蘋果銹果類病毒在7個品種蘋果上的分子變異及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

李紫騰，曹鈺晗，李楠，孟祥龍，胡同樂，王樹桐，王亞南，曹克強

蘋果銹果類病毒在7個品種蘋果上的分子變異及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

李紫騰，曹鈺晗，李楠，孟祥龍，胡同樂，王樹桐，王亞南*，曹克強

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001

【目的】探究不同品種蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）的分子變異及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為進(jìn)一步揭示ASSVd分子變異機制打下基礎(chǔ)。【方法】以富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信儂紅和信儂黃7個品種的染病蘋果組織為材料，通過特異性引物對ASSVd全基因組序列進(jìn)行擴增，然后進(jìn)行分子克隆和序列測定，利用生物學(xué)軟件DNAMAN對變異序列一致性進(jìn)行分析并利用生物學(xué)軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?！窘Y(jié)果】共獲得210個ASSVd的基因組序列，共計17種變體，大小為325—333 nt。將不同蘋果品種獲得的17種變體與其他已發(fā)表代表性分離物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有變體被分為3組，組Ⅰ包括10種變體，同已報道的保定富士分離物（KR264032.1）親緣關(guān)系較近；組Ⅱ包括6種變體單獨聚類；組Ⅲ包括1種變體，與新疆紅富士蘋果上的分離物（EU031455.1）親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步根據(jù)基因組0—3、221、251、284、302這8個位點的堿基變異，將17種變體分為6種類型：1、nt 0—3（GGTA）+ nt 41—46（TAAAAT）+ nt 221（T）+ nt 251（T）+ nt 284（G）+ nt 302（T）；2、nt 0—3（XGGT）+ nt 41—46（AGATAX）+ nt 221（T）+ nt 251（X）+ nt 284（A）+ nt 302（A）；3、nt 0—3（XGGT）+ nt 41—46（AGATAX）+ nt 221（X）+ nt 251（T）+ nt 284（A）+ nt 302（A）；4、nt 0—3（XGGT/GGTA）+ nt 41—46（AGATAX）+ nt 221（T）+ nt 251（T）+ nt 284（A）+ nt 302（A）；5、nt 0—3（GGTA）+ nt 41—46（TAAAAT）+ nt 221（X）+ nt 251（G）+ nt 284（G）+nt 302（T）；6、nt 0—3（GGTA）+ nt 41—46（TAAAAT）+ nt 221（T）+ nt 251（G）+ nt 284（G）+ nt 302（T）。其中X表示缺失。富士品種包含6種變體，以類型4為主（47.5%）；王林品種包含3種變體，以類型5為主（43%）；金冠包含3種變體，以類型4為主（60%）；斗南品種只有1種變體，為類型5，占比100%；中秋王品種只有1種變體，為類型4，占比100%；信儂紅包含2種變體，以類型1為主（83.3%）；信儂黃包含3種變體，以類型1為主（62.5%）?！窘Y(jié)論】根據(jù)ASSVd nt 0—3、221、251、284、302這8個位點的堿基變異，將富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信儂紅、信儂黃品種中17種變體分為6種類型，不同蘋果品種攜帶的ASSVd種群結(jié)構(gòu)、病毒變體類型及占比均不同。

