下調(diào)LncRNA KCNQ1OT1對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

徐輝聰 林振群 林智 吳育芝 熊俊成

(1.?？谑械谌嗣襻t(yī)院耳鼻喉科,海南 ?？?571100；2.海南省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,海南 ?？?570311；3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199)

喉癌是頭頸部比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，患者主要有聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽困難、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等癥狀[1]。近年來(lái)，喉癌患者通過(guò)手術(shù)、放射化療及生物治療等方式進(jìn)行治療，5年生存率得以提高。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量越多，體積越大，5年生存率越低[2]。因此深入研究喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制能為患者的早期診斷和晚期預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子，不具有蛋白質(zhì)編碼功能。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3-4]，還參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA KCNQ1OT1(KCNQ1OT1)在癌細(xì)胞中異常表達(dá)并參與了多種癌癥的進(jìn)展。如KCNQ1OT1在卵巢癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并通過(guò)miR-217/ZEB1反饋回路促進(jìn)了結(jié)直腸癌的遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[6-7]。另有研究顯示，KCNQ1OT1在鼻咽癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá),過(guò)表達(dá)KCNQ1OT1可通過(guò)增加SEMA3B基因的表達(dá),抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移[8]。然而，KCNQ1OT1在喉癌發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探究KCNQ1OT1在喉癌發(fā)展過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步闡明喉癌的進(jìn)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 喉癌細(xì)胞Hep-2和正常喉上皮細(xì)胞HLEC購(gòu)自北京清源浩生物科技有限公司；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle′s medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)于大連Takara公司；Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP、Goat anti-Mouse IgG (H+L)-HRP、E-cadherin、N-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物科技有限公司；FAK、Src、MAPK、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；FAK通路抑制劑Y15購(gòu)自美國(guó)MCE公司；siRNA NC、KCNQ1OT1 siRNA、pcDNA-KCNQ1OT1、mimics NC、miR-138 mimics、inhibitor NC、miR-138 inhibitor質(zhì)粒由北京擎科生物有限公司合成；點(diǎn)突變?cè)噭┖泻碗p熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒為中國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞和HLEC細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，將細(xì)胞按相應(yīng)密度接種于6孔板或12孔板中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的細(xì)胞，用胰酶消化，用含10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞后，按照按1×105個(gè)/孔的密度鋪于12孔板中，細(xì)胞密度匯合達(dá)65%時(shí)，更換細(xì)胞培養(yǎng)液為新鮮DMEM，細(xì)胞按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分組為：①siRNA NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的陰性對(duì)照質(zhì)粒)、KCNQ1OT1 siRNA組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的KCNQ1OT1 siRNA質(zhì)粒)。②Control組、Y15組(作用10 μmol/L的Y15)、inhibitor NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的抑制劑對(duì)照組)、miR-138 inhibitor組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miR-138抑制劑)、miR-138 inhibitor+Y15組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miR-138抑制劑+10μmol/L的Y15)。③mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、miR-138 mimics組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miR-138模擬物)。④KCNQ1OT1 wt+mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的KCNQ1OT1野生型質(zhì)粒+50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、KCNQ1OT1 wt+miR-138 mimics組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的KCNQ1OT1野生型質(zhì)粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)、KCNQ1OT1 mut+mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的KCNQ1OT1突變型質(zhì)粒+50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、KCNQ1OT1 mut+miR-138 mimics組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的KCNQ1OT1突變型質(zhì)粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)。⑤pcDNA-3.1(+)+mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的pcDNA-3.1(+)質(zhì)粒+50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、pcDNA-KCNQ1OT1+mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的pcDNA-KCNQ1OT1質(zhì)粒+50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、miR-138 mimics+pcDNA-3.1(+)組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miR-138模擬物+50 nmol/L的pcDNA-3.1(+)質(zhì)粒)、pcDNA-KCNQ1OT1+miR-138 mimics組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的pcDNA-KCNQ1OT1質(zhì)粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)。