牛乳主要過(guò)敏原酪蛋白的特性和分離純化研究進(jìn)展

熊子奕，馬 鑫，陳紅兵，李 欣，熊春紅,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047）

食物過(guò)敏是指人體接觸某特定食物后，引發(fā)的不良免疫反應(yīng)[1]。有數(shù)據(jù)顯示，約有5%的成年人和6%的兒童（特別是3歲以下）會(huì)發(fā)生食物過(guò)敏[2?3]，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。牛乳是聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization, FAO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）認(rèn)定的八大過(guò)敏性食物之一，同時(shí)也是嬰幼兒最早接觸的食物過(guò)敏原[4]。最新研究表明，在我國(guó)有2.69%的嬰幼兒對(duì)牛乳蛋白過(guò)敏[5]。牛乳蛋白種類較多，至少有25種蛋白具有潛在致敏性[6]。酪蛋白（casein，CN）、β-乳球蛋白（Beta- lactoglobulin，β-Lg）和α-乳白蛋白（Alpha-lactalbumin，α-La）被認(rèn)為是牛乳中最主要的過(guò)敏原，其中，酪蛋白含量約占牛乳蛋白總量的80%[7]，大約有65%的牛乳過(guò)敏患者對(duì)酪蛋白過(guò)敏[8]，其癥狀通常表現(xiàn)為濕疹、腹瀉和胃腸出血等[9?11]。

研究表明，酪蛋白的致敏性與其結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)。通過(guò)質(zhì)譜、圓二色光譜、核磁共振波譜和X射線等分析技術(shù)[12]，可以分析酪蛋白的各級(jí)結(jié)構(gòu)，但是由于酪蛋白易受外界因素的影響，相互聚集形成較為復(fù)雜的膠束結(jié)構(gòu)，造成包括致敏性在內(nèi)的諸多生物特性的變化。因此，酪蛋白的結(jié)構(gòu)測(cè)定和酪蛋白膠束的模型構(gòu)建成為研究其致敏性的關(guān)鍵，而提取出高純度且具有完整生物學(xué)特性的酪蛋白是準(zhǔn)確測(cè)定其結(jié)構(gòu)及致敏性的前提條件。

本文重點(diǎn)綜述了牛乳酪蛋白的分離純化研究進(jìn)展，總結(jié)歸納了單一酪蛋白組分的生物學(xué)特征和多種酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)模型的共同特點(diǎn)，并介紹了酪蛋白的結(jié)構(gòu)與其致敏性的關(guān)系，為利用蛋白質(zhì)改性技術(shù)降低或消除酪蛋白致敏性的研究提供理論參考。

1 牛乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)及特性

酪蛋白是哺乳動(dòng)物乳汁中的一類含磷鈣的結(jié)合蛋白，其含量豐富，相當(dāng)于總?cè)槌煞值?.75%[13]。根據(jù)分子特性的差異，乳品中酪蛋白可分為四類：αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白，分別由位于6號(hào)染色體上的CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因編碼[14]，其中β-酪蛋白還可進(jìn)一步水解，得到的水解產(chǎn)物被稱為γ-酪蛋白[15]。不同品種的乳中四種酪蛋白的相對(duì)比例不同，在牛乳中αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白比例分別為45.0%、12.0%、35.0%和8.0%[16]。酪蛋白等電點(diǎn)為4.6~4.8，在常溫下微溶于水和有機(jī)溶劑，具有非吸濕性和非結(jié)晶性[17]。表1[18]為牛乳中酪蛋白的組分及化學(xué)性質(zhì)。酪蛋白對(duì)酸敏感，當(dāng)溶液的pH較低時(shí)，蛋白分子聚集形成沉淀，加工后可制得干酪和干酪素。

表1 牛乳中酪蛋白的組分及化學(xué)性質(zhì)[18]Table 1 Components and chemical properties of casein in milk[18]

1.1 牛乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)