蘋果銹果類病毒；基因組；分子克??；分子進(jìn)化；分子變異

0 引言

【研究意義】我國的蘋果栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，蘋果產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)民增收和優(yōu)化生態(tài)等方面具有重要地位[1]。近幾年，蘋果銹果病在我國蘋果產(chǎn)業(yè)中危害嚴(yán)重，在我國北方蘋果主產(chǎn)區(qū)發(fā)病率達(dá)4.8%—48.6%[2-3]。蘋果銹果病由蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）侵染所致。ASSVd為侵染蘋果的最小類病毒病原體之一[4]，屬馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（）蘋果銹果類病毒屬（）[5]。ASSVd存在于細(xì)胞核內(nèi)，具有中央保守序列且不具核酶活性，以非對稱滾式復(fù)制。一般是由330個左右的核苷酸組成的共價閉合環(huán)狀單鏈，呈棍棒狀二級結(jié)構(gòu)[6]。ASSVd侵染蘋果植株后，樹體的正常生理機能會遭受干擾和破壞，感病植株的果實變小、硬度增加、表面有花臉或銹斑、風(fēng)味變劣[7-11]。在與寄主長期互作和進(jìn)化過程中，病毒的分子變異不可避免。研究不同蘋果品種ASSVd的分子變異及系統(tǒng)發(fā)育，可為病毒與寄主互作機制的揭示打下基礎(chǔ)，對蘋果銹果病的有效防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類病毒具有自主復(fù)制能力，大多數(shù)類病毒在細(xì)胞核中復(fù)制，有一個中心保守區(qū)（central conserved region，CCR）[12-13]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過30種類病毒，根據(jù)物理、化學(xué)、生物學(xué)和分子生物學(xué)特征，將其劃分為兩個科，分別為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科和鱷梨日斑類病毒科（）[14-15]。盡管類病毒不編碼蛋白質(zhì)，但仍可侵染高等植物，并在許多經(jīng)濟(jì)作物上引起病害[16-21]。1985年，陳煒等[22]從蘋果銹果病組織中提取總核酸，發(fā)現(xiàn)蘋果銹果病組織中存在一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的類病毒RNA；劉娟[23]對山東蘋果的ASSVd進(jìn)行全序列分析，發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)不同品種上的ASSVd存在一定的寄主?；院偷貐^(qū)?；?；朱慧[24]對梨上的ASSVd分離物序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)源自37份梨樣品和13份蘋果樣品的ASSVd全長RNA序列經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析后其ASSVd分離物聚為兩組，且堿基發(fā)生變化的主要區(qū)域為左、右端區(qū)和致病區(qū)；查富蓉[25]從山東、山西和遼寧省采集的蘋果果實中選取11個ASSVd分離物，共得到71個ASSVd序列，比對共有序列并構(gòu)建二級結(jié)構(gòu)，可標(biāo)出71個ASSVd克隆的變異位點，除了在ASSVd二級結(jié)構(gòu)的右末端區(qū)（TR區(qū)）變異較小，只有一個堿基位點的變異，左末端區(qū)（TL區(qū)）、致病區(qū)（P區(qū)）、中央保守區(qū)（C區(qū)）和可變區(qū)（V區(qū)）均覆蓋了大量堿基位點的變異，這些變異大部分為單個克隆的變異，變異概率?。粍⒑橛竦萚26]對山東蘋果‘舞美’果實的ASSVd全序列分析后發(fā)現(xiàn)，分離物基因組主流序列為333 nt（登錄號MG745387），與GenBank中已報道的ASSVd序列一致性為92%—99%。序列多重比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該分離物的末端保守區(qū)和中央保守區(qū)與ASSVd參考序列一致，且與不同來源的ASSVd分離物親緣關(guān)系較近。【本研究切入點】前人關(guān)于ASSVd分子變異的研究多數(shù)只單純分析了某分離物分子變異位點及變異區(qū)域，自然界中病原與植物經(jīng)過長期的斗爭和演化，類病毒重組現(xiàn)象又很普遍，寄主中存在類病毒單一基因組的可能性很小，尤其是對于類病毒這種微小的病原，變異率很高，存在不同變體群體的可能性更大。因此，本研究針對不同蘋果品種上攜帶的ASSVd基因組進(jìn)行大量測序，分析不同品種中ASSVd變體群體的特點?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究不同蘋果品種中ASSVd基因組群體組成的差異，為進(jìn)一步揭示ASSVd分子變異機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

斗南、王林、中秋王、富士和金冠蘋果樣本于2018年采自河北保定順平，信儂黃、信儂紅品種樣本采自國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果實驗園，表現(xiàn)癥狀如圖1所示（金冠癥狀不明顯，圖略）。攜帶ASSVd和不攜帶ASSVd的樣本均進(jìn)行了RT-PCR鑒定。每個品種選擇6棵染病果樹，每棵樹按照東、西、南、北4個方向采樣并混合作為一個樣本，共計42份蘋果樣品，進(jìn)行PCR擴增和分子克隆。

1.2 RNA提取及cDNA合成

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）按照說明書提取樣本的總RNA。利用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA的濃度及純度。使用? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）按照說明書進(jìn)行cDNA合成，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增、產(chǎn)物回收與純化

