分離過程對血袋外周血采集單個核細胞的影響及結(jié)果驗證

潘紀春, 馬曉芬， 劉旭功， 林侯汎， 陳民才

(1.解放軍總醫(yī)院 第三醫(yī)學(xué)中心, 北京 100131; 2. 北京恒生佳合細胞科技有限公司, 北京 100176)

免疫治療法是近代醫(yī)療史上一個重要的里程碑，其特點是具有個體專一性及病原針對性，其所需的研究材料通常是來自自體血液內(nèi)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。此細胞群是指外周血中具有單個核的細胞，主要包含T淋巴細胞(T lymphocytes)、B淋巴細胞(B lymphocytes)、單核細胞(Monocytes)、自然殺傷細胞(natural killer cells)、樹突狀細胞(dendritic cells)以及造血干細胞(hematopoietic stem cells)等，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機體完成免疫反應(yīng)的重要基礎(chǔ)[1]。目前，PBMC常用的分離方法很多，其中，Percoll非連續(xù)密度梯度離心法和葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法是最常應(yīng)用的分離方法[2-3]。分離出的PBMC多種細胞各有不同功能，可以進行定向擴增，或基因修飾為日后的免疫治療打下基礎(chǔ)。

具體而言，此類研究首先需要大量從外周血中分離 PBMC，這就要求PBMC的分離提取與純化工藝操作精簡省時。新鮮血液采集后，血樣容量較大，無菌分離PBMC時，需要大量離心管分離離心，煩瑣且重復(fù)地開放性操作容易導(dǎo)致污染。如果用血袋來大量采集血液，再將紅細胞與白細胞分離，不僅可以提供紅細胞給需要的患者，同時還可取得大量的PBMC樣本并精簡初期的操作。目前，為避免排斥反應(yīng)，獻血站所取得的捐獻血液都是將白細胞丟棄，如果可以將此重要的醫(yī)療資源保留起來，無論是作為醫(yī)學(xué)研究還是免疫治療，這些單核細胞都大有用途，可轉(zhuǎn)化為重要的稀缺醫(yī)療資源。

血袋分離操作首先需要使用高速冷凍離心機從血袋中分離出紅細胞和含少量紅細胞的白膜層[4](Buffy coat， 其內(nèi)含有大量的PBMC)，再經(jīng)過葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法以適當?shù)碾x心參數(shù)分離PBMC。根據(jù)全血中不同血細胞的密度以及密度梯度離心法的原理, 經(jīng)過多次嘗試, 探索出適用于從大量血液中分離PBMC操作的方法: 即通過實驗對比分析，找出最佳的分離方法。之后，將所得到的PBMC凍存到氣相液氮罐中，定期取出進行培養(yǎng)，并確認PBMC的生物活性。

1 實驗方法

1.1 外周全血第一次分離

采集健康獻血者新鮮外周全血400 mL于采血袋中，血樣均符合倫理且取得供者知情同意。將血袋置于高速冷凍離心機(美國Thermo公司， 型號Cryofuge 6000i)中，初次分離成分血，包括紅細胞、血小板、血漿、白細胞。每一獻血者再分別采集5 mL外周全血于肝素鈉抗凝管中，行血常規(guī)檢測。根據(jù)離心力的不同，試驗共分成3個組，每組取3份外周血：A組，2 800 r/min(2 516g)；B組，3 500 r/min(3 931g)；C組，4 000 r/min(5 134g)。設(shè)置離心機升速為9，降速為7，溫度為4 ℃，各組分別離心10 min。離心結(jié)束后，記錄血袋中白細胞層的狀態(tài)，同時，將白細胞層擠壓入新的血袋中，用熱合機密封導(dǎo)管。

1.2 白細胞層第二次分離

在生物安全柜中，將A組、B組、C組3組所得白細胞全部倒入50 mL離心管中，記錄每份白細胞的體積，于2 000 r/min離心10 min，吸棄血漿層，向所得細胞共加入適量無菌生理鹽水，重懸細胞成單細胞懸液。將稀釋后的細胞緩慢加入50 mL離心管中15 mL Ficoll淋巴細胞分離液上層，使細胞懸液與淋巴細胞分離液體積比為2∶1。所有50 mL離心管于水平離心機(美國Thermo公司，型號ST40R)中離心10 min，按照離心機轉(zhuǎn)數(shù)的不同，分成3組：第1組轉(zhuǎn)數(shù)為1 500 r/min(526g)；第2組轉(zhuǎn)數(shù)為1 800 r/min(757g)；第3組轉(zhuǎn)數(shù)為2 000 r/min(935g)。設(shè)置離心機升速為4，降速為4，溫度為4 ℃，各組分別離心20 min。離心結(jié)束后，記錄50 mL離心管中白膜層的狀態(tài)。分別吸取白膜層加入新的50 mL離心管中，補加PBS緩沖液至45 mL，于1 800 r/min離心5 min，細胞共清洗3次。清洗結(jié)束后，每支離心管中加入45 mL PBS緩沖液，重懸細胞成單細胞懸液。