⑥FAK wt+mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的FAK野生型質(zhì)粒+50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、FAK wt+miR-138 mimics組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的FAK野生型質(zhì)粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)、FAK mut+mimics NC組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的FAK突變型質(zhì)粒+50 nmol/L的模擬物對(duì)照)、FAK mut+miR-138 mimics組(轉(zhuǎn)染50 nmol/L的FAK突變型質(zhì)粒+50 nmol/L的miR-138模擬物)。采用Tubfect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞RNA樣和蛋白樣進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)95%時(shí)，用含10% FBS DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)1×105個(gè)/mL的密度鋪于96孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%時(shí)，采用Tubfect試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，每組重復(fù)8個(gè)，培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后棄上清，PBS洗2次，每孔加10 μL CCK-8工作液，孵育4 h，使用酶標(biāo)儀上讀取各孔在450 nm處的吸光值(OD)，并計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將-20 ℃保存的matrigel取出，放在4 ℃條件下融化，用無(wú)FBS DMEM培養(yǎng)基稀釋matrigel，使?jié)舛葹? mg/mL，添加100 μL稀釋后的matrigel于每個(gè)上室中，繼續(xù)孵育5 h凝成膠狀。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，PBS洗兩次，使用胰酶消化，用無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液調(diào)整密度為5×105/mL，加入適量細(xì)胞懸液于Transwell小室中，下室中為10% FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，取出小室，PBS洗2次，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，隨機(jī)選取5個(gè)視野細(xì)胞放在顯微鏡下觀察并記數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 用miRanda和TargetScan分別預(yù)測(cè)KCNQ1OT1和FAK潛在靶基因，PCR擴(kuò)增KCNQ1OT1 3′UTR片段及FAK 3′UTR片段，構(gòu)建KCNQ1OT1 wt和FAK wt載體，再使用點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建KCNQ1OT1和FAK突變體。使用Tubfect試劑轉(zhuǎn)染各組重組質(zhì)粒，通過(guò)雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度后，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，按照42 ℃，2 min；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s的程序進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè) 按實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)細(xì)胞一定時(shí)間后，將收取的蛋白樣中加入RIPA裂解液，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，點(diǎn)樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，按照80 V 30 min、110 V 2 h的程序進(jìn)行，結(jié)束電泳后使用濕轉(zhuǎn)儀器轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上。結(jié)束轉(zhuǎn)膜后，PVDF膜與50 g/L脫脂奶粉配制的封閉液在室溫共孵育2 h，孵育結(jié)束后PVDF膜與特異性一抗(Ecadherin 1∶200、Ncadherin 1∶200、FAK 1∶1000、p-FAK 1∶2000、Src 1∶1500、p-Src 1∶2000、MAPK 1∶1000、p-MAPK 1∶1500、GAPDH 1∶3000)在4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗5次，PVDF膜與相應(yīng)二抗在室溫孵育2 h，TBST洗5次，每次5min，滴加ECL反應(yīng)液后即可進(jìn)行目的蛋白曝光。分析LncRNA KCNQ1OT1通過(guò)miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白Ecadherin、Ncadherin表達(dá)及其FAk/Src/MAPK通路的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默KCNQ1OT1抑制Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT Hep-2細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)量明顯高于HLEC細(xì)胞(P<0.01)(圖1A)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組的KCNQ1OT1表達(dá)量明顯降低(P<0.01)(圖1B)；KCNQ1OT1 siRNA組的細(xì)胞增殖能力低于siRNA NC組(P<0.05)(圖1C)；KCNQ1OT1 siRNA組細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯低于siRNA NC組(P<0.01)(圖1D、1E)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)(圖1F、1G)。結(jié)果表明沉默KCNQ1OT1能夠抑制Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖1 沉默KCNQ1OT1抑制Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 1 Silencing KCNQ1OT1 inhibited the proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells注：A.RT-qPCR檢測(cè)KCNQ1OT1在Hep-2和HLEC細(xì)胞中的表達(dá)量；B.RT-qPCR檢測(cè)干擾KCNQ1OT1后細(xì)胞中的KCNQ1OT1的表達(dá)量；C.CCK-8檢測(cè)KCNQ1OT1對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響；D.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KCNQ1OT1對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲的影響；E.Hep-2細(xì)胞的侵襲數(shù)目；F.Western blot檢測(cè)KCNQ1OT1對(duì)Hep-2細(xì)胞EMT的影響；G.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