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)GenBank已經(jīng)發(fā)表的ASSVd序列，選擇保守性區(qū)域設(shè)計特異性引物，上游引物序列為Qxin-5′：GAACCCACAGCG GAACTGG，下游引物序列為Qxin-3′：GCCTACAAG AACGTACGGTGTTGA，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上、下游引物（20 pmol·μL-1）各1 μL，2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，ddH2O定容至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min，退火49.1℃ 1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸1 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.4 連接及轉(zhuǎn)化

使用?-T1 Simple Cloning Kit（北京全式金生物科技有限公司）按照說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，置于冰上備用。取出凍存于-80℃的1-T1感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中（體積比為1﹕10），輕彈混勻后置于冰上30 min，42℃熱激30 s，冰上冷卻2 min。加入250 μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1.5 h。吸取150 μL菌液均勻涂布于含有氨芐、IPTG和X-gal的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12—16 h。

1.5 陽性克隆篩選及測序

采用藍(lán)白斑法及PCR方法篩選陽性克隆，委托華大基因公司進(jìn)行測序。每個品種6份樣本，分子克隆結(jié)合Chromas 2.4.1分析，獲得30條準(zhǔn)確的基因組序列，7個品種共獲得210條ASSVd的全長序列，進(jìn)行比對分析。將有差異的病毒基因組認(rèn)定為一個變體。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育和RNA二級結(jié)構(gòu)分析

使用DNAMAN軟件分析序列之間的一致性后，使用TBtools軟件進(jìn)行熱圖的繪制；應(yīng)用SDT1.2軟件對序列進(jìn)行分析，采用Muscle法進(jìn)行比對，鄰接法（neighbor-joining，NJ）對結(jié)果進(jìn)行聚類；應(yīng)用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Clustal W法對序列進(jìn)行比對，鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)育樹中各分支置信度（Bootstrap）進(jìn)行1 000次重復(fù)分析；最后使用RNA structure（參數(shù)設(shè)置：MAX% energy difference為10%，MAX number of structure為20）預(yù)測所得序列的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 不同蘋果品種中ASSVd基因組序列分析

對7個品種的42份蘋果樣本中的ASSVd擴增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，共獲得210條ASSVd全長序列，經(jīng)分析，包括17種變體，基因組大小在325—333 nt，上傳到GenBank，登錄號為 MH105019、MH105020、MG891838和MH105022—MH105035。

對17種變體進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果如圖2所示，各變體之間一致性在96.4%—100%。對不同蘋果品種的ASSVd 17種變體與已報道的 21個分離物進(jìn)行自動聚類和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖 3和圖4所示，17種變體可分為3組，組Ⅰ包含XNHo1-3（MH105032）、WL3（MH105030）、WL1-6（MH105028）、DN1-2（MH105020）、DN1（MH105019）、FS1-1（MG891838）、WL1-5（MH105027）、WL2-2（MH105029）、XNHo1（MH105031）和XNHu1-3（MH105033），同已報道的保定富士分離物（KR264032）親緣關(guān)系較近；組Ⅱ包含F(xiàn)S4-13（MH105024）、FS4-1（MH105022）、FS3-4（MH105025）、FS3-10（MH105026）、GD3-23（MH105035）和FS4-9（MH105023）單獨聚類；組Ⅲ包含ZQW7（MH105034），與新疆紅富士蘋果上的分離物（EU031455.1）親緣關(guān)系較近。

