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    長(zhǎng)鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1靶向miR-330促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥作用

    2021-10-26 08:33:32李銳祝喜萍宋蕾
    中華胰腺病雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶胰腺癌靶向

    李銳 祝喜萍 宋蕾

    黑龍江省醫(yī)院消化病院消化三科,哈爾濱 150086

    化療耐藥是導(dǎo)致胰腺癌高病死率的重要原因之一[1-2]。隨著化療藥物的長(zhǎng)期使用,機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生耐藥性,化療藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺滅力度明顯降低,影響患者的生存時(shí)間[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200nt的非編碼RNA,主要通過(guò)內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA的作用方式參與多種疾病的病理生理過(guò)程。小核仁RNA宿主基因(small nucleolar RNA host genes,SNHGs)是lncRNA的一個(gè)亞群,有報(bào)道其成員SNHG1、SNHG 6異常表達(dá)參與多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[4-7]。miR-330是SNHG1的下游靶基因之一,現(xiàn)有的研究表明miR-330在膠質(zhì)瘤[8]、結(jié)直腸癌[9]以及肺癌[10]等癌細(xì)胞中低表達(dá)。吉西他濱(gemcitabine, GEM)為胰腺癌的一線化療藥物[11-13],目前關(guān)于SNHG1和miR-330在胰腺癌GEM耐藥中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討SNHG1對(duì)胰腺癌GEM耐藥細(xì)胞增殖活性以及侵襲遷移能力的影響,驗(yàn)證SNHG1與miR-330的靶向關(guān)系,闡明SNHG1/miR-330信號(hào)軸在胰腺癌GEM耐藥中的作用。

    資料與方法

    一、胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織lncRNA SNHG1和miR-330表達(dá)檢測(cè)

    收集癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)胰腺癌數(shù)據(jù)集的179例胰腺癌組織和171例癌旁正常胰腺組織的臨床數(shù)據(jù),通過(guò)GEOtoR軟件分析胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織lncRNA SNHG1和miR-330的表達(dá)。

    二、GEM耐藥的胰腺癌PANC1細(xì)胞株的構(gòu)建

    人胰腺癌PANC1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,常規(guī)復(fù)蘇、傳代。體外采用間歇梯度倍增法[14]用GEM刺激PANC1細(xì)胞24周,建立GEM耐藥PANC1細(xì)胞株(耐藥株)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100 μmol/L的GEM刺激效果最佳,故以下實(shí)驗(yàn)均采用100 μmol/L的GEM刺激獲得耐藥細(xì)胞。

    取PANC1耐藥細(xì)胞,使用Lipofectamine 3000(Life Technologies,美國(guó))分別將陰性對(duì)照siRNA(si-NC)、靶向lncRNA SNHG1的siRNA(si-SNHG1)轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞,并運(yùn)用Geneticin(Sigma-Aldrich,美國(guó))進(jìn)行篩選,建立穩(wěn)定的si-NC耐藥株、si-SNHG1耐藥株及單純耐藥株。此外,為了驗(yàn)證SNHG1對(duì)miR-330的調(diào)控作用,分別將陰性對(duì)照抑制劑(NC-inhibitor,NC-inh)和si-NC、NC-inh和si-SNHG1、miR-330-inh和si-SNHG1共同轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞,建立了穩(wěn)定的NC-inh+si-NC耐藥株、NC-inh+si-SNHG1耐藥株及miR-330-inh+si-SNHG1耐藥株。所有的miRNA、siRNA以及陰性對(duì)照均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

    三、GEM耐藥PANC1細(xì)胞的lncRNA SNHG1和miR-330表達(dá)檢測(cè)

    取3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1耐藥細(xì)胞,采用TRIzol(Life Technologies,美國(guó))法提取細(xì)胞總RNA,運(yùn)用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa,日本)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,上Bio-Rad-CFX-qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems Inc.,美國(guó)),使用SYBR Green Master(ROX;Roche,加拿大)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。SNHG1 正向引物序列為5′-TGCAATGTTCAGCCCACAAG-3′,反向引物序列為5′-GCA-GCTGAATTCCCCAGGATA-3′;miR-330 正向引物序列為5′-TCTCTGGGCCTGTGTCTTAG-3′,反向引物序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′,內(nèi)參U6正向引物序列為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向引物序列為5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′;內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′,反向引物序列為5′-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。通過(guò)儀器自帶軟件獲取擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值,采用公式2-ΔΔCt計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)管,取均值。

    四、GEM耐藥PANC1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

    選用3~6代si-NC耐藥組、si-SNHG1耐藥組、單純耐藥組、NC inh+si-NC耐藥組、NC inh+si-SNHG1耐藥組以及miR-330 inh+si-SNHG1耐藥組的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1細(xì)胞,以每孔2×103個(gè)細(xì)胞種植于96孔板,加入GEM(100 μmol/L)孵育48 h,各孔加入10 μl CCK-8染料(中國(guó)碧云天公司),置37℃繼續(xù)孵育4 h,上酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處每孔的吸光度值(A450值)。

