輔助能量物質(zhì)與谷胱甘肽協(xié)同作用促進(jìn)環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵生產(chǎn)

李志剛，張朝輝，譚 海，盧南巡，張中華，常景玲,

（1.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是生命體中的第二信使，對細(xì)胞的糖、蛋白質(zhì)以及核苷酸等物質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[1?2]。作為藥物具有提高心肌細(xì)胞收縮力以及提高機(jī)體抗病毒、免疫力的作用，主要用于心血管疾病的治療；作為飼料添加劑廣泛用于畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)中，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。

在微生物細(xì)胞中，cAMP以ATP為底物直接環(huán)化形成，強(qiáng)化能量代謝和ATP合成有利于產(chǎn)物的快速持續(xù)積累。以檸檬酸鹽為代表的輔助能量物質(zhì)，一方面能夠直接作為碳源為細(xì)胞提供能量，一方面調(diào)節(jié)糖酵解與三羧酸循環(huán)間的碳流分配，有利于核苷酸的形成，廣泛用于各類高耗能產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)中[4?7]。Wang等[8]利用Candida utilis. CCTCC 209298發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸時(shí)添加檸檬酸鈉，細(xì)胞能量代謝得到強(qiáng)化，與對照相比，產(chǎn)物濃度提高了27.5%。Chen等[9]利用檸檬酸鈉抑制糖酵解途徑，使更多碳流分配到磷酸戊糖途徑顯著提高了cAMP產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。Xia等[10]通過Strptomyces albulusPD-1發(fā)酵合成聚賴氨酸時(shí)添加檸檬酸，顯著提高了產(chǎn)物濃度。但是，在上述報(bào)道中，檸檬酸鹽添加導(dǎo)致發(fā)酵后期產(chǎn)物合成停滯或發(fā)酵周期不同程度縮短的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)了利用檸檬酸鈉促進(jìn)cAMP合成的發(fā)酵工藝，發(fā)酵后期也存在產(chǎn)物合成停滯的現(xiàn)象[11]。

活性氧（ROS）是由于電子呼吸鏈運(yùn)行時(shí)出現(xiàn)電子泄漏而產(chǎn)生的，幾乎所有好氧型微生物細(xì)胞內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生[12]。由于細(xì)胞具有一定的抗氧化能力，少量ROS產(chǎn)生不會(huì)影響細(xì)胞正常代謝活動(dòng)。但是，細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平提高，電子呼吸鏈泄漏電子的量也會(huì)增加，導(dǎo)致更多ROS產(chǎn)生。如果細(xì)胞長時(shí)間處于高濃度ROS條件下，細(xì)胞膜、酶蛋白以及遺傳物質(zhì)就會(huì)造成損傷，影響細(xì)胞活性、生長以及產(chǎn)物的合成[13?14]。

添加輔助能量物質(zhì)導(dǎo)致cAMP發(fā)酵后期產(chǎn)物合成停滯，限制了產(chǎn)物的合成以及產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。針對這一問題，本文對分別添加檸檬酸鈉和丙酮酸鈉的cAMP發(fā)酵過程的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、菌體活性、能量代謝以及活性氧等的變化規(guī)律進(jìn)行研究，闡明導(dǎo)致產(chǎn)物合成停滯的原因，并提出了耦合添加輔助能量物質(zhì)和谷胱甘肽的發(fā)酵工藝，為進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)物積累以及提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節(jié)桿菌Arthrobactersp. CCTCC2013431 本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的；NADH、NAD+、AMP、ATP、cAMP、TAB（硫代巴比妥酸）、氯化碘硝基四氮唑（分析純）、NADH/NAD+與NADPH/NADP+測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AlamarBlue細(xì)菌活性檢測試劑盒、DHE-ROS活性氧檢測試劑盒 上海貝博生物科技公司；其他試劑均為分析純。

BIOTECH-7BG發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備有限公司；752N紫外分光光度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；F-280型熒光分光光度計(jì) 天津港東科技股份有限公司；VC150超聲波破碎儀 美國Sonics & Materials公司；Aglient 1260 Infinity液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Multiskan GO全波長讀數(shù)儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖50，K2HPO410，KH2PO410，尿素10，生物素0.005，CoCl20.01，蛋白胨5，次黃嘌呤2，調(diào)pH至7.2，121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[11]。發(fā)酵罐裝載5 L發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH7.4，當(dāng)pH降至6.8時(shí)維持不變。在發(fā)酵0、12、19、26、36、43、50、60、67和72 h進(jìn)行取樣，用于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)、關(guān)鍵酶活性、輔因子以及活性氧水平等的測定。檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和谷胱甘肽添加方式：發(fā)酵0 h添加到發(fā)酵液中，添加量分別為3、3和2 g/L，即添加后發(fā)酵液中濃度分別達(dá)到3、3和2 g/L。對照批次為不添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉和谷胱甘肽的發(fā)酵批次。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 菌體濃度測定 采用光密度法測定，發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)測定600 nm波長下吸光度，測定值乘以稀釋倍數(shù)即為菌體濃度OD600；菌體干重（DCW）通過關(guān)系式0.46×OD600計(jì)算得出[15]。