1.3 細胞數(shù)量檢測

在生物安全柜中，混勻含白細胞層的血袋，每一份血袋均用10 mL無菌注射器吸取5 mL細胞懸液，加入5 mL無菌樣品管中，于DH-510全自動無分類血球計數(shù)儀進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果計算白細胞、紅細胞、中性粒細胞和血小板總數(shù)，以及白細胞回收率，紅細胞、中性粒細胞和血小板殘留率。以白細胞為例，算式如下:白細胞總數(shù)=白細胞計數(shù)濃度×白膜血體積，白細胞回收率=白細胞總數(shù)/(原血白細胞濃度×獻血體積)。

白細胞層第二次分離結(jié)束后，沿著離心管壁吸取白膜層于兩支新的50 mL離心管中，補足無菌生理鹽水至50 mL，于1 500 r/min離心5 min。倒掉上清液后，兩支離心管中細胞合并至一管，補足50 mL無菌生理鹽水，重懸細胞，于1 500 r/min離心5 min，共離心清洗3次。清洗結(jié)束后，加入45 mL無菌生理鹽水，重懸細胞成單細胞懸液，于DH-510全自動無分類血球計數(shù)儀進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果計算單個核細胞總數(shù)、細胞活率與回收率，紅細胞、粒細胞和血小板總數(shù)與殘留率。

1.4 PBMC 凍存

根據(jù)計數(shù)儀計數(shù)結(jié)果換算出細胞實際數(shù)量，按照2.0×107cells/管，凍存細胞(凍存工作液;ExCellBio OptiVitro?)。

1.5 細胞培養(yǎng)擴增

細胞復(fù)蘇后, 根據(jù)PBMC細胞計數(shù)，向單個核細胞中添加相應(yīng)體積X-VIVO15 培養(yǎng)基(含1 000 U/mL IL-2)，調(diào)整細胞濃度為3.0×106/mL，根據(jù)所添加的細胞體積量，向單個核細胞懸液中加入重組人IFN-γ，使其終濃度為1 000 U/mL，加入5%自體血漿。培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)瓶，向培養(yǎng)瓶中補加等量體積的X-VIVO15(含1 000 U/mL IL-2) 培養(yǎng)基，根據(jù)總體積量，再加入相應(yīng)體積5%自體血清，將細胞濃度調(diào)至2.5×106～3×106/mL，再向細胞中加入白介素-1α其終濃度為1 000 U/mL、CD3至其終濃度為1 μg/mL。將培養(yǎng)瓶放回37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后取出培養(yǎng)瓶，向培養(yǎng)瓶中補加等量體積的X-VIVO15 培養(yǎng)基(含1 000 U/mL IL-2)，再加入相應(yīng)體積2%自體血清，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)的細胞，每隔2～3 d，培養(yǎng)基顏色變黃時補充相應(yīng)體積X-VIVO15 培養(yǎng)基(含1 000 U/mL IL-2)和2%自體血清一次，直至細胞收集，通常15～18 d收獲。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

血袋經(jīng)離心后，首先壓出上清血漿，再來以目測的方式收集白膜層部分的血漿，收集后測量每份的體積與其內(nèi)的細胞濃度。每份白細胞層的體積與數(shù)量見表1，根據(jù)A、B、C 3組中每份白細胞層測得的白細胞密度與體積計算獲得的白細胞總數(shù)。 由結(jié)果得知，初步離心時的轉(zhuǎn)數(shù)并非越高越好。在較高的轉(zhuǎn)速離心時，雖然可以明顯集中肉眼所觀察到的白細胞的分離層，減少收集的體積，但分析后發(fā)現(xiàn)在較高的轉(zhuǎn)速條件下，白細胞數(shù)量并不如預(yù)期。這或許是因為未部分白細胞可能下降到紅細胞層的部分而沒有被收集。