    取各組1×106個(gè)細(xì)胞,均勻鋪在含有無(wú)菌玻片的6孔板中,加入GEM(100 μmol/L)繼續(xù)孵育48 h,4%甲醛固定30 min,隨后加入Ki67抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物有限公司),按照免疫熒光操作流程進(jìn)行熒光染色,置熒光顯微鏡下(40倍)觀察細(xì)胞熒光,用Imagej軟件定量細(xì)胞內(nèi)Ki67的熒光強(qiáng)度。

    五、GEM耐藥PANC1細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

    采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。Transwell小室隔膜上表面加50 μl基質(zhì)凝膠過(guò)夜。取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml,Transwell上室加100 μl細(xì)胞懸液,下室加500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后取出小室的隔膜,用棉簽輕輕擦去未穿膜細(xì)胞,乙醇固定隔膜5 min,1%的結(jié)晶紫染色30 min,置倒置相差顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)200倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組做6個(gè)Transwell小室,取均值。

    六、GEM耐藥PANC1細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

    采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將各組1×106個(gè)/ml細(xì)胞接種到6孔板,培養(yǎng)過(guò)夜形成單層細(xì)胞時(shí),使用10 μl的槍頭垂直于孔板底部劃3條直線,間隔0.5 cm,用PBS洗滌3次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,置倒置相差顯微鏡下對(duì)劃痕前后的相應(yīng)區(qū)域拍照。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。使用Image J軟件計(jì)算各組細(xì)胞遷移24 h后的遷移距離。

    七、lncRNA SNHG1與miR-330的靶向關(guān)系驗(yàn)證

    通過(guò)Starbase 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)搜索lncRNA SNHG1的潛在靶基因。生物信息學(xué)研究顯示lncRNA SNHG1和miR-330存在13個(gè)互補(bǔ)堿基(圖1),在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)野生型lncRNA SNHG1(SNHG1-WT)、突變型lncRNA SNHG1(SNHG1-MT)、野生型miR-330(miR-330-WT)和缺失miR-330的突變型miR-330(miR-330-MT)。熒光素報(bào)告酶報(bào)告載體購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。分別將SNHG1-WT、SNHG1-MT、miR-330-WT、miR-330-MT熒光素酶報(bào)告載體通過(guò)lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染到GEM耐藥的PANC1細(xì)胞中。其中, lncRNA SNHG1以及miR-330中野生型與突變型序列分別在結(jié)合位點(diǎn)處納入pMIR報(bào)告熒光素酶含有SpeI和HindⅢ載體位點(diǎn)(Ambion,USA)。對(duì)于未改變結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA SNHG1以及miR-330指定為SNHG1-WT和miR-330-WT,結(jié)合位點(diǎn)改變的lncRNA SNHG1以及miR-330指定為SNHG1-MT和miR-330-MT。然后,將lncRNA SNHG1以及miR-330分別轉(zhuǎn)染GEM耐藥PANC1細(xì)胞24 h,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega,美國(guó))檢測(cè)熒光素酶活性。

    圖1 lncRNA SNHG1與miR-330相互作用的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)信息

    八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    一、胰腺癌組織和各組GEM耐藥PANC1細(xì)胞lncRNA SNHG1和miR-330表達(dá)水平

    胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA SNHG1的表達(dá)量分別為6.54±0.72、5.46±0.54,癌組織顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.00,P<0.01)。胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織miR-330的表達(dá)量分別為2.54±1.85和3.01±1.23,癌組織明顯低于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.73,P<0.05)。

    si-NC耐藥組、si-SNHG1耐藥組、單純耐藥組細(xì)胞的lncRNA SNHG1表達(dá)量分別為2.43±0.10、0.26±0.08、3.25±0.31,si-SNHG1耐藥組顯著低于其他兩組(t=1.21,P<0.05),表明抑制lncRNA SNHG1表達(dá)的耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。si-NC耐藥組、si-SNHG1耐藥組、單純耐藥組細(xì)胞miR-330的表達(dá)量分別為0.47±0.13、1.84±0.12、0.38±0.21,si-SNHG1耐藥組顯著高于其他兩組,提示抑制SNHG1表達(dá)能上調(diào)耐藥細(xì)胞miR-330的表達(dá)。

    二、抑制SNHG1表達(dá)對(duì)GEM耐藥PANC1細(xì)胞增殖活性及侵襲、遷移能力的影響

    與si-NC耐藥組、單純耐藥組比較,si-SNHG1耐藥組細(xì)胞A450值、Ki67熒光強(qiáng)度、穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移距離均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而si-NC耐藥組與單純耐藥組細(xì)胞的上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,表1)。提示抑制SNHG1表達(dá)能夠抑制GEM耐藥PANC1細(xì)胞的增殖活性及侵襲、遷移能力。