酪蛋白在牛乳中并不是以單一組分的形式存在，而是相互交聯(lián)形成類似球狀的聚集體[19]，即酪蛋白膠束，其平均直徑約為150 nm[20]。圖1[12]為酪蛋白膠束冷場(chǎng)發(fā)射電鏡的掃描圖。通常情況下，酪蛋白膠束含有成千上萬(wàn)個(gè)酪蛋白分子，其中大部分與礦物質(zhì)結(jié)合形成熱力學(xué)穩(wěn)定的配位化合物。酪蛋白膠束與傳統(tǒng)意義上的膠束存在著很大的區(qū)別，其具體結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由于檢測(cè)水平的限制，人們對(duì)酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)還處于理論假說(shuō)和模型構(gòu)建的階段[21]。目前，模擬酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)模型有套核結(jié)構(gòu)模型、亞單元結(jié)構(gòu)模型、Holt模型和雙結(jié)合模型[22?24]。近年來(lái)，對(duì)于這些結(jié)構(gòu)模型還存在很大爭(zhēng)議，但是學(xué)者們普遍認(rèn)為，酪蛋白膠束具有由αs1-、αs2-、β-酪蛋白與礦物質(zhì)（主要為非晶態(tài)磷酸鈣）構(gòu)成的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和由κ-酪蛋白構(gòu)成的覆蓋在膠束表面的外部“毛”層。外部“毛”層分布不均勻，僅部分覆蓋在酪蛋白膠束的表面，形成聚電解質(zhì)刷[25]，其空間位阻和靜電斥力共同抑制了乳中酪蛋白膠束的聚集，對(duì)維持酪蛋白膠束的穩(wěn)定起到了非常關(guān)鍵的作用。除此之外，酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白有一個(gè)糖基化的親水基團(tuán)，被稱為糖巨肽[26]，易于發(fā)生水合，其膠束內(nèi)部也包含著大量的水分，這是酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的一個(gè)很重要的特點(diǎn)。

圖1 酪蛋白膠束冷場(chǎng)發(fā)射電鏡的掃描圖[12]Fig.1 Electron micrograph of casein micelle cold field emission[12]

酪蛋白膠束的生物學(xué)功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。它的三個(gè)主要的生物學(xué)功能是：有助于乳腺安全分泌高濃度的鈣和磷酸鹽，未使其鈣化；通過(guò)乳腺安全分泌高濃度的潛在纖維性酪蛋白；膠束在新生兒胃內(nèi)滯留，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)得以充分消化吸收[27]。

酪蛋白的結(jié)構(gòu)與其致敏性關(guān)系密切。酪蛋白存在可以與特異性抗體相結(jié)合的結(jié)構(gòu)組織，稱為抗原決定簇（表位），是引發(fā)牛乳過(guò)敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)[2?29]。根據(jù)表位結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為連續(xù)性過(guò)敏原表位（線性表位）和不連續(xù)性過(guò)敏原表位（構(gòu)象性表位）；又根據(jù)過(guò)敏原表位與細(xì)胞的不同結(jié)合方式，可將其分為B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。一般來(lái)說(shuō)，T細(xì)胞表位都是線性表位，而B(niǎo)細(xì)胞可以識(shí)別并呈遞完整抗原，所以B細(xì)胞表位既可以是線性表位，也可以是構(gòu)象性表位。牛乳中酪蛋白相互聚集形成膠束，會(huì)覆蓋一定數(shù)量的過(guò)敏原表位，當(dāng)人體攝入牛乳時(shí)，酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)易被破壞，被覆蓋的過(guò)敏原表位重新暴露，增強(qiáng)了酪蛋白的致敏性。

1.2 牛乳中單一酪蛋白的特性

1.2.1α-酪蛋白α-酪蛋白又稱αS-酪蛋白，由兩個(gè)單獨(dú)的基因產(chǎn)物αs1-和αs2-酪蛋白組成[30]。

αs1-酪蛋白的分子量約為23.6 kDa[31]，是由199個(gè)氨基酸（圖2）組成的單鏈磷酸化蛋白[32]，具有2種常見(jiàn)的磷酸化狀態(tài)，即含有8個(gè)（αs1-CN-8P）或9個(gè)（αs1-CN-9P）磷酸化絲氨酸殘基[33]。另外，αs1-酪蛋白的脯氨酸殘基和疏水殘基數(shù)量較多，分布均勻，使其不具有確定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，而是一個(gè)隨機(jī)線圈構(gòu)象，由基團(tuán)間疏水相互作用穩(wěn)定[34]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了牛乳αs1-酪蛋白的9種變異型, 并以A到I進(jìn)行分類[35]。其中，最常見(jiàn)的兩種變體是B和C，兩者區(qū)別在于蛋白質(zhì)的192處的氨基酸不同，分別為Glu和Gly。這種變化改變了αs1-酪蛋白的等電點(diǎn)，從而使這兩種變體很容易通過(guò)等電聚焦（IEF）識(shí)別區(qū)分[36]。有研究表明，牛乳酪蛋白中αs1-酪蛋白的致敏性明顯高于其他幾種酪蛋白，所以它被認(rèn)為是牛乳酪蛋白中最為關(guān)鍵的過(guò)敏原[37?38]。