2.2 KCNQ1OT1和miR-138之間的靶向和調(diào)控關(guān)系 miRanda預(yù)測(cè)KCNQ1OT1和miR-138之間的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。當(dāng)質(zhì)粒攜帶KCNQ1OT1 3′UTR wt時(shí)，miR-138的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),當(dāng)質(zhì)粒攜帶KCNQ1OT1 3′UTR mut時(shí)，miR-138的熒光素酶活性無(wú)變化(P>0.05)(圖2B)。與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組miR-138的表達(dá)量明顯上升(P<0.01)(圖2C)。結(jié)果表明KCNQ1OT1和miR-138之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖2 KCNQ1OT1和miR-138之間的靶向和調(diào)控關(guān)系(n=3)Figure 2 Targeting and regulatory relationship between KCNQ1OT1 and miR-138注：A.miRanda預(yù)測(cè)KCNQ1OT1和miR-138之間的結(jié)合位點(diǎn)；B.熒光素酶表達(dá)量的定；C.RT-qPCR檢測(cè)miR-138的表達(dá)量。兩組比較，①P<0.01

2.3 沉默miR-138促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT Hep-2細(xì)胞中miR-138的表達(dá)量明顯低于HLEC細(xì)胞(P<0.01)(圖3A)。和inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組的miR-138表達(dá)量明顯下降(P<0.01)(圖3B)。miR-138 inhibitor組的細(xì)胞增殖能力高于inhibitor NC組(P<0.05)(圖3C)。miR-138 inhibitor組細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯高于inhibitor NC組(P<0.01)(圖3D、3E)。和inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組的E-cadherin蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)(圖3F、3G)。結(jié)果表明沉默miR-138能夠促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖3 沉默miR-138促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 3 Silencing miR-138 promoted the proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells注：A.RT-qPCR檢測(cè)miR-138在Hep-2和HLEC細(xì)胞中的表達(dá)量；B.RT-qPCR檢測(cè)干擾miR-138后細(xì)胞中miR-138的表達(dá)量；C.CCK-8檢測(cè)miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響；D.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲的影響；E.Hep-2細(xì)胞的侵襲數(shù)目；F.Western blot檢測(cè) miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞EMT的影響；G.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

2.4 KCNQ1OT1通過(guò)miR-138調(diào)控Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT 與mimics NC組相比，miR-138 mimics組miR-138的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)(圖4A)。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-KCNQ1OT1+mimics NC組細(xì)胞增殖能力增加(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，miR-138 mimics+pcDNA-3.1(+)組的細(xì)胞增殖能力下降(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；與miR-138 mimics+pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-KCNQ1OT1+miR-138 mimics組的細(xì)胞增殖能力上升(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)(圖4B～4G)。結(jié)果表明KCNQ1OT1通過(guò)miR-138調(diào)控Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。

圖4 KCNQ1OT1通過(guò)miR-138調(diào)控Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 4 KCNQ1OT1 regulated the proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells through miR-138注：A.RT-qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-138后細(xì)胞中的miR-138表達(dá)量；B.CCK-8檢測(cè)KCNQ1OT1通過(guò)miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響；C.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KCNQ1OT1通過(guò)miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲的影響；D.Hep-2細(xì)胞的侵襲數(shù)目；E.Western blot檢測(cè)KCNQ1OT1通過(guò)miR-138對(duì)Hep-2細(xì)胞EMT的影響；F.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

2.5 miR-138和FAK之間的靶向和調(diào)控關(guān)系 預(yù)測(cè)miR-138和FAK之間的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。當(dāng)質(zhì)粒攜帶FAK 3′UTR wt時(shí)，miR-138的熒光素酶活性下降(P<0.01)；當(dāng)質(zhì)粒攜帶FAK 3′UTR mut時(shí)，miR-138的熒光素酶活性無(wú)變化(P>0.05)(圖5B)。與inhibitor NC相比，miR-138 inhibitor促進(jìn)FAK的基因表達(dá)(圖5C)。結(jié)果表明FAK和miR-138之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖5 miR-138和FAK之間的靶向和調(diào)控關(guān)系(n=3)Figure 5 Targeting and regulatory relationships between miR-138 and FAK注：A.TargetScan預(yù)測(cè)miR-138和FAK之間的結(jié)合位點(diǎn)；B.熒光素酶表達(dá)量的測(cè)定；C.RT-qPCR檢測(cè)FAK的表達(dá)量。兩組比較，①P<0.01

2.6 沉默miR-138激活Hep-2細(xì)胞中FAK/Src/MAPK信號(hào)通路 與inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組FAK、Src、MAPK蛋白的磷酸化水平升高，p-FAK/FAK、p-Src/Src和p-MAPK/MAPK比值升高(P<0.01)；與mimics NC組相比，miR-138 mimics組FAK、Src、MAPK蛋白的磷酸化水平下降，p-FAK/FAK、p-Src/Src和p-MAPK/MAPK比值降低(P<0.01)。結(jié)果表明沉默miR-138能夠激活Hep-2細(xì)胞中FAK/Src/MAPK信號(hào)通路。見(jiàn)圖6。

圖6 沉默miR-138激活Hep-2細(xì)胞中FAK/Src/MAPK信號(hào)通路(n=3)Figure 6 Silencing miR-138 activated the FAK/Src/MAPK signaling pathway in Hep-2 cells注：A.Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)及干擾miR-138后Hep-2細(xì)胞中FAK、Src、MAPK蛋白磷酸化水平；B.p-FAK/FAK、p-Src/Src和p-MAPK/MAPK比值。兩組比較，①P<0.01