2.2 不同蘋果品種中ASSVd基因組突變位點分析

將7個蘋果品種上所得的17種ASSVd變體序列同河北保定首次報道的ASSVd富士分離物BD-1（KR264032.1）進(jìn)行比對，堿基位點以BD-1為參照，結(jié)果如圖5所示，斗南分離物DN1、DN1-2（MH105019，MH105020）有5個堿基位點發(fā)生了缺失，均在C區(qū)（98—101，CCGG缺失；221位T缺失）。富士分離物FS1-1、FS4-1、FS4-9、FS4-13、FS3-4、FS3-10（MG891838，MH105022，MH105023，MH105024，MH105025，MH105026）有22個堿基位點發(fā)生了變化，有10個位點在TL區(qū)（0，G缺失；2，T→G；3，A→T；22，T→A；41，T→A；42，A→G；44，A→T；46，T缺失；284，G→A；302，T→A），8個位點在C區(qū)（96，G→T；97—99，GCC缺失；221，T缺失；244，C→G；249，T→C；251，G缺失），4個位點在TR區(qū)（150，T缺失；160—161，GT缺失；163，C→T）。王林分離物WL1-5、WL1-6、WL2-2、WL-3（MH105027，MH105028，MH105029，MH1050230）有11個堿基位置發(fā)生了變化，9個位點發(fā)生在C區(qū)（95，A→G；98—101，CCGG缺失；106，A→G；221，T缺失；230，T→A；251，G→T），2個位點在V區(qū)（198，G→A；215，T→C）。信儂紅分離物XNHo1、XNHo1-3（MH105031，MH105032）同已報道的保定分離物相比（KR264032.1），有2個堿基位點發(fā)生了變化，分別為位于V區(qū)的116位點（C→T）和位于C區(qū)與P區(qū)交界處的251位點（G→T）。信儂黃分離物XNHu1-3（MH105033）有2個堿基位點發(fā)生了變化，均處于V區(qū)（116，C→T；206，G→A）。中秋王分離物（MH105034）有7個堿基位點發(fā)生了變化，4個位點位于TL區(qū)（41，T→A；42，A→G；44，A→T；46，T缺失），1個位點位于P區(qū)和C區(qū)的交界處（251，G→T），2個位點位于TR區(qū)（284，G→A；321，T→A）。金冠分離物GD3-23（MH105035）有13個堿基位點發(fā)生了變化，9個位點發(fā)生在TL區(qū)（0，G缺失；2，T→G；3，A→T；41，T→A；42，A→G；44，A→T；46，T缺失；284，G→A；302，T→A），1個位點發(fā)生在TR區(qū)（163，C→T），3個位點發(fā)生在C區(qū)（244，C→G；249，T→C；251，G缺失）。

將所得17種ASSVd變體進(jìn)行序列比對分析，堿基位點以保定分離物BD-1為參照，根據(jù)堿基位點差異，可以將全部的分離物序列分為6種類型（圖5）：1、nt 0—3（GGTA）+ nt 41—46（TAAAAT）+ nt 221（T）+ nt 251（T）+ nt 284（G）+ nt 302（T）；2、nt 0—3（XGGT）+ nt 41—46（AGATAX）+ nt 221（T）+ nt 251（X）+ nt 284（A）+ nt 302（A）；3、nt 0—3（XGGT）+ nt 41—46（AGATAX）+ nt 221（X）+ nt 251（T）+nt 284（A）+ nt 302（A）；4、nt 0—3（XGGT/GGTA）+ nt 41—46（AGATAX）+nt 221（T）+ nt 251（T）+ nt 284（A）+ nt 302（A）；5、nt 0—3（GGTA）+ nt 41—46（TAAAAT）+nt 221（X）+ nt 251（G）+ nt 284（G）+ nt 302（T）；6、nt 0—3（GGTA）+ nt 41—46（TAAAAT）+nt 221（T）+ nt 251（G）+ nt 284（G）+ nt 302（T）。其中X表示缺失。

2.3 不同蘋果品種中ASSVd群體組成分析

分析7個品種獲得的210條基因組序列，結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)每個品種含多種堿基類型，各不相同，也存在不同品種含有相同堿基類型的現(xiàn)象。富士品種含有6種堿基類型的ASSVd變體，以堿基類型4為主（47.5%）、堿基類型5占比25.0%，堿基類型6占比12.5%，堿基類型1占比10.0%，堿基類型2和3均占比2.5%；王林品種以堿基類型5為主（43.0%），堿基類型1占比28.4%，堿基類型6占比28.6；金冠以堿基類型4為主（60.0%），堿基類型2占比33.3%，堿基類型3占比6.7%；信儂紅以堿基類型1為主（83.3%），堿基類型6占比16.7%；信儂黃以堿基類型1為主（62.5%），堿基類型5占比25.0%，堿基類型6占比12.5%；斗南品種只包含堿基類型5；中秋王只包含堿基類型4。

表1 不同蘋果品種攜帶ASSVd的堿基類型

ASSVd堿基類型1—6與圖5在正文中描述一致ASSVd base types 1-6 are the same as the Fig.5 described in the text part