圖2 牛αs1-酪蛋白B-8P的氨基酸序列[31]Fig.2 Amino acid sequence of αs1-CN B-8P[31]

αs2-酪蛋白由207個(gè)氨基酸殘基組成（圖3[31]），分子量大小約為25.2 kDa[39]，在牛乳總酪蛋白中占比較低。它由兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域和數(shù)個(gè)次要結(jié)構(gòu)域組成，這幾個(gè)結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)不同程度的翻譯后磷酸化以及分子間二硫鍵[40]。αs2-酪蛋白是酪蛋白家族中對(duì)鈣最敏感的成員，這可能是因?yàn)樗孽チ姿岷亢芨?，酯磷酸?lái)源于每條肽鏈上的磷酸基團(tuán)[41]。目前，已發(fā)現(xiàn)αs2-酪蛋白存在A、B、C、D和E這5個(gè)等位基因，呈現(xiàn)出基因多態(tài)性[42]。研究表明，αs2-酪蛋白基因的多態(tài)性與奶牛泌乳量、乳蛋白量、乳脂量及乳脂率等產(chǎn)奶性狀呈現(xiàn)一定相關(guān)性[43]。在過(guò)去的幾年中，人們發(fā)現(xiàn)αs1-和αs2-酪蛋白都具有分子伴侶的特性，可以防止由于高溫和其他應(yīng)激條件而導(dǎo)致的凝血和沉淀[44]。

圖3 牛αs2-酪蛋白A-11P的氨基酸序列[31]Fig.3 Amino acid sequence of αs2-CN A-11P[31]

1.2.2β-酪蛋白 在牛乳中，β-酪蛋白的含量?jī)H次于αs1-酪蛋白[45]，由209個(gè)氨基酸殘基組成（圖4[31]），分子量約為23.6 kDa，若加上5個(gè)修飾的磷酸基團(tuán)，則分子量可增加至24 kDa[46]。β-酪蛋白不穩(wěn)定，易發(fā)生水解從而產(chǎn)生γ-酪蛋白和短肽[47]。根據(jù)相同位置上氨基酸的不同，β-酪蛋白中至少存在13個(gè)遺傳變異體[48]。其中，根據(jù)β-酪蛋白的第67位氨基酸是脯氨酸還是組氨酸，可將其分為A1和A2兩種類型，這兩種變體在β-酪蛋白中最為常見(jiàn)[49?51]。有研究顯示，部分β-酪蛋白變體，如A1、B和C，可能是導(dǎo)致人體患有牛乳不耐癥和一些其他疾病的重要因素，這是由于這些變體在消化過(guò)程中產(chǎn)生一種具有阿片活性的生物活性肽β-酪啡肽（BCM-7）[51?52]。相比之下，A2變異體不參與致病機(jī)制。有一種假說(shuō)認(rèn)為A1β-酪蛋白可能增加遺傳易感兒童患Ⅰ型糖尿?。―M-I）的風(fēng)險(xiǎn)，也有人認(rèn)為A1β-酪蛋白可能是導(dǎo)致冠心病的危險(xiǎn)因素，而含A2β-酪蛋白的牛奶則可以減輕牛乳不耐癥患者的急性腸胃道癥狀[53?54]。

圖4 牛β-酪蛋白A2-5P的氨基酸序列[31]Fig.4 Amino acid sequence of β-CN A2-5P[31]

