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    虎杖苷對新生小鼠高氧肺損傷的保護(hù)作用研究Δ

    2021-10-25 12:04:48王帥道袁東燁何靚男
    關(guān)鍵詞:高氧虎杖新生

    安 敏,王帥道,袁東燁,何靚男

    (電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院·綿陽市中心醫(yī)院燒傷整形外科,四川 綿陽 621000)

    虎杖苷是植物虎杖的提取物,主要作用包括鎮(zhèn)咳、去痰、平喘、抗菌、清除自由基、調(diào)節(jié)血脂和降低膽固醇等[1-2]。本研究探討了虎杖苷通過SPOCK2表達(dá)對新生小鼠高氧肺損傷的保護(hù)作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器:SCR20B型冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司);Mx3000P型Real time PCR儀器(美國Agilent公司);DF-23B型凝膠掃描系統(tǒng)(英國UVP公司);ABI9700型PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司);UV-1206型分光光度計(jì)(日本SHIMODZU公司);GDS7600型水平式電泳儀(北京東方儀器廠)。

    1.1.2 藥品:虎杖苷購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,用DMSO溶液充分溶解,再稀釋成所需的濃度。

    1.1.3 試劑:小鼠正常肺上皮細(xì)胞mlE-12(美國ATCC公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Sigma公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自上海碧云天生物科技研究所;實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購自大連寶生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞處理與分組:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠正常肺上皮細(xì)胞mlE-12,置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中,當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%~90%時,用傳代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常培養(yǎng)的mlE-12細(xì)胞作為對照組;利用高氧刺激mlE-12細(xì)胞作為高氧組。用50、100和150 μmol/ml虎杖苷處理mlE-12細(xì)胞,再用高氧刺激,作為高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組。將pcDNA、pcDNA-SPOCK2轉(zhuǎn)染至mlE-12細(xì)胞,再用高氧刺激細(xì)胞,作為高氧+pcDNA組、高氧+pcDNA-SPOCK2組。將si-NC、si-SPOCK2轉(zhuǎn)染至mlE-12細(xì)胞,高氧刺激后,再用高劑量(150 μmol/ml)虎杖苷處理細(xì)胞,作為高氧+高劑量+si-NC組、高氧+高劑量+si-SPOCK2組。

    1.2.2 ELISA法檢測細(xì)胞炎癥因子水平:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,提取上清液,ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6,實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒的詳細(xì)說明書進(jìn)行。

    1.2.3 化學(xué)法檢測細(xì)胞MDA含量和SOD活性:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,提取上清液,MDA含量采用改良的硫代巴比妥酸法測定,SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定,詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞SPOCK2 mRNA表達(dá):各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,提取總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR,每個樣品設(shè)3個重復(fù),循環(huán)條件為95 ℃、5 min,95 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 s,共40個循環(huán);60 ℃延長5 min。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。SPOCK2以GAPDH為內(nèi)參,SPOCK2上游引物為5′-CCATCGG TTGGATGTTCTCT-3′,下游引物為5′-TGTAGGTGTCGCA GGAGTTG-3′;GAPDH上游引物為5′-GCCCAGCAAGGATA CTGAGA-3′,下游引物為5′-GGGTGCAGCGAACTTTATTG-3′;引物由上海生工生物工程公司合成。

    1.2.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測SPOCK2 蛋白質(zhì)表達(dá):各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白,使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對提取的蛋白進(jìn)行定量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳并分離蛋白,將分離的蛋白在轉(zhuǎn)至PVDF膜上,于封閉液中封閉2 h。TBST洗滌后加入相應(yīng)一抗,SPOCK2一抗(1∶1 000稀釋),4 ℃過夜孵育,再加入1∶2 000稀釋的二抗,室溫(25 ℃)孵育2 h,TBST洗滌后,加入ECL試劑進(jìn)行顯色,于暗室顯影、定影,使用Image J軟件對圖像進(jìn)行分析,將β-actin作為內(nèi)參,計(jì)算各組蛋白表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

    與對照組比較,高氧組細(xì)胞的MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高氧組比較,高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞的MDA含量顯著降低,SOD活性顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Tab 1 Effect of polydatin on oxidative stress of hyperoxic lung cells in neonatal n=9)

    2.2 虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞炎癥因子的影響

    與對照組比較,高氧組細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高氧組比較,高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表2 虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞炎癥因子的影響Tab 2 Effect of polydatin on inflammatory factors of hyperoxic lung cells in neonatal n=9,pg/ml)

