藥物活性物質(zhì)與雜質(zhì)無需進行第二次檢測

文/ Stefan Vossk?tter 博士

制藥行業(yè)必須對雜質(zhì)進行鑒別、測定和歸類——由于HPLC 紫外檢測器中的濃度和條件相差很大，一次測量通常無法檢測完所有項目，因此需要進行兩次測量：一次用于確定活性物質(zhì)，另一次用于檢測雜質(zhì)。本文將介紹一種僅需一次測量便可對藥物活性成分和雜質(zhì)完成鑒定的方法。

在不同的生產(chǎn)方式下生產(chǎn)同種藥物活性成分，會產(chǎn)生不同規(guī)模和類型的雜質(zhì)。在某些情況下，這些污染物會使藥物喪失其原本的治療效果，甚至引發(fā)致癌風(fēng)險或?qū)θ梭w造成嚴(yán)重?fù)p害。

放眼全球新聞，會不時看到報道這樣的案例，制藥生產(chǎn)廠搬遷后出現(xiàn)污染，有人因其產(chǎn)生的副作用而患上并發(fā)癥甚至出現(xiàn)人員死亡的情況。由此可以看出，現(xiàn)有配方的質(zhì)量控制固然十分重要，但也不能忽略新制劑的開發(fā)階段。這一階段必須對污染物進行歸類和測定，在篩選潛在活性物質(zhì)時就需要檢測其副產(chǎn)物并對目標(biāo)物質(zhì)進行分離。

在所有的工作流程中，分析操作占據(jù)了很大一部分時間，這是一個不容忽視的因素。如果能夠?qū)⒎治鏊俣燃涌?，便可以檢測出更多的潛在活性成分，更快地開發(fā)出新制劑以及加快生產(chǎn)過程。下面將介紹一些新的解決方案和方法。

通過HPLC 和UV 檢測污染物

人們通常采用HPLC 方法測量雜質(zhì)和活性物質(zhì)，但測出的濃度差異很大，如表1 所示。歐洲藥品管理局的ICH 指南為新藥的報告、鑒定和定性設(shè)立了各種極限值。以攝入量為例，如果每天的攝入量不超過2 g，那么其極限值為0.10%；如果每天的攝入量超過了2 g，則極限值為0.05%[1]。這一測量過程通常需要采用不同的方法分別對污染物和藥物進行測定。

借助Shimadzu 的新型光電二極管陣列檢測器SPD-M40，藥物活性成分和雜質(zhì)的測定變得更加容易。新設(shè)計完全消除了雜散光，擴展了線性范圍，提高了靈敏度并降低了信噪比。

使用酮洛芬制劑檢驗線性度：制備0.5～800 mg/l 的標(biāo)準(zhǔn)溶液并進行測量，分析條件如表2 所示。圖1 是將各種測量值疊加在一起，圖2 中的面積與濃度對應(yīng)，形成校準(zhǔn)線。盡管校準(zhǔn)范圍很廣，但決定系數(shù)R2也達到了0.9998。

圖1 0.5～800 mg/l 范圍內(nèi)的酮洛芬校準(zhǔn)的色譜圖

圖2 R2值為0.9998 的酮洛芬校準(zhǔn)的校準(zhǔn)度

當(dāng)制備700 mg/l 的酮洛芬標(biāo)準(zhǔn)液時，更容易看出其在測定雜質(zhì)時的優(yōu)勢（如圖3 所示）。即使污染小于主峰面積的0.1%，也可以輕松鑒別，并且得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差依然很小。濃度為0.126%的雜質(zhì)1 是唯一需要鑒別的，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.598% RSD。

圖3 酮洛芬700 mg/l 標(biāo)準(zhǔn)液的重疊色譜圖

無需第二次測量

由于雜質(zhì)和主要活性成分可以在色譜圖中確定，因此無需進行第二次測量。這樣可節(jié)省約一半的時間。如果校準(zhǔn)濃度范圍未達標(biāo)準(zhǔn)，可以使用LabSolutions LC 的功能軟件i-DReC 對其進行擴展。

