超高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定金紅片中川楝素的含量

李 偉，郝晶晶，梅升輝，趙志剛

(1.北京衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，北京 101101；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100070)

金紅片是由川楝子、延胡索(醋制)、紅花八角葉和木香組成的復(fù)方制劑，可用于慢性淺表性胃炎、肝胃不和證等[1-2]。目前金紅片的檢測(cè)方法中僅對(duì)延胡索乙素進(jìn)行控制，而川楝子作為君藥卻沒(méi)有任何體現(xiàn)。川楝子的主要成分為川楝素，具有豐富的藥理作用[3-4]，如抑制胃癌細(xì)胞增殖作用[5-7]等，與金紅片的藥效非常相關(guān)。對(duì)于川楝素的定量分析可使用高效液相色譜法[8-12]或液-質(zhì)聯(lián)用法[13-20]，但均存在前處理復(fù)雜、分離度差和分析時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法用于金紅片中川楝素的檢測(cè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，此方法前處理簡(jiǎn)單，分離時(shí)間短，靈敏度高，為金紅片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)升級(jí)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Exion LC AD型高效液相色譜儀(美國(guó)AB Sciex 公司)；QTRAP 6500+型質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex 公司)；Mettler NewClassic MS型電子天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 藥品與試劑

金紅片(批號(hào)為180401、190303及190401，購(gòu)自金鶴年堂大藥房，均為市售產(chǎn)品)；川楝素對(duì)照品(批號(hào)為111842-201804，純度為96.9%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈和蒸餾水(均為色譜純，購(gòu)自Fisher公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件：使用Exion LC AD超高效液相色譜儀，QTRAP 6500+質(zhì)譜儀。采用Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，流速為0.5 ml/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。梯度洗脫程序：0 min，70%A；0～3 min，70%～50%A；3～3.5 min，50%～5%A；3.5～4.0 min，5%～5%A；4.0～4.1 min，5%～70%A；4.1～5.0 min，70%～70%A。

2.1.2 質(zhì)譜條件：質(zhì)譜離子化方式為電噴霧離子源負(fù)離子模式(ESI-)，川楝素在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式下的定量離子對(duì)為m/z 573.3→531.3，碰撞電壓為-26 V，去簇電壓為-95 V，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 川楝素的質(zhì)譜圖Fig 1 Mass spectrum of toosendanin

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：取川楝素對(duì)照品適量精密稱定，加入甲醇制成每1 ml含1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用70%甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為200、20、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.02及0.01 μg/L的工作液(S10—S1)。按“2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2(A)。

2.2.2 供試品溶液的制備：取樣品片5片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取樣品粉末10 mg，置于10 ml容量瓶中，加入甲醇振搖2 min，超聲20 min萃取，以12 000 r/min離心10 min后，取上清液加入70%甲醇水溶液稀釋10倍即得。按“2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2(B)。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備：用70%甲醇水溶液作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性范圍考察與定量限測(cè)定

取川楝素對(duì)照品工作液S1—S10各10 μl，分別進(jìn)樣，川楝素有2個(gè)互變異構(gòu)體，出現(xiàn)2個(gè)峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-17]。以川楝素對(duì)照品工作液的濃度為橫坐標(biāo)，2個(gè)峰面積之和為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。檢測(cè)限為0.005 μg/L，定量限為0.01 μg/L。川楝素在0.01～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為Y=318.746 94X+680.963 67(r=0.997 9)。

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；圖中峰1、2 為川楝素異構(gòu)體(toosendanin isomer)A.control solution;B.test solution;C.negative control solution;peaks 1 and 2 in the figure indicates toosendanin isomer圖2 超高效液相色譜圖Fig 2 Ultra-high performance liquid chromatography diagram

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液S5，連續(xù)進(jìn)樣10次，計(jì)算峰面積的RSD為1.39%，表明儀器精密度良好，見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision test

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品金紅片(批號(hào)為180401)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果顯示，川楝素含量的平均值為61.35 μg/g，RSD為0.99%，表明重復(fù)性良好，見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of repeatability test

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的金紅片樣品，精密稱定，3份1組，分別精密加入低、中及高3個(gè)濃度(相當(dāng)于川楝素含有量80%、100%及120%)的川楝素對(duì)照品溶液適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，表明樣品提取效率穩(wěn)定。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of recovery test

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批金紅片(批號(hào)為190303)供試品溶液，室溫(25 ℃)放置，分別于0、2、4、6、8、12、24及48 h按上述條件測(cè)定，測(cè)得川楝素峰面積的RSD(n=7)為4.3%，表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批次的金紅片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 金紅片中川楝素的含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Content determination of toosendanin in Jinhong tablets

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)川楝素的結(jié)構(gòu)，選擇ESI-模式采集，定量離子對(duì)為m/z 573.3→531.3(母離子為川楝素丟失1個(gè)氫原子，子離子為川楝素的酯鍵出現(xiàn)α斷裂后，丟失CH3—C≡+O碎片[17])。檢測(cè)方式為MRM模式。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，選擇氣簾氣172 kPa，離子化溫度450 ℃，噴霧電壓-4 500 V，離子源氣體GS1 207 kPa、GS2 414 kPa，碰撞電壓-26 V，去簇電壓-95 V。

3.2 色譜方法的優(yōu)化

流動(dòng)相選擇方面，分別嘗試了甲醇和乙腈作為有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，川楝素的2個(gè)異構(gòu)體分離效果較差；而乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，峰形較好，且異構(gòu)體能達(dá)到基線分離。在水相選擇中，分別嘗試了水[8]和0.01%甲酸溶液[14-20]，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，甲酸溶液作為水相信號(hào)下降了約1倍，這可能是在負(fù)離子檢測(cè)模式下，需要化合物減去氫，而甲酸是氫的供體，因此加入甲酸后信號(hào)出現(xiàn)了下降。最終本研究選擇乙腈和水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了靈敏度，達(dá)到了2個(gè)異構(gòu)體峰基線分離的效果。

綜上所述，本研究建立了金紅片中川楝素含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，線性范圍寬，線性關(guān)系好，精密度高，分析時(shí)間短，前處理簡(jiǎn)單，回收率、精密度和穩(wěn)定性都能滿足定量分析的要求，可作為金紅片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的參考。