1.2.3κ-酪蛋白κ-酪蛋白是唯一具有糖成分的酪蛋白，含有169個(gè)氨基酸殘基（圖5[31]），分子量為19 kDa[55?56]。κ-酪蛋白分子中僅含有1個(gè)磷酸基團(tuán)，2個(gè)SH基,二硫鍵含量占總酪蛋白的15%。在距離肽鏈的C端三分之一處可結(jié)合碳水化合物，如唾液酸、半乳糖苷、巖藻糖。另外在肽鏈的11位和88位上有2個(gè)半胱氨酸殘基[57]。κ-酪蛋白對(duì)鈣的敏感性低，一般不與鈣結(jié)合，易發(fā)生糖基化作用[58]。牛乳中κ-酪蛋白易與其他酪蛋白結(jié)合，形成膠束，大部分的κ-酪蛋白是以酪蛋白膠束形式存在的[59]。有研究表明，κ-酪蛋白具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，其通過(guò)阻斷NFκB途徑，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生M2樣表型，這些細(xì)胞可以顯著減少Th1相關(guān)的促炎細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素-2（IL-2）的釋放，降低經(jīng)κ-酪蛋白處理的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的能力[60]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在兩種變異型：即A和B，在大多數(shù)牛乳品種中A出現(xiàn)的頻率相對(duì)更高，而B(niǎo)則與κ-酪蛋白中高比例的糖基化組分密切相關(guān)，并且影響著凝乳酶對(duì)酪蛋白的作用效果[61?62]。

圖5 牛κ-酪蛋白A-1P的氨基酸序列[31]Fig.5 Amino acid sequence of bovine κ-CN A-1P[31]

2 牛乳酪蛋白分離純化的方法

目前，牛乳中主要過(guò)敏原蛋白的分離方法較多：利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同而分離，包括等電點(diǎn)沉淀法和選擇性沉淀法；利用選擇性吸附不同而分離，包括疏水作用層析；利用過(guò)敏原在層析柱中帶電性不同而分離，包括陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析；利用過(guò)敏原的分子質(zhì)量不同而分離，包括膜技術(shù)和凝膠層析。在酪蛋白的分離純化方法中，根據(jù)分離目的物的不同，也可將上述方法初步劃分為膠束酪蛋白的初步分離和酪蛋白組分的提取純化。除此之外，利用多種分離方法結(jié)合純化酪蛋白已成為分離純化技術(shù)發(fā)展的新方向。

2.1 膠束酪蛋白的初步分離

2.1.1 高速離心法 高速離心是實(shí)驗(yàn)室常用的酪蛋白粗提方法。酪蛋白膠束在高速離心的狀態(tài)下沿徑向分離，導(dǎo)致離心的酪蛋白顆?；?，形成沉淀析出。與其他分離方法不同，酪蛋白在高速離心過(guò)程中，膠束結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，因此可以重新分散，其性質(zhì)與原膠束的性質(zhì)基本相似。葛攀瑋等[63]利用高速離心法提取純化3種市售牛奶中的酪蛋白，并對(duì)所提取的酪蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定分析，其平均濃度為2.02 mg/mL，分子量為28 kDa。牛欣等[64]將鮮乳高速離心得到酪蛋白，并以分離得到的酪蛋白為原料，從流變學(xué)特性、粒徑、Zeta電位和透光度等幾個(gè)指標(biāo)研究了其在不同 pH 下的變化情況。高速離心法所得沉淀是不純的，需經(jīng)過(guò)再懸浮和再離心2~3次，才能取得較純的蛋白顆粒。

2.1.2 凝乳酶誘導(dǎo)分離法 凝乳酶是一種天冬氨酸內(nèi)切蛋白酶，可高特異性地水解κ-酪蛋白。κ-酪蛋白對(duì)維持酪蛋白膠束的穩(wěn)定起到了至關(guān)重要的作用，它能防止酪蛋白膠束凝聚。利用凝乳酶有限地水解κ-酪蛋白，破壞酪蛋白膠束的穩(wěn)定，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)解體和凝乳的形成。凝乳可進(jìn)一步分離出各酪蛋白組分。

凝乳酶誘導(dǎo)分離法操作簡(jiǎn)單，是常用的酪蛋白粗提方法，但是利用該方法提取的酪蛋白純度不高，需與選擇性沉淀法等分離方法結(jié)合，進(jìn)一步分離出各酪蛋白組分。Huppertz等[65]用凝乳酶處理脫脂乳樣品，再利用低溫酸性條件下αs-酪蛋白和β-酪蛋白溶解度的不同，進(jìn)一步分離酪蛋白組分。使用該方法提取的β-酪蛋白含量大約占脫脂乳樣品中總酪蛋白含量的7%，純度較高。由于κ-酪蛋白被高度特異性水解，所以該方法不利于后續(xù)提純?chǔ)?酪蛋白。