2.7 沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 和inhibitor NC組相比，miR-138 inhibitor組的細(xì)胞增殖能力升高(P<0.05)，侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)；和Control組相比，Y15組的細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.01)，侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；和miR-138 inhibitor組相比，miR-138 inhibitor+Y15組的細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01)，侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。結(jié)果表明沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。見(jiàn)圖7。

圖7 沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和EMT(n=3)Figure 7 Silencing miR-138 activated the FAK/Src/MAPK signaling pathway to promote proliferation,invasion and EMT of Hep-2 cells注：A.CCK-8法檢測(cè)沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK通路對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響；B.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK通路對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲的影響；C.Hep-2細(xì)胞的侵襲數(shù)目；D.Western blot檢測(cè)沉默miR-138激活FAK/Src/MAPK通路對(duì)Hep-2細(xì)胞EMT的影響；E.E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。兩組比較，①P<0.05;②P<0.01

3 討論

lncRNA介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)錄在多生物學(xué)功能中發(fā)揮重要的作用。研究表明，lncRNA通過(guò)與染色質(zhì)相互作用，從遺傳學(xué)上調(diào)節(jié)染色體域的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。lncRNA KCNQ1OT1作為一種印跡基因，是一種與染色質(zhì)相互作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明lncRNA KCNQ1OT1的異常表達(dá)可能作為癌基因或抑癌基因，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，可作為癌癥的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。例如，lncRNA KCNQ1OT1通過(guò)miR-211-5p介導(dǎo)的Ezrin/Fak/Src信號(hào)通路調(diào)控舌癌細(xì)胞增殖和順鉑耐藥[9]；異常表達(dá)的lncRNA KCNQ1OT1是診斷早期胃癌的生物標(biāo)志物[10]；lncRNA KCNQ1OT1在NSCLC組織中高表達(dá)，與患者的預(yù)后相關(guān)，可作為潛在的肺癌預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA KCNQ1OT1通過(guò)靶向miR-34a/ATG4B途徑增強(qiáng)奧沙利鉑在結(jié)腸癌中的耐藥[12]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，KCNQ1OT1在喉癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，KCNQ1OT1的異常表達(dá)提示分子與喉癌發(fā)展密切相關(guān)，這與KCNQ1OT1在舌癌、結(jié)直腸癌和肺癌中的研究結(jié)果一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)干擾KCNQ1OT1的表達(dá)抑制了Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT進(jìn)程，表明KCNQ1OT1能夠作為癌基因在喉癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。

lncRNA作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA或miRNA海綿，參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)[13-14]。本研究探討了lncRNA KCNQ1OT1是否通過(guò)與miRNA相互作用而發(fā)揮功能。通過(guò)生物學(xué)信息軟件預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1和miR-138具有靶向和負(fù)調(diào)控關(guān)系。有研究表明miR-138參與各種癌癥的發(fā)生發(fā)展。miR-138可直接靶向FAK激酶，抑制細(xì)胞侵襲，增加癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[15]，在前列腺癌中可以通過(guò)CTNNB1的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)間接上調(diào)AMACR表達(dá)[16]，通過(guò)靶向PI3K/AKT自噬信號(hào)通路中的PDK1抑制惡性黑色素瘤發(fā)展[17]，可抑制人SGC-7901細(xì)胞的增殖能力,機(jī)制可能是通過(guò)抑制靶基因hTERT蛋白的表達(dá)[18]，上調(diào)miR-138表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，可能與負(fù)向調(diào)節(jié)Sema4C表達(dá)有關(guān)[19]?？紤]到miR-138在各種癌癥發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用，本研究深入探討miR-138在喉癌中的臨床意義，發(fā)現(xiàn)miR-138在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞。本研究將miR-138干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞增殖能力升高，侵襲數(shù)目明顯增加，E-cadherin蛋白表達(dá)量下降，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升，而過(guò)表達(dá)miR-138后，明顯抑制了Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，這與miR-138在腎細(xì)胞癌、鼻咽癌、膽囊癌等多種癌癥中發(fā)揮的作用一致，說(shuō)明在Hep-2細(xì)胞發(fā)展過(guò)程中，miR-138發(fā)揮了明顯的抑癌功能。此外還發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1能夠通過(guò)miR-138促進(jìn)喉癌的增殖、侵襲和EMT，沉默miR-138通過(guò)激活FAK/Src/MAPK通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和EMT，提示我們FAK/Src/MAPK通路可能是喉癌患者靶向治療的一個(gè)新方向，值得進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié)論

下調(diào)LncRNA KCNQ1OT1通過(guò)miR-138/FAK/Src/MAPK軸可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解喉癌發(fā)展的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為喉癌患者的臨床診斷和治療提供了試驗(yàn)依據(jù)。