    2.3 虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞SPOCK2表達(dá)的影響

    與對照組比較,高氧組細(xì)胞的SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高氧組比較,高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞的SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、表3。

    圖1 相關(guān)蛋白表達(dá)圖Fig 1 Diagram of expression of related protein

    表3 虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞SPOCK2表達(dá)的影響Tab 3 Effect of polydatin on the expression of SPOCK2 of hyperoxic lung cells in neonatal n=9)

    2.4 SPOCK2過表達(dá)對新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響

    與高氧+pcDNA組比較,高氧+pcDNA-SPOCK2細(xì)胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低,SOD活性顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

    表4 SPOCK2過表達(dá)對新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響Tab 4 Effects of the over-expression of SPOCK2 on hyperoxia lung cell damage in neonatal mice n=9)

    2.5 抑制SPOCK2表達(dá)對虎杖苷用于新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響

    與高氧+高劑量+si-NC組比較,高氧+高劑量+si-SPOCK2組細(xì)胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,SOD活性顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表5。

    表5 抑制SPOCK2表達(dá)對虎杖苷用于新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的影響Tab 5 Effects of the inhibition of expression of SPOCK2 on hyperoxia lung cell damage in neonatal mice n=9)

    3 討論

    虎杖苷是從中藥虎杖的干燥根莖中提取的第4種單體,屬于芪類化合物,虎杖苷對肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定的治療效果,可起到保護(hù)肺部的作用。有研究結(jié)果表明,虎杖苷可以減輕肺部的病理損傷情況,抑制大鼠肺部氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制大鼠肺炎癥介質(zhì)釋放[3]。張新彧等[4]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),虎杖苷對百草枯中毒造成的大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用。曹媛媛等[5]的研究結(jié)果認(rèn)為,虎杖苷通過上調(diào)線粒體自噬,可以顯著改善氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷。鄧加雄等[2]的研究結(jié)果顯示,虎杖苷通過激活SIRT3,可以顯著改善脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮線粒體損傷。曹堃[6]的研究結(jié)果顯示,虎杖苷能夠有效緩解電離輻射誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理改變,減輕肺水腫?;⒄溶者€可以減少小鼠炎癥細(xì)胞因子的釋放,發(fā)揮放射性肺損傷防護(hù)作用。王雷琛等[7]的研究結(jié)果顯示,虎杖苷可降低肺MDA含量,提高SOD活性,抑制肺組織中TNF-α、IL-6水平,從而減輕小鼠在高原缺氧環(huán)境下的肺組織損傷。本研究結(jié)果表明,與對照組比較,高氧組細(xì)胞MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低;與高氧組比較,高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞MDA含量顯著降低,SOD活性顯著升高。與對照組比較,高氧組細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高;與高氧組比較,高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低。

    SPOCK2表達(dá)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),有研究報(bào)道,SPOCK2基因與支氣管肺發(fā)育不良具有非常重要的關(guān)系[8-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,高氧組細(xì)胞SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低;與高氧組比較,高氧+低劑量組、高氧+中劑量組和高氧+高劑量組細(xì)胞SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。陳濤等[11]的研究結(jié)果表明,與對照組比較,高氧組大鼠肺組織中SPOCK2 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低。張媛[12]的研究結(jié)果表明,LncRNANANCI-NKX2.1信號通路下調(diào)可能參與高氧誘導(dǎo)新生小鼠肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

    本研究結(jié)果表明,與高氧+高劑量+si-NC組比較,高氧+高劑量+si-SPOCK2組細(xì)胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,SOD活性顯著降低。抑制SPOCK2表達(dá)逆轉(zhuǎn)了虎杖苷對新生小鼠高氧肺細(xì)胞損傷的抑制作用,使氧化應(yīng)激和炎癥因子水平升高。說明虎杖苷通過上調(diào)SPOCK2表達(dá),抑制新生小鼠高氧肺損傷。類似研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺通過ERS途徑減輕高氧誘導(dǎo)新生大鼠肺組織水腫及炎癥反應(yīng)[13]。朱曉丹[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇通過降低活性氧和p53的表達(dá),減輕高氧誘導(dǎo)的新生大鼠肺組織凋亡。

    綜上所述,虎杖苷通過上調(diào)SPOCK2表達(dá)抑制新生小鼠高氧肺損傷,對肺部具有保護(hù)作用。

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