錢 沖 胡光輝,2 勾新磊 劉偉麗,2 高 峽,2 張 梅,2*
(1. 北京市理化分析測(cè)試中心,有機(jī)材料檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京 100089;2.北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心,北京 100089)
作為碳的一種同素異形體,富勒烯是由五邊形和六邊形組成的籠狀結(jié)構(gòu)全碳分子[1]。C60、C70富勒烯是最為常見(jiàn)的種類,也是理化性質(zhì)最穩(wěn)定、研究最為廣泛的兩種富勒烯。其中,C60是最小的遵守獨(dú)立五元環(huán)規(guī)則的富勒烯,具有類似足球一樣完美對(duì)稱的結(jié)構(gòu),其合成產(chǎn)率也最高[2]。大量的研究發(fā)現(xiàn),富勒烯材料在超導(dǎo)、磁性、光學(xué)、催化、生物等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能,并已在生物醫(yī)藥、新能源、新材料等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[3-7]。特別是富勒烯分子獨(dú)特的π電子結(jié)構(gòu)以及低電子重組能、高電子遷移率等,使其成為醫(yī)學(xué)診斷及治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的功能原材料。
經(jīng)過(guò)三十余年的發(fā)展,富勒烯的合成方法日益完善,包括火焰燃燒法、電弧放電法、石墨電阻蒸發(fā)法、激光蒸發(fā)法等[8, 9],各種方法的工藝條件不一樣,產(chǎn)量和純度等也不盡相同。絕大多數(shù)方法合成的初產(chǎn)物為C60、C70等多種富勒烯與其副產(chǎn)物的碳灰混合物,成分非常復(fù)雜,由于不同富勒烯彼此間的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)十分相似,如何對(duì)富勒烯的碳灰產(chǎn)物進(jìn)行高效提取和分離是影響富勒烯發(fā)展的重要技術(shù)挑戰(zhàn)。只有將合成的富勒烯進(jìn)行有效提取和分離,才能進(jìn)一步對(duì)其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行深入研究,為進(jìn)一步拓展富勒烯的應(yīng)用提供基礎(chǔ)[10-12]。
在富勒烯的分離、提取及改性研究中,芳香苯類化合物是最為常用的有機(jī)溶劑,特別是苯作為芳香族有機(jī)溶劑的典型代表被廣泛使用。由于苯環(huán)的結(jié)構(gòu)與富勒烯較為相似,苯在富勒烯的分離提取過(guò)程中難以被完全去除,這導(dǎo)致其在最終的富勒烯產(chǎn)品中不可避免地殘留。然而,作為一類致癌物,苯的毒性較大,會(huì)對(duì)人體的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)造成損害,并影響人體的造血和免疫機(jī)能,嚴(yán)重威脅人類生命健康[13]。因此,對(duì)富勒烯中苯殘留進(jìn)行有效分析與監(jiān)測(cè)是保障產(chǎn)品安全性能的必要手段,對(duì)推動(dòng)富勒烯在更多領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。
目前,關(guān)于苯殘留檢測(cè)的相關(guān)研究主要集中在化工、環(huán)境、食品等領(lǐng)域[14-16],而關(guān)于富勒烯中苯殘留的分析方法還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)是苯殘留檢測(cè)最常用的方法[17,18],這兩種方法的缺點(diǎn)在于靈敏度較低、受基質(zhì)干擾影響大,易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。相比而言,氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)通過(guò)二次打碎母離子,生成特異性更強(qiáng)的子離子,能夠在很大程度上提高檢測(cè)方法的靈敏度、降低基質(zhì)干擾,有效避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[19,20],這也為富勒烯中苯殘留的分析提供了可能。本研究選取靈敏度高且基質(zhì)效應(yīng)小的GC-MS/MS法,建立了測(cè)定C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的分析方法,并開(kāi)展了相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果將為富勒烯中其它溶劑殘留的檢測(cè)技術(shù)提供借鑒,為富勒烯的應(yīng)用特別是藥物臨床前的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要技術(shù)支持。
氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(GCMS-TQ8040),GCMSsolution 4.30工作站,日本Shimadzu公司;渦旋混合器(Vortex-genie 2),美國(guó)Scientific Industries公司;超聲清洗器(KQ-300DE),中國(guó)昆山舒美公司;電子天平(XPE105),瑞士Mettler Toledo公司;甲醇(色譜純),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;苯標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1000 μg/mL),美國(guó)Accustandard公司;C60富勒烯(批號(hào):SES60F2018020203)、C70富勒烯(批號(hào):SES70F2017073104),由中科院化學(xué)所提供,用于方法學(xué)驗(yàn)證;其它C60、C70富勒烯樣品均購(gòu)自市場(chǎng)。