如果光譜中的峰易于辨別，則只有UV 光譜的強度會隨注入濃度發(fā)生變化，而不會隨過程發(fā)生變化。在正常情況下，為了提高檢測限，會對吸光度最高的波長進行檢測。如果檢測器進入飽和區(qū)域，則可以看到校準(zhǔn)曲線呈逐漸變平之勢。從這點之后，便會脫離圖4 中通過實例展示的非線性區(qū)域（藍色區(qū)域）。

表1：ICH 指南中描述的新藥物極限值[1] (圖片:Shimadzu)

表2：HPLC 測量的分析參數(shù)(圖片:Shimadzu)

借助i-DReC 功能，會自動將目標(biāo)化合物的第二大UV 光譜峰作為目標(biāo)，其強度較低，檢測器不再處于飽和狀態(tài)，而是處于線性范圍內(nèi)。由于過程沒有發(fā)生變化，因此兩個點的強度之比也便一目了然。該系數(shù)可以在兩個所用波長之間進行換算，同時校準(zhǔn)線可以擴展到更高的濃度范圍。

改善后的雜質(zhì)檢出限

操作結(jié)果如圖4 所示，校準(zhǔn)線直到高濃度下都呈線性相關(guān)，系數(shù)R 為0.9996726。如果將其用于典型的活性藥物成分（如圖5所示），注入濃度還可以高出更多。故可以明顯地提高雜質(zhì)的檢測極限。表4 總結(jié)了這一測量的結(jié)果：雜質(zhì)小于主峰的0.5%時仍能很好地進行測量，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差%RSD <0.9。

圖4 使用和不使用i-DreC 的校準(zhǔn)

圖5 含雜質(zhì)的活性成分的色譜圖

經(jīng)常會出現(xiàn)兩種物質(zhì)沒有基線分離但卻需要定量的情況，如果色譜圖非常復(fù)雜，換來的可能只是時間的浪費，因為得不到想要的結(jié)果。借助功能軟件i-PDeA構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型，可以分離出兩種共洗脫物質(zhì)。但也有一個前提，它們的UV 光譜必須不同，為此，人們需要借助單個物質(zhì)的不同UV光譜。圖6 通過測量二氟二苯甲酮（DFBP）和乙烯基吡咯烷酮（VP）進行了實例展示，由結(jié)果可知，兩個獨立的檢測器通道具有各自分離的峰。也就是說，可以借助功能軟件i-PDeA 對其進行定量分析。

圖6 使用i-PdeA 對兩個共洗脫峰進行數(shù)學(xué)分離

表4：借助i-DreC 的分析結(jié)果(圖片:Shimadzu)

新的應(yīng)用領(lǐng)域

這些特性的結(jié)合在具有紫外線檢測功能的HPLC 中開創(chuàng)了新的應(yīng)用領(lǐng)域，樣品的測量次數(shù)至此也縮減到了一次。由于SPD-M40 檢測器與軟件功能由經(jīng)過驗證的、滿足規(guī)范環(huán)境（如21 CFR Part 11）和數(shù)據(jù)完整性要求的軟件進行控制，因此這些功能也滿足法規(guī)的相關(guān)要求。

總結(jié)

新的技術(shù)和功能為優(yōu)化現(xiàn)有流程和節(jié)省資源提供了巨大潛力，憑借其擴展的線性度、很低的信噪比和全新的軟件功能（如LabSolution LC 的i-DReC），用戶僅需一次測量便能確定雜質(zhì)和活性物質(zhì)。除了節(jié)省時間的優(yōu)勢外，還提供了另一個可能性，即可將污染結(jié)果與所測樣品進行比對。其他功能（如峰純度）可用于確定峰的光譜純度，從而排除所有吸收紫外線雜質(zhì)的干擾。由于控制軟件符合21 CFR Part 11 的要求，因此在監(jiān)管嚴(yán)格的領(lǐng)域中也可使用這些功能。