    圖2 單純耐藥組(1)、si-NC耐藥組(2)、si-SNHG1耐藥組(3)細(xì)胞Ki67熒光強(qiáng)度

    表1 單純耐藥組、si-NC耐藥組及si-SNHG1耐藥組細(xì)胞增殖活性、Ki67強(qiáng)度、侵襲及遷移能力的比較

    三、lncRNA SNHG1靶向調(diào)控miR-330

    si-SNHG1耐藥組細(xì)胞的miR-330-WT熒光素酶活性較si-NC耐藥組顯著升高(3.21±0.22比1.03±0.18,t=2.976,P<0.05),而si-SNHG1耐藥組與si-NC耐藥組細(xì)胞的miR-330-MT熒光素酶活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.03±0.28比0.98±0.24,t=1.47,P>0.05);miR-330-inh耐藥組細(xì)胞的SNHG1-WT熒光素酶活性顯著低于NC-inh耐藥組(0.97±0.21比2.32±0.17,t=2.14,P<0.05),而miR-330-inh耐藥組與NC-inh耐藥組細(xì)胞的SNHG1-MT熒光素酶活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.99±0.14比1.05±0.14,t=1.01,P>0.05),提示lncRNA SNHG1和miR-330之間可以靶向結(jié)合。

    四、抑制miR-330表達(dá)可逆轉(zhuǎn)si-SNHG1對(duì)GEM耐藥PANC1細(xì)胞抑制增殖以及侵襲遷移的作用

    NC-inh+si-SNHG1組細(xì)胞A450值、Ki67熒光強(qiáng)度、穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移距離較NC-inh+si-NC組均明顯降低,而miR-330-inh+si-SNHG1組較NC-inh+si-SNHG1組均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05,表2),提示抑制miR-330表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)由于SNHG1低表達(dá)抑制的GEM耐藥PANC1細(xì)胞的增殖活性及侵襲、遷移能力。

    表2 NC-inh+si-NC、NC-inh+si-SNHG1組及miR-330-inh+si-SNHG1組的細(xì)胞活性、Ki67熒光強(qiáng)度、侵襲及遷移能力比較

    討 論

    lncRNA是一種“新型”的非編碼RNA,其長(zhǎng)度在200~2 000個(gè)核苷酸序列。lncRNA并不能編碼蛋白故往往被認(rèn)為是一種翻譯過(guò)程中的“噪音”而未受到重視。然而,現(xiàn)有報(bào)道證明lncRNA通過(guò)多種作用機(jī)制參與腫瘤的惡性進(jìn)展以及化療藥物耐藥[15],尤其參與胰腺癌GEM耐藥的作用[16]。lncRNA SNHG1作為原癌基因廣泛參與多種癌癥的病理生理過(guò)程,如結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌及骨肉瘤等[17]。本研究結(jié)果顯示,SNHG1首先在胰腺癌腫瘤組織中高表達(dá),而低表達(dá)SNHG1可體外抑制胰腺癌PANC1 GEM耐藥細(xì)胞株的細(xì)胞增殖活性以及侵襲遷移,這種作用是通過(guò)靶向調(diào)控SNHG1下游的miR-330實(shí)現(xiàn)的。

    內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制。ceRNA尤其是在lncRNA參與癌癥細(xì)胞化療藥物耐藥中扮演著重要的角色。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HCP5通過(guò)吸附miR-214-3p釋放其對(duì)于HDGF靶向作用從而調(diào)節(jié)胰腺癌GEM耐藥性。Xu等[19]證明,lncRNA DLEU2L可以靶向調(diào)控miR-210-3p/乳腺癌易感基因2信號(hào)軸抑制胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM的耐藥性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在GEM耐藥的PANC1細(xì)胞中SNHG1表達(dá)明顯升高,抑制SNHG1后GEM耐藥的PANC1細(xì)胞增殖活性以及侵襲遷移能力明顯降低。同時(shí),低表達(dá)SNHG1后可以靶向調(diào)控GEM耐藥PANC1細(xì)胞中miR-330的表達(dá)。而miR-330往往作為一種抑癌因子以及ceRNA的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)參與多種癌癥的惡性進(jìn)展。miR-330作為ceRNA的調(diào)控因子參與circHIPK3調(diào)控RAS關(guān)聯(lián)域家族的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)GEM耐藥[20]。本研究結(jié)果顯示低表達(dá)miR-330能夠使SNHG1-WT的表達(dá)升高,而對(duì)于SNHG1-MT并未有影響,說(shuō)明miR-330是SNHG1的靶基因。以上的結(jié)果說(shuō)明SNHG1可靶向調(diào)控miR-330的表達(dá),參與胰腺癌細(xì)胞的GEM耐藥。

    GEM耐藥PANC1細(xì)胞共轉(zhuǎn)染si-SNHG1以及miR-330 inhibitor可逆轉(zhuǎn)由si-SNHG1誘導(dǎo)的GEM耐藥PANC1細(xì)胞增殖活性以及侵襲能力降低。筆者假設(shè)這種作用可能是由于SNHG1靶向結(jié)合miR-330后釋放了miR-330對(duì)下游因子的吸附作用,增強(qiáng)了SNHG1對(duì)于胰腺癌GEM耐藥細(xì)胞活性作用,為SNHG1/miR-330信號(hào)軸成為胰腺癌GEM耐藥的潛在治療靶點(diǎn)提供理論支持。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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