急性冠脈綜合征不同氣血證候亞型病人miRNAs表達譜檢測及生物信息學分析

趙燁婧，彭紅玉，劉建勛，柳景華

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病歸屬于中醫(yī)學“胸痹”“心痛病”范疇，其中急性冠脈綜合征為兇險和嚴重的一種類型[1]。心氣充沛、氣血調(diào)和，才能保證心臟正常的生理功能。若心氣虧虛或瘀滯，則血行無力，乃致血停成瘀，強調(diào)胸痹心痛的病機關(guān)鍵在于血瘀，而氣滯血瘀證和氣虛血瘀證是氣血失和的兩種重要表現(xiàn)類型，均是形成冠心病血瘀證候的重要病理生理機制[2-4]。兩者表現(xiàn)為相同血瘀證的客觀征象同時，微觀層面是否具有各自獨特的病理生理變化或分子調(diào)控機制尚不明確。隨著基因表達芯片技術(shù)及生物信息學方法的蓬勃發(fā)展，越來越多的基礎研究致力于探討中醫(yī)宏觀證候與微觀物質(zhì)基礎、分子機制調(diào)控之間的相互聯(lián)系，微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的發(fā)現(xiàn)和不斷發(fā)展為豐富現(xiàn)代中醫(yī)理論提供了新的切入點。相關(guān)研究證實，miRNAs與冠心病關(guān)系密切，且在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，且miRNAs的表達具有時序性、特異性，這種表達特點與中醫(yī)“證”反映的機體病理狀態(tài)吻合，miRNAs表達異常引起相應基因網(wǎng)絡調(diào)控紊亂是導致疾病發(fā)生的重要內(nèi)在原因[5-6]。因此，本研究以急性冠脈綜合征氣滯血瘀證、氣虛血瘀證病人為研究對象，利用基因表達芯片技術(shù)及生物信息學方法，對氣滯血瘀證和氣虛血瘀證病人循環(huán)miRNAs表達譜變化進行分析，并對差異miRNAs進行靶基因預測及功能分析，旨在從微觀層面進一步闡明血瘀證不同亞型的病理生理機制，為冠心病辨證分型提供客觀依據(jù)和理論支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究依托于973計劃(No.2015CB554404)，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(No.2015031)且所有病人均自愿參與本研究并簽署知情同意書。選取2017年4月—2018年7月于首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院擬行經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)治療的急性冠脈綜合征病人10例，其中氣滯血瘀證5例，氣虛血瘀證5例。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 年齡18～80歲；符合急性冠脈綜合征診斷標準；中醫(yī)辨證為氣滯血瘀證或氣虛血瘀證；所有病人均簽署知情同意書；臨床資料及相關(guān)數(shù)據(jù)完整。

1.2.2 排除標準 嚴重腎功能不全，血清肌酐男性>220 μmol/L，女性>175 μmol/L；患有明顯的肝臟疾病或轉(zhuǎn)氨酶高于正常上限3倍；嚴重心、肺功能不全；未控制的Ⅲ級高血壓病人[治療后收縮壓>160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓>100 mmHg]；合并急性腦血管疾病或嚴重瓣膜性心臟病；嚴重造血系統(tǒng)疾?。粐乐鼐耦惣膊〔∪?；妊娠或準備妊娠婦女，哺乳期婦女；惡性腫瘤或病人預期壽命<3年；病人拒絕簽署知情同意書，或估計依從性較差、隨訪可能性差；近3個月內(nèi)參加過或正在參加其他臨床試驗。

1.3 診斷標準

1.3.1 急性冠脈綜合征診斷標準 參照2013年美國心臟病學會(ACCF)/美國心臟學會(AHA)ST段抬高型心肌梗死管理指南[7]和2012年中華醫(yī)學會心血管病學分會制定的非ST段抬高型急性冠脈綜合征診治指南[8]。

1.3.2 中醫(yī)辨證標準 參照1990年中國中西醫(yī)結(jié)合學會心血管病專業(yè)委員會制定的冠心病中醫(yī)辨證標準[9]。

1.4 研究方法

1.4.1 一般資料 收集并詳細記錄入選病人臨床資料，包括性別、身高、體重、血壓、心率及是否合并高血壓、糖尿病、高脂血癥、腎功能不全、吸煙史等既往史。

1.4.2 血液標本采集 于病人入院后次日清晨抽取空腹靜脈血6～8 mL，血液樣本待自然凝固30 min后，以3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，凍存-80 ℃低溫冰箱備用。