表1 第一次離心結(jié)果

以血球計數(shù)儀分析全血內(nèi)的細胞總數(shù)之后，在與所收集的白膜層數(shù)據(jù)(表1)進行比對，數(shù)據(jù)分析說明，白膜血中分離所得到的白細胞從細胞總數(shù)和細胞回收率而言，A組和B組均高于C組且差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義，而A組和B組之間的差別并無統(tǒng)計學(xué)意義，顯示初步離心分離可以采用A組或B組參數(shù)，但A組在數(shù)據(jù)均略高于B組，故而采用2 800 r/min優(yōu)于3 500 r/min。此結(jié)果也說明在較低速離心的條件下，即使白膜層與紅細胞層的界面分離不明顯，但卻可以取得更多的白細胞。反之，在高速離心時，白細胞可能因為過度聚集而容易造成不均，且會下沉到紅細胞層而沒有被收集到。

在較高的速度離心條件下，各細胞層的分離界面會變得清晰。接下來探討是否會影顯白膜層內(nèi)紅細胞的收集量。表2所示的數(shù)據(jù)分析說明，分離所得白細胞中的紅細胞從殘留密度、殘留總數(shù)和殘留率而言，C組顯著低于A組和B組，而A組和B組在殘留總數(shù)和殘留率方面無差別。A組與B組比較，P>0.05，兩組數(shù)據(jù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義；A組與C組比較，P<0.01，兩組數(shù)據(jù)差別具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;B組與C組比較，P<0.01，兩組數(shù)據(jù)差別具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 白膜層內(nèi)紅細胞殘留量

這說明在較高的轉(zhuǎn)速下，細胞分層界面清晰有助于紅細胞的分離，因此在采血站去白細胞的過程中可以選擇較高的離心速度，以期能最大量保留紅細胞。但如果是為了收集PBMC或許較低的轉(zhuǎn)數(shù)會是一個比較好的分離條件。

血細胞成分中的血小板除了凝血之外還具有多種功能，其中幫助細胞增生及促進組織修復(fù)這部分也逐漸地受到各方重視。所以在不同離心轉(zhuǎn)數(shù)之下的分離狀況也做了分析。如表3所示，在低轉(zhuǎn)數(shù)的條件下，可以最大量取得血小板數(shù)，所取得的血小板殘留率甚至可以高達98.5%。但結(jié)果也顯現(xiàn)當離心力超過4 000g時，血小板殘留率突降至50%以下。此一實驗數(shù)據(jù)顯示當離心力超過4 000g時，血小板在血袋內(nèi)將開始移至紅細胞層內(nèi)，而導(dǎo)致取得困難。

表3 血小板數(shù)量分析

綜合上述初步離心后所得數(shù)據(jù)說明，A組和B組分離獲得的白細胞各方面均優(yōu)于C組，且A組更優(yōu)于B組；雖然A組和B組獲得的白細胞中殘留的中性粒細胞、紅細胞和血小板方面的殘留均明顯高于C組，但這些組分均可以通過進一步的分離進行純化。因此，初步分離白膜血采用2 800 r/min最佳。因此，后續(xù)的實驗是以血袋離心2 800 r/min后所得到的結(jié)果。

PBMC內(nèi)含多種細胞，其中目前被作為免疫細胞治療的種子細胞就是單個核細胞。分離后得到單個核細胞越多，后續(xù)實驗的可能性便越大。第2次離心后取出白膜層并進行數(shù)據(jù)分析。得到結(jié)果顯示，第2次分離時不同離心力對分離的效果并無統(tǒng)計學(xué)上的意義。這可能是因為與初次離心不同點在于第2次離心所添加的淋巴球分離液是固定的密度，利用不同血細胞有不同密度的特性，將血細胞分離開來，所以受離心力的影響較小。換句話說，第2次離心所使用的淋巴球分離液的品質(zhì)與體積反而是比較重要的一環(huán)。

與常見的PBMC分離方式不同點在于用血袋分離的處理時間較長，離心次數(shù)較多。因此，接下來檢測經(jīng)過多次離心后，在最后的單個核細胞存活率是否會降低。其結(jié)果如圖1所示，在經(jīng)過多次離心后，不同的離心轉(zhuǎn)數(shù)下，單個核細胞的活率都有95%以上。如此證明在這樣的條件下細胞并沒有受到太大的損傷。

圖1 單個核細胞活率

同時也對第2次離心時不同離心力的條件下其白膜層內(nèi)的紅細胞及血小板數(shù)量進行分析。其結(jié)果顯示(圖2)，在第2組內(nèi)的紅細胞數(shù)量較高，而第1組的紅細胞殘留量是最低的。

圖2 第2次離心后白膜層內(nèi)紅細胞、血小板殘留率

綜合上述實驗得知1組、2組和3組分離獲得的單個核細胞各參數(shù)并無差別；經(jīng)進一步純化分離后，3組獲得的單個核細胞中均為檢測到中性粒細胞；2組在紅細胞殘留數(shù)和殘留率方面明顯低于1組和3組；3組在血小板殘留總數(shù)方面并無差別，但1組和3組血小板殘留率低于2組。因此，第2次分離單個核細胞采用1 800 r/min更為合適。

