論硝基呋喃類抗生素衍生成功的條件

馬明玲

摘要：硝基呋喃類藥物因代謝迅速，通過測定母體化合物的方法測定其殘留是不合適的。又因其代謝物在動物的可食用組織中長期殘留，所以人類才要加以控制，檢測。因此，硝基呋喃類藥物衍生化就成為重中之重，其衍生化又有一定的困難性，所以通過加衍生藥物、衍生條件、調(diào)PH值、離心力等方面論述其成功的關鍵信息，以利于質(zhì)譜檢測。

關鍵詞：轉移、避光、PH值、渦旋、離心、氮吹萃取、質(zhì)譜

Because of rapid metabolism，it is not suitable to determine the residue of nitrofurans by the method of determining the parent compound.And because of its metabolites in the edible tissue of animals for a long time，so human control，detection.Therefore，nitroflavan drugs biochemistry has become a top priority，because of its biochemistry is difficult to control，so by adding raw drugs，raw conditions，cycle name，centrifugal force and other aspects to discuss the key information of its success，in order to facilitate mass spectrometry detection.

正文

硝基呋喃類藥物在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中應用廣泛，獸類應用尤其眾多，其在動物可食用組織中長期殘留，對人體有極其重要的影響，所以國家對其一直很重視，對獸殘要求和控制很嚴格，也加強了檢測的力度，因此企事業(yè)單位也開始檢測獸殘和農(nóng)殘，并且這以后會成為社會檢測的主流。

硝基呋喃類抗生素代謝物的分子量小，不利于質(zhì)譜檢測，又因其離子化效率很小（很難離子化），無法達到所需要的檢測靈敏度，再加上其代謝物上機檢測時在色譜上保留、分離不好，所以要有更穩(wěn)定的物質(zhì)來代替它，因此硝基呋喃類抗生素衍生化應運而生，衍生化后改善其色譜行為，利于質(zhì)譜檢測，所以硝基呋喃類抗生素進行衍生化的效果和程度就成為其檢測的關鍵點，也就是各種食用物品中有無此物質(zhì)的控制點。

要檢測硝基呋喃類一般外標有四個分別是3-氨基-5-嗎啉甲基-2-噁唑烷酮（AMOZ）、3-氨基-2-噁唑烷酮（AOZ）、鹽酸氨基脲（SEM·HCL）、1-氨基海因鹽酸鹽（AHD）以及四個內(nèi)標3-氨基-5-嗎啉甲基-2-噁唑烷酮-D5（AMOZ-D5）3-氨基-2-噁唑烷酮-D5（AOZ-D5）、氨基脲-13C，15N2鹽酸鹽（SEM·HCL-13C，15N2）、1-氨基-2-乙內(nèi)酰脲-13C3（AHD-13C3），這八種物質(zhì)都冷凍保存在甲醇中，一般情況是比較穩(wěn)定的，但檢測過程中狀況復雜就會使結果不穩(wěn)定，所以就要衍生成比較穩(wěn)定的物質(zhì)，使檢測效果達到最佳。

為探索硝基呋喃類抗生素衍生化的條件，參考國標GB/T21167--2007及一些檢測機構的經(jīng)驗，連續(xù)幾天不斷對其衍生條件進行實驗，特總結出以下幾點。

1、對于不熟練的實驗人員，先從標準品的配制和衍生開始。將標準品先從安瓿瓶中轉移出來，此轉移過程一定要準確迅速，而后根據(jù)其濃度配制成濃度為100ng/ml和10ng/ml的兩種標準混合溶液（注意要存放在棕色玻璃瓶中放在冰箱冷凍層），供衍生化使用。

在進行衍生之前要先配制1mol/L的鹽酸，做實驗當天要先配制50mmol/L的衍生化藥物鄰硝基苯甲醛。做好準備后，就開始標準品的衍生化，為方便標準品梯度的建立，可以參考國標GB/T21167--2007中的梯度，分別從100ng/ml和10ng/ml的兩種標準混合溶液中準確移取0.20ml、0.10ml和0.050ml至干凈的50ml玻璃離心管中，再分別加入100ng/ml的內(nèi)標混合溶液0.10ml，之后再分別加入0.50ml1mol/L的鹽酸、200ul50mmol/L鄰硝基苯甲醛（2-NBA）溶液，此整個過程要迅速，時間越短越好，在旋渦混勻器上快速混合60秒。

2、對于上述處理好的溶液離心管迅速放入37℃水浴避光振蕩過夜16小時以上，此環(huán)節(jié)避光、溫度、振蕩三者缺一不可，有光條件下對衍生影響極大，所以注意避光這個條件，以上加入了鹽酸，所以酸性環(huán)境也是衍生的關鍵點，這些條件都是必不可少的，都要認真對待。

3、衍生化16小時后，就要調(diào)節(jié)PH值（用5.5--9.0的PH試紙控制PH值比較合適），這是非常關鍵的環(huán)節(jié)，有兩個方案：其一 加入4ml磷酸氫二鉀緩沖溶液，一般再加入0.2ml左右磷酸氫二鉀緩沖溶液就可以調(diào)節(jié)PH值在7.0--7.5之間，暫時顏色靠近7.5的PH值比較符合衍生后溶液穩(wěn)定性的標準。其二加入4ml磷酸氫二鉀緩沖溶液增加衍生物的穩(wěn)定性，再用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值在7.0--7.5之間，PH試紙的顏色同其一中的顏色標準。