2.1.3 等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解度最低這一化學(xué)特性而開(kāi)發(fā)的分離方法。蛋白質(zhì)在溶液中具有兩性電離的現(xiàn)象，當(dāng)溶液pH與其等電點(diǎn)相等時(shí)，蛋白質(zhì)處于兼性分子的狀態(tài)，凈電荷為零，分子間靜電斥力較小，更容易相互碰撞凝聚，形成沉淀析出[66]。利用這一性質(zhì)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH來(lái)達(dá)到分離不同蛋白質(zhì)組分的目的。

等電點(diǎn)沉淀法可以快速地分離牛乳酪蛋白，方法簡(jiǎn)單，易于操作，對(duì)設(shè)備要求不高，是實(shí)驗(yàn)室制備酪蛋白的常用方法。蔣紅玲等[67]以脫脂乳為原料，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）后，用1moL/L 的HCl將溶液pH調(diào)節(jié)至4.6，析出酪蛋白沉淀，取得了較好的分離純化效果，其純度>90%。宋宏新等[68]采用新鮮牛乳為原料，利用等電點(diǎn)沉淀法分離出粗品酪蛋白，再通過(guò)水洗凈化除雜和有機(jī)溶劑脫脂等步驟制得牛乳酪蛋白，通過(guò)凱氏定氮法和SDS-PAGE凝膠電泳分析比較酪蛋白組分差異，獲得酪蛋白的純度與得率分別為91.13%和86.75%。利用此方法分離出的酪蛋白純度能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要，常與其他分離方法結(jié)合以進(jìn)一步分離純化酪蛋白組分。

2.2 酪蛋白組分的提取純化

2.2.1 選擇性沉淀法 選擇性沉淀法是利用蛋白質(zhì)對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性的不同，而有選擇地使之變性沉淀，從而達(dá)到分離提純的目的。αs-酪蛋白比β-酪蛋白具有更多的磷酸絲氨酸基團(tuán)，在堿性條件下，帶有更多的凈負(fù)電荷，因此αs-酪蛋白對(duì)Ca2+的親和性比β-酪蛋白更高[69]。而在酪蛋白組分中，β-酪蛋白疏水性最強(qiáng)，但是其溶解度受溫度的影響較大。當(dāng)溫度較低時(shí)（≤4 ℃），即使溶液pH在其等電點(diǎn)處，β-酪蛋白也還是擁有較高的溶解度。通過(guò)低溫分離后再加熱的方法，可獲得β-酪蛋白組分。κ-酪蛋白在含三氯乙酸（TCA）的尿素溶液中有較高的溶解度[70]，可利用這一性質(zhì)將其與其他酪蛋白組分分離。

選擇性沉淀法是等電點(diǎn)沉淀法的一種改進(jìn)方法，能夠?qū)⑴Ｈ橹蟹蛛x出的膠束酪蛋白進(jìn)一步分離純化，從而得到各種酪蛋白組分。Thomas等[71]以牛乳中分離出的膠束酪蛋白為原料，采用選擇性沉淀的方法，分離各酪蛋白組分。利用該方法得到的αs-和β-酪蛋白組分純度均達(dá)到95%以上，而κ-酪蛋白純度為54%，得率為83%。雖然該方法步驟較多，但是得到的酪蛋白組分純度高，且對(duì)過(guò)程稍加改進(jìn)便可用于中試規(guī)模分離酪蛋白，所以選擇性沉淀法是最常用的酪蛋白分離純化方法之一。

2.2.2 疏水作用層析法 蛋白質(zhì)表面一般含有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，疏水作用層析是利用蛋白質(zhì)表面某一部分具有疏水性，與同樣帶有疏水性的層析介質(zhì)在高鹽濃度的條件下相結(jié)合。在洗脫時(shí)，將鹽濃度逐漸降低，根據(jù)蛋白質(zhì)組分的疏水性不同而逐個(gè)洗脫純化。疏水性弱的蛋白組分，在較高離子強(qiáng)度的溶液中被洗脫下來(lái)，當(dāng)離子強(qiáng)度降低時(shí)，疏水性強(qiáng)的蛋白才被洗脫[72]。疏水作用層析法分離酪蛋白，以尿素為流動(dòng)相，將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質(zhì)上，然后線性或階段降低離子強(qiáng)度，選擇性的將樣品解吸。