2.4 ASSVd二級結(jié)構(gòu)分析

使用RNA structure構(gòu)建ASSVd不同分離物的二級結(jié)構(gòu)，所得二級結(jié)構(gòu)均為傳統(tǒng)棍棒狀，與已報道的二級結(jié)構(gòu)一致（結(jié)果未顯示）。同時分析了各變體的最小自由能，結(jié)果如表2所示，DN1-2的最小自由能最低，為-583.2 kJ·mol-1，是斗南品種的優(yōu)勢變種-堿基類型5；WL1-6的最小自由能同樣也最低，為-583.2 kJ·mol-1，為王林品種優(yōu)勢變種-堿基類型5；WL2-2的最小自由能也較低，為-577.8 kJ·mol-1，是王林品種的優(yōu)勢變種-堿基類型6；XNHo1-3的最小自由能也相對較低，為-579.5 kJ·mol-1，為信儂紅的優(yōu)勢變種-堿基類型1。

3 討論

類病毒不能編碼蛋白質(zhì)，因此其復(fù)制和侵染過程都依靠寄主酶系統(tǒng)[27]。ASSVd基因組序列含有5個功能區(qū)，TL區(qū)（左末端區(qū)）、P區(qū)、C區(qū)（中央保守區(qū)）、V區(qū)、TR區(qū)（右末端區(qū)）。P區(qū)與類病毒所致病害的癥狀相關(guān)，TL和TR區(qū)的相對保守序列有利于復(fù)制酶的結(jié)合，這兩個區(qū)域在類病毒之間可以通過互換來進(jìn)行基因重組，有利于類病毒的進(jìn)化；C區(qū)為中央保守區(qū)，是控制類病毒復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域；而V區(qū)的構(gòu)造變化則同類病毒的復(fù)制能力密切相關(guān)[28-29]。本研究采集7個不同蘋果品種的42份染病樣本，獲得210條ASSVd全長序列，歸為17種變體。同保定首次報道的ASSVd分離物序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，在上述5個區(qū)域內(nèi)都有堿基位點的變化，多數(shù)變體的變異位點集中在TL區(qū)和C區(qū)。陳冉冉等[30]對我國不同蘋果產(chǎn)區(qū)的ASSVd序列分析發(fā)現(xiàn)，末端保守區(qū)及中央保守區(qū)保守，在致病區(qū)和左端區(qū)域有突變，一些分離物的突變位點相同。產(chǎn)生這種差異的原因可能與采集的范圍和品種不同有關(guān)。但在相同的堿基位點251均發(fā)現(xiàn)了變異，不同的是，陳冉冉等發(fā)現(xiàn)堿基位點251的變化為G→A，對應(yīng)的龍冠果實表現(xiàn)癥狀為畸形，本研究發(fā)現(xiàn)堿基位點251的變化為G缺失或G→T，未發(fā)現(xiàn)與癥狀有明顯的相關(guān)性。

表2 不同ASSVd分離物二級結(jié)構(gòu)最小自由能

對ASSVd系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，本研究所得17種變體可分為3組，未表現(xiàn)出明顯的地域?qū)；院图闹鲗；浴８髌贩N寄主均攜帶不同ASSVd堿基類型組成的混合種群，攜帶ASSVd變體類型和所占比例有很大差異，說明寄主品種對ASSVd的自然選擇壓力造成了病毒基因組的變異及種群結(jié)構(gòu)的變化。由于蘋果為多年生木本植物，童期較長，且高度雜合，加上生長周期長，導(dǎo)致寄主本身的遺傳背景比較復(fù)雜，從而導(dǎo)致與其互作的病毒的變異研究也比較復(fù)雜。這可能也是不同品種果樹中攜帶ASSVd復(fù)合群體多樣的原因之一。

已知類病毒的基因組為非編碼RNA，在侵染過程中復(fù)制、長距離運輸?shù)冗^程可能均依靠病毒緊密的二級結(jié)構(gòu)[28,31-32]。結(jié)合類病毒的抗RNA沉默機制推測最小自由能越小，解螺旋所需要耗費的ATP越多，二級結(jié)構(gòu)也越穩(wěn)定。筆者發(fā)現(xiàn)不同蘋果品種中所占比例較多的ASSVd優(yōu)勢變體，多數(shù)最小自由能是相對較小的，這與前人報道一致，研究結(jié)果為類病毒分子變異及病毒與寄主互作機制研究提供了線索。