4、調(diào)節(jié)好PH值后，需要加入乙酸乙酯提取，此過程中需要渦旋和離心，這個混合過程也很重要，使溶液中有用的衍生物充分溶入乙酸乙酯中，衍生化后所有有用衍生物是否完全提取出來，此過程萬分重要。不管提取幾次，渦旋一定要達到60秒，離心建議10000轉每分鐘離心5分鐘，將乙酸乙酯分離出來分別放在新的離心管中，再使用氮吹萃取裝置吹干，用乙腈：0.1%甲酸水（3：7）溶解，渦旋充分溶解后分別過0.22um的水系和有機系濾膜，放入進樣小瓶中供質(zhì)譜檢測使用。

5、質(zhì)譜檢測過程也非常關鍵，一天的衍生物盡量當天檢測，要有溶劑空白，開始多跑幾針讓儀器多平衡一會，穩(wěn)定后測得結果就會比較準確，出峰時間也比較一致，根據(jù)儀器的特點制定合理的方法，這樣跑出來的結果就會很好看，所以衍生成功后，后期檢測也是關鍵，一定讓前處理和儀器都是最佳，就會出來我們想要的結果。

實驗過程中可能會出現(xiàn)操作的困難點，這些點都需要多加練習，更需要一些小技巧來應對，若沒有這些小技巧，輕則影響檢測數(shù)據(jù)的準確性，重則成影響衍生是否成功的條件，所以一定要加以重視這些關鍵困難點，這也是我反復試驗中總結出來的，特加以論述如下：

1、調(diào)PH值的過程中一定要一邊加調(diào)節(jié)試劑一邊攪拌，混勻后用玻璃棒蘸取少許在PH試紙上加以測試PH值，直到達到自己想要的結果，加了多少一定要心中有數(shù)，可以用移液槍加從多到少，記下加的準確數(shù)值，以便于下次實驗應用，因為實驗在工廠中就相當于生產(chǎn)，進行的是多批量的實驗，一切數(shù)據(jù)和結果都是從固定的量中得到的，也便于比較和篩選，所以每次實驗的內(nèi)外標的加量和衍生試劑的加量都是相同的，只不過由于操作和儀器狀態(tài)有細微差別而已，所以這個所加調(diào)節(jié)試劑的量也差別不大，記錄下來，一來節(jié)省以后實驗中調(diào)節(jié)PH值的時間，二來減少測試過程中試劑量的減少。

2、衍生試劑所加的量，很多資料上都不同，但國標上的量有點少，所以要加點量，但并不代表無限加量，我覺得加200ul50mmol/L鄰硝基苯甲醛（2-NBA）溶液配我以上說的加內(nèi)標和外標的量已足夠了。一則加多了，對于精密儀器的質(zhì)譜也會影響結果;二則加少了，對衍生結果也有影響，對于不太熟練的人員還是這個量比較合適。

3、移液槍的使用也很關鍵，移液之前，要保證移液槍、槍頭和液體處于相同溫度。吸取液體時，四指并攏握住移液槍上部，用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕，用大拇指將按鈕按下至第一停點，移液槍保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下2-3毫米，然后慢慢松開按鈕回原點，吸上液體，并停留1～2秒鐘（粘性大的溶液可加長停留時間），將吸頭沿器壁滑出容器，排液時吸頭接觸傾斜的器壁，接著將按鈕按至第一停點排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點吹出殘余的液體。最后松開按鈕。在吸液之前，可以先吸放幾次液體以潤濕吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度與水不同的液體時）。最后按下除吸頭推桿，將吸頭推入廢物缸。一定按照這個步驟準確操作，保證吸液的準確性，從而達到實驗前處理過程數(shù)據(jù)的精確度。

4、提取乙酸乙酯的過程也很關鍵，因為分層無特殊顏色標注，又是液體間的分離，所以有一定的難度，可以選擇提取出部分液體，這種方法比較簡單，易操作;也可以去全部提取出來，利用吸管一點點吸出來，洗的過程中，注意吸管中的液體分層情況，如果有分層就把下層放回離心管中，直到觀察離心管中無分層現(xiàn)象就可以全部提取出來了。

以上幾點是我實驗過程中總結的要點和注意事項，雖說這個衍生過程不是很難的，但也困擾了一部分實驗人員，特意總結出來，論述整個過程的條件和困難點，以使這個實驗大眾化，讓硝基呋喃類化合物的檢測更加好操作，檢測更加準確，這樣就能保證大眾的健康。

參考文獻

[1]國標GB/T21167--2007

[2]移液槍的使用說明書

感謝

在此特別感謝某蜂蜜生產(chǎn)廠家提供的實驗條件和儀器設備，以及在實驗過程中給予指導的老師及同仁們，把技術傳授給我，才有機會寫出來惠及大眾;感謝給與支持的家人們，為我提供寫這篇文章的所有條件，讓我有時間和精力把它完成并最終有所收獲。非常感謝！