30 min，染色的蓋玻片用PBS浸泡3次，每次3 min，用冷空氣干燥，含1%甘油的PBS覆蓋在細胞表面。密封處理后，干燥，觀察細胞核周圍是否產生ATP熒光。

2.3 檢測結果

在上述基礎上，對比3種方法對不同培養(yǎng)基的檢測結果，具體如表1所示。廖燮恒等[2]和白淼等[3]的方法均未實現(xiàn)對HFSCs的有效檢出，同時，廖燮恒等[2]方法對白假絲酵母菌的檢出不明顯，白淼等[3]的方法對枯草芽孢桿菌的檢出方法不明顯。相比之下，本文方法實現(xiàn)了對4組樣品的準確檢出，檢測結果更加可靠。

3 結論

隨著食品加工行業(yè)的蓬勃發(fā)展，對食品質量控制的重要性也越來越受到重視，其中微生物污染檢測作為一項難度較高，流程較為復雜的檢測環(huán)節(jié)，一直是產品質量控制的重要方式。而微生物污染前期，食物外觀上的表現(xiàn)并不明顯，對其檢測也更加困難。本文提出的基于ATP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法，并實現(xiàn)了對微生物的準確檢出。通過本文的研究，以期為食品安全檢測工作提供有價值的幫助。

參考文獻

[1]雷玄.市場監(jiān)管總局發(fā)布“22批次食品不合格情況”通告涉微生物污染等六類問題[J].中國質量萬里行，2021（7）：35-37.

[2]廖燮恒，趙海鋒.微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計數(shù)系統(tǒng)在固體粉末樣品檢測中的應用[J].現(xiàn)代食品科技，2021，37（5）：279-286.

[3]白淼，張燦，張明露，等.動態(tài)顯色法鱟試驗用于果汁細菌內毒素活性檢測及干擾分析[J].食品安全質量檢測學報，2019，10（10）：3192-3196.

[4]翟磊，葛媛媛，洪海軍，等.ATP生物熒光增幅法在微生物檢測中的可行性研究——應用于化妝品領域[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（21）：201-206.

[5]李婷，沈穎，蔡俊松，等.ATP生物熒光增幅法在化妝品微生物檢測中的適用性研究[J].日用化學工業(yè)，2021，51（6）：513-521.