將上述所得到的單個核細胞進行凍存后，進行凍存前、后的細胞擴增培養(yǎng)及細胞表型分析，借以了解在實驗室的條件之下所得到的免疫細胞質(zhì)量。在凍存后1個月、6個月及12個月后培養(yǎng)PBMC細胞2周后的細胞數(shù)量(圖3)及表型分析(圖4)。起始培養(yǎng)數(shù)量為1×107個細胞，分別在細胞培養(yǎng)6 d及15 d后進行細胞計數(shù)(圖3)。發(fā)現(xiàn)在未凍存時PBMC培養(yǎng)15 d后細胞總數(shù)量約可增加100倍左右。在凍存后1個月、6個月與12個月的數(shù)據(jù)分析顯示雖然凍存后的細胞增值率略低，但凍存的時間增加并不影響后續(xù)細胞培養(yǎng)的增值率。

圖3 單核細胞在凍存不同時間，復(fù)蘇培養(yǎng)后所增加數(shù)量

在凍存后1個月、6個月及12個月后進行PBMC細胞培養(yǎng)2周后的細胞表型分析(圖4)。在細胞培養(yǎng)15 d后進行細胞表型分析。結(jié)果顯示凍存的時間并不影響培養(yǎng)后的細胞表型，甚至功能性T細胞(毒殺性T細胞及細胞因子激活殺手細胞)有些許增加的現(xiàn)象。在凍存前PBMC經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的毒殺性T細胞(CD3+CD8+)為60%左右，細胞因子激活殺手細胞(CD3+CD16+CD56+)約在17%左右。但隨著凍存時間增加，PBMC凍存一年后培養(yǎng)所產(chǎn)生的毒殺性T細胞(CD3+CD8+)增為80%左右。此現(xiàn)象或許是因為在總細胞量減少的同時，針對性培養(yǎng)的細胞反而有更大的增值空間所致，這部分需要進一步的研究證實。

圖4 單核細胞在凍存不同時間，復(fù)蘇培養(yǎng)后的細胞分型

3 結(jié)論

為探索從健康獻血中分離PBMC的最優(yōu)離心參數(shù)，驗證第1次和第2次處理時，采用不同離心力對PBMC分離的效果。得到的結(jié)論是:

1)第1次離心，在4 ℃條件下，2 800 r/min離心10 min分層離心所獲得的白細胞效果最好。隨后，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離白膜血中的PBMC，結(jié)果表明，第2次分離PBMC采用1 800 r/min離心20 min分離效果較好。

2)細胞凍存后的結(jié)果顯示凍存時間增加并不影響后續(xù)細胞培養(yǎng)結(jié)果，反而有助于功能性T細胞的增殖。

4 討論

目前，細胞免疫治療在國內(nèi)外越來越受到各大制藥公司、科研機構(gòu)的重視，如美國FDA于2017年批準了首個CAR-T免疫細胞產(chǎn)品的上市，這標志著全球采用免疫細胞治療癌癥時代的開啟，個體化免疫細胞儲存也隨之越來越受到市場青睞[5]。

目前無論是已上市或是尚在臨床試驗階段的免疫細胞制劑都是以自體來源的免疫細胞來操作。自體來源免疫細胞治療與免疫細胞儲存通常采用單采血細胞機采集[6]，或者直接抽取外周全血100～200 mL。單采方法需要多次循環(huán)采集全身血液中的免疫細胞，采集量較大，較多重癥或者年老體弱者無法耐受。直接采集外周血的方法所獲得的免疫細胞數(shù)量較少，可能僅滿足一次培養(yǎng)所需免疫細胞。因此，兩種采集方法均存在一定的限制。對于緊急需要治療以及本身免疫細胞在質(zhì)量上或數(shù)量上達不到操作標準的患者就會面臨無細胞可用的困境。因此，如果可以事先進行培養(yǎng)擴增，對于這些患者來說會是一大益處。

為達到此目標，只能使用異體來源的免疫細胞。如器官移植，要使用異體來源必須經(jīng)由組織相容性配型，而為了提高覆蓋率，就必須要有大量的血液資源并從中提取出免疫細胞。

不同于自體來源，異體來源免疫細胞則另辟蹊徑，收集血站常規(guī)富集成分血后廢棄的白細胞(稱為白膜血)，以此作為免疫細胞培養(yǎng)的種子細胞來源，可在配型成功后，滿足大量免疫細胞培養(yǎng)的需要。因大量收集健康者來源的免疫細胞為首要條件，而能大量收集血液的唯一方法只有無償獻血，并從血袋內(nèi)提取出單核細胞。如此，就有必要對如何能有效地從血袋內(nèi)分離出單核細胞作為日后治療所使用的種子細胞進行探討。