取濃度為1000 μg/mL苯標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,用甲醇將其逐級(jí)稀釋至濃度分別為3.00、10.00、20.00、40.00、200.00、400.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。
GC條件:DB-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250℃;載氣為He。進(jìn)樣量1.0 μL,分流比5:1,柱流量1.0 mL/min。升溫程序:初始柱溫在50 ℃保持1 min,經(jīng)20 ℃/min升至100 ℃,之后30 ℃/min升至280 ℃并保持2 min。
MS/MS條件:電子轟擊離子源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃;接口溫度280 ℃,溶劑延遲時(shí)間0.5 min,采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。保留時(shí)間和MRM條件參數(shù)見(jiàn)表1所示。
表1 苯保留時(shí)間及MRM條件參數(shù)
稱取C60、C70富勒烯樣品100 mg置于2 mL離心管中,加甲醇1 mL,渦旋震蕩混勻后,置于超聲清洗器中超聲提取40 min并搖勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。取濾液作為供試品溶液,按照儀器工作條件對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。
圖1為苯和甲醇的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。苯的一級(jí)特征碎片離子(母離子)質(zhì)荷比較小,因此提取溶劑的選擇應(yīng)具備以下條件:首先能夠與苯互溶,苯在其中應(yīng)有良好溶解度,以保證富勒烯中痕量苯殘留可以被提取完全;其次分子量不宜過(guò)大,若提取溶劑的分子量太大,其母離子及相應(yīng)的子離子會(huì)干擾苯的測(cè)定。
圖1 苯(a)和甲醇(b)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖
甲醇是常用的分子量最小的有機(jī)提取溶劑,并且與苯有良好互溶性,其最大母離子的質(zhì)荷比為32 m/z,很難再二次打碎生成相應(yīng)子離子,不會(huì)對(duì)苯的檢測(cè)造成干擾。因此,實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。
為縮短檢測(cè)周期,本實(shí)驗(yàn)僅在初始柱溫50 ℃下保持了1 min,便以20 ℃/min的速度升值100 ℃。當(dāng)柱溫達(dá)到該溫度時(shí),苯已出峰完全,此時(shí)繼續(xù)提高升溫速率,以30 ℃/min的快速升值280 ℃,并在該溫度下保持了2 min。這不僅減少了程序升溫的時(shí)間、提高了檢測(cè)效率,同時(shí)還達(dá)到了老化色譜柱的效果。
實(shí)驗(yàn)選擇苯的質(zhì)核比較大的一級(jí)特征碎片離子78和77 m/z作為母離子,進(jìn)行碰撞能優(yōu)化,并選擇豐度較高、質(zhì)核比較大的子離子進(jìn)行定性與定量分析。如表1所示,實(shí)驗(yàn)選擇78.00>52.10 m/z作為定量分析離子對(duì),選擇77.00>51.10 m/z和78.00>39.10 m/z作為定性分析離子對(duì)。
針對(duì)方法的專屬性進(jìn)行考察,按照試驗(yàn)方法分別對(duì)甲醇空白溶劑、苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/L)、C60富勒烯供試品溶液(100 mg/mL)、C70富勒烯供試品溶液(100 mg/mL)進(jìn)行檢測(cè)分析。
如圖2和圖3所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苯的色譜峰型及響應(yīng)性均良好,甲醇、樣品中其它成分未對(duì)苯的檢測(cè)造成干擾。這表明本分析方法具有良好的專屬性,可以滿足C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的檢測(cè)要求。
圖2 甲醇空白溶劑(a)和苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)選擇離子流圖
圖3 C60(a)和C70(b)富勒烯供試品溶液選擇離子流圖
按照試驗(yàn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,分別以苯定量離子對(duì)78.00>52.10 m/z峰面積(y)和對(duì)應(yīng)的濃度(x,μg/L)進(jìn)行線性回歸計(jì)算,得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。分別以10倍信噪比(S/N>10)和3倍信噪比(S/N>3)計(jì)算出儀器的的定量限和檢出限,再按1.4樣品的處理方式換算出苯的方法定量限與方法檢出限。
分析結(jié)果如表2和圖4所示,苯在3~400 μg/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9999,方法檢出限和定量限分別為9.00 μg/kg、30.00 μg/kg。
表2 苯的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
圖4 苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別稱取C60、C70富勒烯100 mg,置于2 mL離心管中,加入甲醇1 mL,渦旋震蕩混勻。分別平行制備7份,置于超聲清洗器中,分別超聲提取0、5、10、20、40、60、90 min后搖勻,并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,取濾液進(jìn)行檢測(cè)分析。