1.2.3.2 cAMP濃度測定 使用高效液相色譜進(jìn)行測定[16]，發(fā)酵液9000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm水相膜過濾待用。色譜柱為Lichrospher C18柱（300 mm×4.6 mm），進(jìn)樣量2 μL，有機(jī)相為甲醇，水相為磷酸三乙胺緩沖液，水相與有機(jī)相體積比70:30，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，波長254 nm。

1.2.3.3 CO2含量測定 尾氣中CO2含量由尾氣分析儀在線測定。

1.2.3.4 細(xì)胞活性測定 使用AlamarBlue細(xì)菌活性檢測試劑盒，通過熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞活性，激發(fā)波長540 nm，發(fā)射波長590 nm，具體操作方法見說明書。

1.2.3.5 胞內(nèi)輔因子含量測定 根據(jù)cAMP濃度和合成速率的變化規(guī)律，選擇26、36、50和60 h等能夠很好反映細(xì)胞生理狀態(tài)的樣品，對輔因子含量進(jìn)行測定，后面ROS、MDA水平以及呼吸鏈脫氫酶活性的測定同樣選擇這4個(gè)時(shí)間的樣品進(jìn)行測定。取5 mL發(fā)酵液在4 ℃條件下，9000 r/min離心10 min，所得菌體于液氮中處理2 min終止菌體代謝，保存于?70 ℃超低溫冰箱中待用。胞內(nèi)ATP、AMP使用HPLC進(jìn)行測定，菌體洗滌兩次，懸浮于5 mL PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲波破碎10 min，破碎液在低溫條件下12000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測。色譜柱為LaChrom C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm），有機(jī)相為乙腈，水相為NaH2PO4、Na2HPO4和四丁基溴化銨混合溶液，水相與乙腈體積比為92:8，流量0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長258 nm[16]。胞內(nèi)NADH與NAD+濃度采用試劑盒測定，具體方法見說明書；胞內(nèi)NADPH與NADP+濃度采用試劑盒測定，具體方法見說明書。

1.2.3.6 呼吸鏈脫氫酶活性 采用氯化碘硝基四氮唑（INT）顯色反應(yīng)測定[17]。

1.2.3.7 胞內(nèi)ROS、MDA含量測定 ROS通過DHEROS活性氧檢測試劑盒使用熒光分光光度計(jì)測定的熒光強(qiáng)度表示，具體方法見說明書；丙二醛（MDA）含量采用TBA法進(jìn)行測定，MDA與硫代巴比妥酸在高溫酸性條件下反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，測定532和600 nm波長下吸光度，計(jì)算得出，具體方法參照文獻(xiàn)[14,18]；蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定[19]。

1.2.3.8 生長速率和cAMP合成速率的計(jì)算

式中：RX和RP分別表示相臨取樣點(diǎn)間隔時(shí)間內(nèi)的平均細(xì)胞生長速率和cAMP合成速率，g/（L·h）；t1表示起始發(fā)酵時(shí)間，h；t2表示節(jié)點(diǎn)發(fā)酵時(shí)間，h；c（X）和c（P）分別表示細(xì)胞濃度（OD600）和cAMP濃度，g/L；參數(shù)取三次測定值得平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)定時(shí)取樣，測定發(fā)酵指標(biāo)時(shí)每個(gè)樣品測三次。用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加輔助能量物質(zhì)對cAMP發(fā)酵性能的影響