4 結(jié)論

根據(jù)ASSVd nt 0—3、221、251、284、302這8個位點的堿基變異，將富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信儂紅、信儂黃品種中17種變體分為6種類型，不同蘋果品種攜帶的ASSVd種群結(jié)構(gòu)不同。

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Molecular Variation and Phylogenetic Relationship of Apple Scar Skin Viroid in Seven Cultivars of Apple

Li ZiTeng, Cao YuHan, Li Nan, Meng XiangLong, Hu TongLe, Wang ShuTong, Wang YaNan*, Cao KeQiang

College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei

【Objective】The objective of this study is to explore the molecular variation and phylogenetic relationship of apple scar skin viroid (ASSVd) in different cultivars of apple, and to lay a foundation for further revealing the molecular variation mechanism of ASSVd.【Method】The different cultivars of apple including Fuji, Tonami, Wang lin, Mid-Autumn King, Gold Delicious, Xin Nonghong and Xin Nonghuang, infected by ASSVd were used as materials to amplify complete genome sequence by specific primers, and then molecular cloning and sequencing were performed.Biological software DNAMAN was used to analyze the identities of the variant sequences and the MEGA was used to construct a phylogenetic tree.【Result】A total of 210 sequences of ASSVd were obtained, with a total of 17 variants, with a size of 325-333 nt.Seventeen variants of ASSVd were aligned and analyzed with other published representative isolates.The result showed that all the variants were divided into three groups.Group I includes 10 variants, which are closely related to the reported Baoding Fuji isolate (KR264032.1).Group II includes 6 variants, which are clustered separately.Group III includes one variant, which is closely related to the Xinjiang Fuji isolate (EU031455.1).Based on 8 variation base sites at genome 0-3, 221, 251, 284, and 302, the 17 variants were divided into 6 type including: 1.nt 0-3 (GGTA) + nt 41-46 (TAAAAT) + nt 221 (T) + nt 251 (T) +nt 284 (G) + nt 302 (T); 2.nt 0-3 (XGGT) + nt 41-46 (AGATAX) + nt 221 (T) + nt 251(X) + nt 284 (A) + nt 302 (A); 3.nt 0-3 (XGGT) + nt 41-46 (AGATAX) + nt 221 (X) + nt 251 (T) + nt 284 (A) + nt 302 (A); 4.nt 0-3 (XGGT/GGTA) + nt 41-46 (AGATAX) + nt 221 (T) + nt 251 (T) + nt 284 (A) + nt 302 (A); 5.nt 0-3 (GGTA) + nt 41-46 (TAAAAT) + nt 221 (X) + nt 251 (G) + nt 284 (G) + nt 302 (T); 6.nt 0-3 (GGTA) + nt 41-46 (TAAAAT) + nt 221 (T) + nt 251 (G) + nt 284 (G) + nt 302 (T).X represents missing.There are 6 types of variants in Fuji, type 4 (47.5%) is the main type.There are 3 types of variants in Wang Lin, type 5 (43%) is the main type.There are 3 types of variants in Gold delicious, type 4 (60%) is the main type.ASSVd obtained from Tonami is type 5 (100%).ASSVd obtained from Mid-Autumn King is type 4 (100%).There are 2 types in Xin Nonghong, type 1 (83.3%) is the main type.There are 3 types in Xin Nonghuang, type 1 (62.5%) is the main type.【Conclusion】Seventeen variants from 7 cultivars are divided into 6 types according to the 8 variation base sites of ASSVd nt 0-3, 221, 251, 284, and 302.Different apple cultivars carry different ASSVd population structures.The types and proportions of ASSVd variants are different.

apple scar skin viroid (ASSVd); genome; molecular cloning; molecular evolution; molecular variation

2021-03-10；

2021-04-23

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-27）、河北省自然科學(xué)基金（C2019204327）、河北省重點研發(fā)計劃（21326506D，19226508D，20327405D）、河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項目（C201839）

李紫騰，E-mail：lzt304838566@163.com。曹鈺晗，E-mail：c897836047@163.com。李紫騰和曹鈺晗為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王亞南，E-mail：wyn3215347@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）