牛乳酪蛋白各組分疏水性差別較大，β-酪蛋白疏水性最強(qiáng)，α-酪蛋白次之，κ-酪蛋白疏水性最弱[73]，因此可以有效地分離各酪蛋白組分。Emilia等[74]使用TSK-Gel Ether-5PW疏水色譜柱分離和測(cè)定各酪蛋白組分，得到的αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白純度分別為76.1%、85.0%、87.9%和65.5%。由于蛋白質(zhì)與疏水性層析介質(zhì)之間的作用力相對(duì)較弱，分離過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)活性影響較小，更加有利于蛋白質(zhì)的后續(xù)分析實(shí)驗(yàn)。該方法對(duì)疏水性層析介質(zhì)的選擇要求較高，需要依據(jù)目標(biāo)蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，結(jié)合能力太強(qiáng)的介質(zhì)會(huì)使得蛋白很難洗脫，而結(jié)合能力太弱的介質(zhì)無(wú)法達(dá)到分離出各蛋白組分的效果，所以這也是該分離方法的技術(shù)難點(diǎn)。

2.2.3 離子交換層析法 離子交換層析法是利用蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷性質(zhì)的不同而達(dá)到分離純化目的的一種分離方法。利用該方法分離酪蛋白組分，是依據(jù)各種酪蛋白在特定的條件下，呈現(xiàn)不同的電荷強(qiáng)度，與離子交換劑的結(jié)合能力存在明顯差別，用洗脫劑洗脫時(shí)，按結(jié)合能力的大小，由弱到強(qiáng)依次洗脫分離。離子交換層析法主要分為陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析，其中分離酪蛋白組分常用陰離子交換層析。

離子交換層析法具有良好的樣品處理能力和廣泛的適用性，適中的成本和高度的自動(dòng)化使其成為應(yīng)用最廣泛的酪蛋白分離純化技術(shù)之一。劉納[75]以牛乳加工制得的干酪素為原料，將尿素沉淀法與離子交換層析法相結(jié)合對(duì)干酪素進(jìn)行分級(jí)分離，最終得到的αs-酪蛋白相對(duì)純度和回收率分別為75.4%與73.8%，β-酪蛋白相對(duì)純度和回收率為87.9%與62.0%，κ-酪蛋白相對(duì)純度和回收率為57.3%與49.8%。Johann等[76]通過(guò)Source 30Q陰離子交換樹(shù)脂分離純化各酪蛋白組分，每1.2 g全酪蛋白中可分離αs-酪蛋白456 mg、β-酪蛋白358 mg和κ-酪蛋白99 mg。雖然離子交換層析法具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是也存在一定的局限性。在工業(yè)生產(chǎn)中，洗脫劑中的鹽濃度很難精準(zhǔn)控制，所以只能采用分步洗脫而不是連續(xù)升高的鹽梯度，分離效果會(huì)有所下降，但即使是用最為精確的控制條件，僅用離子交換層析這一單一方法，也很難得到純度高的蛋白，需要與其他分離純化技術(shù)相結(jié)合，比如疏水作用層析法。

2.2.4 高效液相色譜法 高效液相色譜法是一種常用的快速分離方法。其分離效率高，通常分析一個(gè)樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。高效液相色譜分辨率較高，重復(fù)性好，色譜柱可以反復(fù)使用，樣品不易被破壞，易回收，且自動(dòng)化程度高。因此高效液相色譜法的應(yīng)用較廣，大部分有機(jī)化合物都可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。

高效液相色譜法方便快捷，酪蛋白產(chǎn)物純度高，可作為高精度研究的實(shí)驗(yàn)材料。隨著牛乳致敏性研究的深入，該方法分離過(guò)敏原蛋白的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。劉夢(mèng)云等[77]以C8色譜柱為分離柱，利用反相高效液相色譜法對(duì)乳粉中酪蛋白的4種組分（αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）進(jìn)行分離檢測(cè)。4種酪蛋白的加標(biāo)回收率在95.2%~100.6%之間，且純度高。王娟等[78]采用Agilent Zorbax 300SB-C8色譜柱對(duì)牛乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，以三氟乙酸-水-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，在波長(zhǎng)214 nm處測(cè)定牛乳蛋白組分。其中αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白的回收率分別為94.3%、83.3%、91.9% 和 80.7%，純度可達(dá)99%。