在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了分別添加檸檬酸鈉和丙酮酸鈉的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分析輔助能量物質(zhì)對cAMP發(fā)酵性能和細(xì)胞代謝的影響，探尋進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)物合成的方法。如圖1A所示，三個(gè)發(fā)酵批次的菌體終濃度相差不大，但是，與對照相比，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的菌體濃度在50 h前明顯處于較高水平，50 h后這兩批次的菌體生長停滯，而對照批次仍保持緩慢增長的狀態(tài)。圖1B結(jié)果顯示，三批次的菌體生長速率在24 h均達(dá)到最大值，此時(shí)添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉發(fā)酵批次比對照的分別提高了43.5%和60.2%，之后迅速下降，32 h至發(fā)酵結(jié)束一直低于對照批次，55 h后這兩批次的生長速率變?yōu)樨?fù)值。cAMP測定結(jié)果表明，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的cAMP濃度在50 h達(dá)到最大值3.68和4.02 g/L，分別比對照提高10.8%和21.1%，50 h后cAMP濃度不再增加，而對照仍保持不斷增加的狀態(tài)（圖1C）。另外，三批次的cAMP合成速率在32 h均達(dá)到最大值，與對照相比，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的合成速率分別提高了48.2%和61.6%，之后迅速下降，40 h后一直低于對照，55 h后合成速率變?yōu)樨?fù)值（圖1D）。這表明，輔助能量物質(zhì)能夠有效促進(jìn)菌體生長和cAMP合成，使菌體和產(chǎn)物濃度迅速積累，但在發(fā)酵后期細(xì)胞生長變的緩慢，產(chǎn)物合成開始停滯，前期的良好狀態(tài)不能繼續(xù)維持。相關(guān)報(bào)道表明，檸檬酸鹽和丙酮酸鹽[20?21]作為輔助能量物質(zhì)可以強(qiáng)化能量代謝，具有促進(jìn)菌體快速生長，促進(jìn)肌苷、聚賴氨酸及腺苷蛋氨酸等多種發(fā)酵產(chǎn)物積累的作用，但也存在發(fā)酵周期縮短以及后期產(chǎn)物合成停滯的現(xiàn)象[7?10]。因此，闡明輔助能量物質(zhì)導(dǎo)致發(fā)酵后期細(xì)胞生長緩慢、產(chǎn)物合成停滯的原因，對進(jìn)一步促進(jìn)這些產(chǎn)物合成與積累具有重要意義。

圖1 添加輔助能量物質(zhì)對細(xì)胞生長和cAMP發(fā)酵合成的影響Fig.1 Effects of auxiliary energy substances on cells growth and cAMP fermentation synthesis

尾氣中CO2含量反映了細(xì)胞呼吸代謝的強(qiáng)度，而利用AlamarBlue檢測試劑盒測得的熒光強(qiáng)度則反映了菌體細(xì)胞的活性。對上述發(fā)酵批次中菌體的呼吸強(qiáng)度和細(xì)胞活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。三個(gè)批次的CO2含量和細(xì)胞活性均呈現(xiàn)先升后降的變化規(guī)律，對照批次的變化趨勢相對平緩，而添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉發(fā)酵批次的CO2含量和細(xì)胞活性在發(fā)酵前期快速提升，明顯高于對照批次，在發(fā)酵36 h后迅速下降，在50 h后明顯低于對照批次。這表明輔助能量物質(zhì)在前期可以明顯提高細(xì)胞活性，但此狀態(tài)未能長時(shí)間維持，可能是細(xì)胞受到損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，進(jìn)而使菌體生長和產(chǎn)物合成能力弱化。

圖2 輔助能量物質(zhì)對細(xì)胞活性及呼吸代謝的影響Fig.2 Effects of auxiliary energy substances on cell viability during fermentation period

2.2 添加輔助能量物質(zhì)對細(xì)胞能量代謝的影響

對反映細(xì)胞能量代謝水平的胞內(nèi)輔因子含量和電子呼吸鏈活性進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖3所示。與對照相比，添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉發(fā)酵批次的NADH/NAD+得到極顯著（P<0.01）提高（60 h前），ATP/AMP在發(fā)酵前期明顯高于對照，但50 h后劇烈下降，明顯低于對照；同時(shí)呼吸鏈脫氫酶活性也表現(xiàn)出與ATP/AMP相同的變化趨勢。檸檬酸鹽和丙酮酸鹽作為輔助能量物質(zhì)，能夠提高三羧酸循環(huán)的代謝水平，提高胞內(nèi)NADH/NAD+比例，進(jìn)而促進(jìn)ATP的合成[20,22]。電子呼吸鏈能夠接受NADH的電子，將其氧化形成NAD+，電子經(jīng)呼吸鏈傳遞釋放能量，催化磷酸化反應(yīng)合成ATP，電子呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞ATP合成的重要途徑[23?24]。因此，可以推測，發(fā)酵前期輔助能量物質(zhì)有效提高了NADH/NAD+，在電子呼吸鏈高效運(yùn)行的情況下大量合成ATP，為菌體生長和產(chǎn)物合成提供了有利條件；但由于呼吸鏈高速運(yùn)行增加了電子的泄漏，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，造成細(xì)胞組分損傷和呼吸鏈相關(guān)酶活性的降低，導(dǎo)致發(fā)酵后期ATP/AMP極顯著低于對照（P<0.01），進(jìn)而影響菌體活性和產(chǎn)物合成。