1.4.3 miRNAs提取與質(zhì)檢 使用mirvannatm PARISTM試劑盒從血漿中提取總RNA，利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性。

1.4.4 miRNAs芯片高通量篩選 RNA質(zhì)檢合格后，將提取血清總RNA進行靶標制備，總RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA，再進一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標記的cRNA。標記好的cRNA與芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction 軟件(version 10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)，進一步對原始數(shù)據(jù)進行quantile標準化及數(shù)據(jù)過濾。用于比較的每組樣本中至少1組100%標記為Detected的探針留下進行后續(xù)分析。利用t檢驗的P值和Fold-change法篩選差異表達的miRNAs，篩選的標準為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。

1.4.5 差異miRNAs靶基因預測 通過miRDB和miRWalk兩個數(shù)據(jù)庫預測差異表達miRNAs的靶基因。miRWalk是基于軟件學習的miRNAs靶基因預測算法TarPmiR預測miRNAs-mRNAs的靶基因關(guān)系對；miRDB是基于機器學習的miRNAs靶基因預測算法miRTarg內(nèi)皮素預測miRNAs可能的靶基因，最終獲取數(shù)據(jù)庫的交集基因進行分析。

1.4.6 基因功能富集與信號通路分析 利用The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID)平臺(https://david.ncifcrf.gov/)中的基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能富集與信號通路分析，判定差異miRNAs影響的細胞分子通路或生物學功能。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組年齡、性別比例、體質(zhì)指數(shù)、血壓、既往病史、吸煙史及Gensini評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異性表達的miRNAs 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組血清miRNAs表達微陣列經(jīng)掃描和數(shù)據(jù)分析，以相對表達水平差異倍數(shù)≥ 2.0且P值≤0.05作為篩選標準，共篩選出13個差異表達的miRNAs，包括11個表達上調(diào)的miRNAs和2個表達下調(diào)的miRNAs，火山圖詳見圖1。上調(diào)的miRNAs包括miR-7111-3p、miR-4515、miR-4436b-5p、miR-6743-3p、miR-4664-3p、miR-7974、miR-4646-3p、miR-6760-3p、miR-6507-3p、miR-6731-3p、miR-7114-3p和下調(diào)的miRNAs包括miR-3656、miR-4442，聚類圖詳見圖2。

圖1 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異表達miRNAs火山圖

圖2 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異表達miRNAs聚類圖

2.3 差異性表達miRNAs的靶基因預測 通過miRDB和miRWalk兩個數(shù)據(jù)庫來共同對差異表達miRNAs進行靶基因預測，共篩選出175個miRNAs-mRNA關(guān)系對，詳見圖3。靶基因預測結(jié)果見表2。

圖3 差異miRNAs靶基因預測數(shù)據(jù)庫Venn圖

表2 差異性表達的miRNAs及預測的靶基因結(jié)果

2.4 靶基因GO富集分析 本研究對差異表達靶基因分別進行生物學過程、分子功能和細胞組分的GO富集分析。結(jié)果表明，氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異有統(tǒng)計學意義的miRNAs預測靶基因主要參與生物過程調(diào)控、代謝調(diào)控、多細胞器官的發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導調(diào)控等過程。詳見圖4。

圖4 差異miRNAs靶基因GO富集分析

2.5 靶基因KEGG富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些差異靶基因在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、Wnt信號通路、Apelin信號通路富集，尤其在PI3K/Akt信號通路最顯著，詳見圖5。結(jié)果提示冠心病氣血失和證候形成的病理生理機制與這些通路密切相關(guān)，與氣滯血瘀證相比，PI3K/Akt信號通路、Wnt信號通路、Apelin信號通路在氣虛血瘀證中表現(xiàn)為顯著下調(diào)。