2.2.5 膜分離技術(shù) 膜分離是利用高分子膜的選擇透過(guò)性，實(shí)現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)組分分離的技術(shù)。由于牛乳中各組分的分子量和粒徑不同，大部分乳清蛋白、乳糖、礦物質(zhì)和水能透過(guò)膜成為滲透液，而酪蛋白不能透過(guò)膜留在截留液中，從而實(shí)現(xiàn)酪蛋白的分離純化[79]。應(yīng)用于酪蛋白組分分離的膜技術(shù)主要為微濾（MF）和超濾（UF）。

膜分離技術(shù)選擇性強(qiáng)，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，適用范圍廣，是一種發(fā)展迅速的新興分離技術(shù)。由于β-酪蛋白在低溫條件下是單量體，隨著溫度的升高會(huì)變?yōu)榫酆象w，與原膠束的直徑存在明顯的差別，使用膜分離效果顯著，所以膜分離技術(shù)也是中試規(guī)模分離純化β-酪蛋白的常用方法。Johannes等[80]在50 ℃的條件下，將脫脂乳在孔徑為0.1 mm的陶瓷膜上進(jìn)行微濾，獲得膠束酪蛋白濃縮物。進(jìn)而經(jīng)冷藏處理后，在溫度≤5 ℃的條件下，使用孔徑為0.3 mm的有機(jī)膜從冷藏濃縮物中微濾分離β-酪蛋白。進(jìn)一步將β-酪蛋白滲透液加熱至50 ℃，使β-酪蛋白自締合，采用截留值為10 kDa的有機(jī)膜進(jìn)行超濾。利用該方法獲得的β-酪蛋白純度為92.64%，產(chǎn)率最高為18.07%。值得注意的是，利用該方法分離蛋白之后，膜面易發(fā)生污染，致使膜分離性能降低，故需采用與工藝相適應(yīng)的膜面清洗方法。

2.3 多種分離方法結(jié)合純化酪蛋白

每種分離純化酪蛋白的方法都具有其優(yōu)勢(shì)，但也存在一定的局限性。在實(shí)際應(yīng)用中，單獨(dú)使用一種分離方法純化酪蛋白，其純度和生物學(xué)性質(zhì)可能不能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要，而不同的分離純化方法之間可能存在協(xié)同作用，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的效果，所以多種分離方法相結(jié)合純化酪蛋白，可以顯著改善酪蛋白的分離效果。叢艷君等[81]使用等電點(diǎn)沉淀法，將脫脂乳pH調(diào)至4.2，得到的酪蛋白沉淀反復(fù)洗滌并冷凍干燥；再將得到的酪蛋白溶于含有尿素和二硫蘇糖醇（DTT）的甲酸鈉緩沖液，加至離子交換層析柱中，以NaCl為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，最后使用10 kDa膜進(jìn)行超濾以除去尿素和氯化鈉，得到高純度的αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。Katharina等[82]先通過(guò)膜技術(shù)從牛乳中分離出膠束酪蛋白，再采用選擇性沉淀法進(jìn)一步分離，獲得不同酪蛋白組分。其中β-酪蛋白的純度與產(chǎn)率分別可達(dá)到89.6%和32%；而αs-和κ-酪蛋白的純度分別為61%和43%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于利用單一方法純化酪蛋白，多種分離方法相結(jié)合純化酪蛋白更具有競(jìng)爭(zhēng)力。

3 前景與展望

酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質(zhì)，是良好的蛋白補(bǔ)充劑及添加劑，但是其較高的致敏性同樣不容忽視。分離出較高純度的酪蛋白，是人們研究牛乳過(guò)敏的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，關(guān)于牛乳酪蛋白分離純化的技術(shù)雖然很多，但仍然存在需要解決的問(wèn)題。一些操作簡(jiǎn)便、成本較低的方法分離出的酪蛋白純度很難滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要，而分離純度高的分離純化技術(shù)則需要較為精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，成本較高。因此，牛乳酪蛋白的分離純化技術(shù)有待于進(jìn)一步研究。除了對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改良之外，還必須發(fā)展全新的分離技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離和后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析全過(guò)程的自動(dòng)化。與此同時(shí)，采用多種分離方法結(jié)合純化酪蛋白也將成為今后的主要發(fā)展趨勢(shì)。