圖3 添加輔助能量物質(zhì)對細(xì)胞能量代謝的影響Fig.3 Effects of auxiliary energy substances on cell energy metabolism

2.3 添加輔助能量物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧和丙二醛水平的影響

對菌體細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）含量及脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物丙二醛（MDA）的濃度進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。在對照批次中，胞內(nèi)ROS和MDA濃度隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加，但提高幅度很小，未對細(xì)胞產(chǎn)生大的損傷，菌體生長和產(chǎn)物合成在72 h的發(fā)酵周期內(nèi)一直進(jìn)行（圖1）。然而，在添加輔助能量物質(zhì)的批次中，胞內(nèi)ROS和MDA濃度隨發(fā)酵的進(jìn)行快速增加，在26~36 h增加幅度尤為明顯，而且在26 h后ROS和MDA濃度與對照相比，有極顯著（P<0.01）的提高。此外，還對胞內(nèi)NADPH/NADP+進(jìn)行了測定，如圖4C所示，添加輔助能量物質(zhì)批次的NADPH/NADP+在發(fā)酵過程中變化幅度很大，26 h明顯高于對照批次，36 h及以后與對照批次相比，有極顯著（P<0.01）的下降，最終比例僅為0.6左右的低水平。NADPH主要為細(xì)胞物質(zhì)合成提供還原力以及維持氧化還原平衡，NADPH/NADP+大幅下降可能是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化脅迫導(dǎo)致的[25?26]。以上現(xiàn)象表明，發(fā)酵后期，強(qiáng)氧化性的活性氧自由基大量積累[27]，導(dǎo)致氧化還原失衡，超出細(xì)胞的承受能力，細(xì)胞膜等遭到損害，細(xì)胞活性降低，最終導(dǎo)致發(fā)酵后期產(chǎn)物合成停滯的現(xiàn)象。

圖4 輔助能量物質(zhì)激發(fā)氧化脅迫造成細(xì)胞物質(zhì)損傷Fig.4 Addition of auxiliary energy substances triggered oxidative stress causing cell damage

2.4 谷胱甘肽與輔助能量物質(zhì)耦合添加促進(jìn)cAMP發(fā)酵合成

谷胱甘肽（GSH）是一種發(fā)酵工業(yè)中常用的抗氧化劑，具有清除氧自由基的作用[28?29]。針對添加輔助能量物質(zhì)導(dǎo)致氧化脅迫的問題，進(jìn)行了谷胱甘肽與輔助能量物質(zhì)耦合添加的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。耦合添加批次的菌體濃度和cAMP產(chǎn)量明顯高于單獨(dú)添加GSH批次，由于GSH的作用，發(fā)酵后期菌體和產(chǎn)物濃度持續(xù)增加，沒有停滯和下降的趨勢。檸檬酸鈉耦合GSH與丙酮酸鈉耦合GSH批次的cAMP產(chǎn)量分別達(dá)到4.05和4.32 g/L，比單獨(dú)添加GSH批次分別提高了15.2%和22.7%，與圖1中對照相比分別提高了21.9%和30.1%。此外，與僅添加GSH批次相比，耦合添加批次的CO2含量和細(xì)胞活性明顯處于較高水平；與相應(yīng)未添加GSH的批次相比，耦合添加批次的細(xì)胞活性也明顯得到提高（圖2）。這表明添加GSH有效解決了由輔助能量物質(zhì)導(dǎo)致的氧化脅迫問題，菌體活性得到明顯提升，產(chǎn)物在發(fā)酵后期能夠持續(xù)合成。

圖5 谷胱甘肽提高細(xì)胞活性促進(jìn)cAMP發(fā)酵合成Fig.5 Exogenous glutathione enhanced cells viability and cAMP production

3 結(jié)論

單獨(dú)添加檸檬酸鈉、丙酮酸鈉批次的產(chǎn)物合成和菌體生長速率在發(fā)酵前期均明顯高于對照，約30 h后快速下降，降至低于對照批次的低水平；菌體活性、ATP/AMP以及電子呼吸鏈活性在發(fā)酵36 h后劇烈下降，下降幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照批次。添加輔助能量物質(zhì)導(dǎo)致ROS和丙二醛在發(fā)酵36 h后迅速積累，而NADPH/NADP+卻快速下降，表明輔助能量物質(zhì)導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，造成細(xì)胞組分損傷以及細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的停滯。耦合添加輔助能量物質(zhì)和谷胱甘肽的發(fā)酵批次中，發(fā)酵后期細(xì)胞和產(chǎn)物濃度持續(xù)增加，細(xì)胞活性也得到較大提升，cAMP產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高。