圖5 差異miRNAs靶基因KEGG富集分析

3 討 論

中醫(yī)理論體系中氣和血為機體重要的物質(zhì)和能量基礎，中醫(yī)所言“氣為血之帥，血為氣之母”，氣血調(diào)和為生命之本，氣血失常為百病之機。既往文獻顯示，氣滯血瘀證和氣虛血瘀證作為氣血失和重要的兩種表現(xiàn)類型，均為冠心病的核心病機[10]。目前臨床氣血辨證方法多數(shù)以經(jīng)驗為主，對氣滯血瘀證和氣虛血瘀證的微觀物質(zhì)基礎未獲得統(tǒng)一認識。隨著生物信息學技術(shù)的發(fā)展，越來越多研究運用現(xiàn)代生物學技術(shù)探討中醫(yī)證候的生物學本質(zhì)和病理生理機制，有利于中醫(yī)證候理論的深化和推廣。

miRNAs是一類長20～24 nt的內(nèi)源性非編碼核糖核酸分子，主要通過識別靶基因3′非翻譯區(qū)的靶位點介導mRNA降解或翻譯抑制發(fā)揮作用。這類miRNAs在進化上具有高度的保守性，表達具有時間和組織特異性，是調(diào)節(jié)其他功能基因表達的重要調(diào)節(jié)分子，在生物體的各種生命過程中發(fā)揮著重要作用[11-12]。中醫(yī)領域里，通過探索相關(guān)靶標miRNAs分子，尋找宏觀證候與微觀物質(zhì)基礎的特定聯(lián)系。有研究顯示，miRNAs在血瘀證等中醫(yī)證候的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的介導作用，其表達變化不僅可協(xié)助診斷，還可預測與疾病相關(guān)的分子信號機制[13-15]。本研究通過選擇miRNAs芯片，利用其快速、平行、高通量的檢測特點，以氣滯血瘀證和氣虛血瘀證急性冠脈綜合征病人為研究對象，通過現(xiàn)代高通量測序技術(shù)和生物信息學方法分析氣滯血瘀證和氣虛血瘀證不同的微觀生物基礎及潛在的病理生理機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組血清存在13個差異性表達的miRNAs，包括11個表達上調(diào)的miRNAs和2個表達下調(diào)的miRNAs。廣泛參與信號傳導過程、生物過程調(diào)控等病理過程，進一步對差異靶基因行功能富集分析，結(jié)果顯示這些差異靶基因在PI3K/Akt信號通路、Wnt信號通路、Apelin信號通路差異有統(tǒng)計學意義，尤其在PI3K/Akt信號通路富集最為明顯。

既往研究已證實，PI3K/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號通路與冠心病的病理生理過程密切相關(guān)，PI3K激活導致Akt的磷酸化，被激活的PI3K/Akt通過調(diào)節(jié)Ser1177上的eNOS磷酸化，并與內(nèi)皮細胞表面受體結(jié)合激活eNOS，之后催化L-精氨酸脫氨基產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖、分化、凋亡和遷移，參與血管收縮、血管平滑肌細胞增生、血管重塑和機能障礙等病理過程，進而促進動脈粥樣硬化的形成[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與氣滯血瘀證病人相比，氣虛血瘀證病人可能通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路，引起血管內(nèi)皮功能障礙、血管痙攣、異常收縮、血栓形成及血管增生等病理生理過程的形成。與既往研究證實氣虛血瘀證冠心病存在血管內(nèi)皮功能異常，并貫穿發(fā)生發(fā)展過程的始終觀點一致，且主要表現(xiàn)為NO和內(nèi)皮素-1分泌失衡，血清NO/內(nèi)皮素降低在氣虛血瘀證病人尤為明顯[18-19]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，對冠心病氣虛血瘀證小鼠采用雪蓮通脈丸等補氣活血的中藥治療，通過升高血清NO水平、降低內(nèi)皮素-1水平可改善血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)和心肌缺血[20]。既往研究未完全闡明氣虛血瘀證的基因作用通路，本研究結(jié)果推測上調(diào)PI3K/Akt通路以升高血清NO/內(nèi)皮素含量可能是補氣活血方改善氣虛血瘀證小鼠內(nèi)皮功能障礙的內(nèi)在機制，仍需進一步對篩選出的差異miRNAs進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應和多中心、大樣本的臨床研究驗證。

綜上所述，本研究利用高通量測序技術(shù)和生物信息學方法共篩選出氣虛血瘀證和氣滯血瘀證冠心病病人13個差異表達miRNAs可能參與氣血失和證冠心病的發(fā)生和發(fā)展，進一步功能分析發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt等信號通路下調(diào)可能參與氣虛血瘀證冠心病病理生理機制的形成。該結(jié)果對進一步尋求中醫(yī)證候生物學本質(zhì)及標志物提供了一定的基礎理論依據(jù)。