為探索從健康獻血中分離PBMC的最優(yōu)離心參數(shù)，比較第1次和第2次處理，采用不同離心力時，哪一種對PBMC分離的效果最佳。首先，通過不同的離心轉(zhuǎn)速，確定獻血血袋分離白膜血的最佳離心參數(shù),以結(jié)論所建議的方法，在各細胞分層后，PBMC層較厚、分布較均勻，洗滌細胞后管底細胞沉淀中紅細胞較少, PBMC背景中混雜細胞，如紅細胞、血小板及其他細胞碎片也少。此外，根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)，分離的PBMC質(zhì)量好壞還與外周血的鋪層手法有一定關(guān)系，血液與Ficoll層面越清晰，稀釋血沖破Ficoll層面程度越小，其分離后分離效果越佳。在相同淋巴細胞分離液條件下，進行血液鋪層再二次分離PBMC，分離后所得根據(jù)PBMC厚度、分層狀態(tài)、活力和得率結(jié)果進行對比，鋪層分界面越清晰, 減少血液滴加的沖擊力，減少Ficoll界面破壞程度，降低血液擴散的情形，不僅所得細胞沉淀中混雜細胞如紅細胞及其他細胞碎片較少外，而且PBMC細胞得率及活力也較好。

PBMC除了可以培養(yǎng)出極專一性的CAR-T 細胞、TCR-T細胞和CAR-NK細胞[7]之外，常見的還有單核巨噬細胞[8]、記憶型毒殺免疫細胞，如CIK (細胞因子激活殺手細胞)、特異性T細胞[9]以及廣譜型免疫細胞-NK細胞。這些都是由PBMC經(jīng)培育之后大量增殖的免疫細胞，因此如何一次性取得大量的PBMC顯得尤其重要。以適用性來說，CIK (細胞因子激活殺手細胞)與特異性T細胞的特點為具有對整個病原體的專一性而非單一抗原,對付疾病上更有效。毒殺型T細胞是個體遭遇病源后所產(chǎn)生的記憶免疫細胞，經(jīng)培育放大后會針對相同病源起強烈的毒殺反應(yīng)[10]。在實際醫(yī)療應(yīng)用方面，對于像CMV、EBV等這些高危險伺機性且被感染者眾多的病源，這些免疫細胞可以自體使用或異體經(jīng)配型后使用，對于免疫低下的人群如器官移植患者、免疫功能不全及幼兒具有良好的免疫保護作用[11-12]。

本研究證實經(jīng)第1次初步離心、第2次淋巴細胞分離液分離，該方法是一種簡便、快速獲得大量有活力的PBMC的方法。取得細胞的過程不因多次分離而造成細胞死亡，且保有其生物活性。為達到最佳實驗結(jié)果，在實驗中還需注意以下幾方面：

1)采集新鮮人外周血于采血袋中，應(yīng)同時避免高溫、溫度過低、大力度擠壓和震蕩導(dǎo)致溶血。

2)血液采集后要留取足夠時間使白細胞聚集，一般需30 min以上。

3)血液裝入離心缸，要求血袋平整，勿褶皺，褶皺多易使白細胞貼壁增多，從而導(dǎo)致分離獲得的白細胞減少。

4)離心完畢，血袋從離心缸移至分漿夾過程中，勿使血液搖動，以免白膜層攪動，致白細胞獲得量減少。

5)血袋夾入分漿夾后，輕輕松緊分漿夾，使白膜層上下輕微位移，減少細胞貼壁，增加白細胞分出量。

6)夾緊分漿夾，白膜層上移至血袋頂端2 cm處時，一手從一側(cè)平推白膜層至中間出漿管口，另一手迅速從另一側(cè)平推白膜層至出漿口。大量實踐證實，分白膜兩側(cè)前后平推擠白膜比雙側(cè)同時擠白膜效果好：白細胞數(shù)量多，損失紅細胞少。

此外，稀釋血應(yīng)緩慢加至淋巴細胞分離液層面上，并注意保持界面清晰 (淋巴細胞分離液事先浸潤管壁)；吸取PBMC層時要避免過多吸取，否則會吸出其他的混雜細胞；在離心機中離心時，速度要慢升慢降，上升速度和下降速度都不宜過快，過快會導(dǎo)致淋巴細胞濾過Ficoll層導(dǎo)致獲得量下降。