表3為C60、C70富勒烯分別經(jīng)不同超聲時(shí)間提取后苯含量的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C60富勒烯超聲時(shí)間小于10 min時(shí)未檢出苯;超聲時(shí)間為20 min時(shí),苯含量為6.58 μg/kg,小于方法檢出限9.00 μg/kg;超聲時(shí)間為40min時(shí),苯含量為48.31 μg/kg;當(dāng)超聲時(shí)間大于40 min時(shí),苯的檢測(cè)結(jié)果趨于穩(wěn)定。
表3 超聲提取時(shí)間優(yōu)化結(jié)果 苯含量,μg/kg
對(duì)于C70富勒烯,當(dāng)其超聲時(shí)間小于40 min時(shí),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),苯的檢測(cè)結(jié)果呈逐漸增加趨勢(shì);當(dāng)超聲提取時(shí)間大于40 min時(shí),苯的檢測(cè)結(jié)果也趨于穩(wěn)定。因此,本方法優(yōu)選的C60、C70富勒烯的超聲提取時(shí)間為40min。
實(shí)驗(yàn)配制濃度200.00 μg/L的苯標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)測(cè)定6次,以苯定量離子對(duì)78.00>52.10 m/z峰面積的RSD%值來(lái)考察方法的系統(tǒng)適應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4所示,苯標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)六次測(cè)得峰面積的RSD%值為0.95%,表明方法具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性。
表4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
實(shí)驗(yàn)配制C60、C70富勒烯供試品溶液,分別平行配制6份,并按照試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)分析,重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。C60、C70富勒烯6次檢測(cè)結(jié)果的平均值分別為48.34 μg/kg和750.04 μg/kg,對(duì)應(yīng)的RSD%值分別為4.81%、1.35%。
表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
此外,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)人員在同一臺(tái)儀器上的數(shù)據(jù)重復(fù)性,通過(guò)重復(fù)上述試驗(yàn)步驟,并以苯6次檢測(cè)結(jié)果與重復(fù)性項(xiàng)進(jìn)行比較。以苯12次測(cè)得含量的RSD%值考察方法的中間精密度,結(jié)果見(jiàn)表6所示。C60、C70富勒烯中苯殘留的12次檢測(cè)結(jié)果的平均值分別為48.28 μg/kg和750.26 μg/kg,對(duì)應(yīng)的RSD%值分別為4.48%、1.25%。
表6 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=12)
實(shí)驗(yàn)配制苯濃度分別為160.00、200.00、240.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別稱取C60、C70富勒烯100 mg,置于2 mL離心管中。分別加上述配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,渦旋震蕩混勻后,超聲提取40分鐘并搖勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。取濾液作為加標(biāo)回收樣品溶液,配制成加標(biāo)濃度分別為1600.00、2000.00、2400.00 μg/kg的低、中、高濃度的加標(biāo)回收樣品溶液,每個(gè)加標(biāo)濃度平行配制6份進(jìn)行檢測(cè)分析。
以2.7小節(jié)重復(fù)性項(xiàng)中C60、C70富勒烯苯殘留檢測(cè)結(jié)果的平均值(分別為48.34 μg/kg和750.04 μg/kg)作為本底值,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)際測(cè)得加標(biāo)回收樣品的結(jié)果與理論添加量的比,計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD%值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7所示,苯不同濃度加標(biāo)回收率在94.39%~96.45%之間,對(duì)應(yīng)的RSD%值在1.15%~1.41%之間。
表7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
從市場(chǎng)采購(gòu)了3種C60富勒烯和2種C70富勒烯樣品,按照本試驗(yàn)方法對(duì)其中的苯殘留量進(jìn)行分析測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果如表8所示,市售的C60、C70樣品中均未檢測(cè)出苯,苯殘留量均低于方法檢出限9.00 μg/kg。
表8 市售C60、C70富勒烯樣品的檢測(cè)結(jié)果
C60和C70富勒烯理化性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)率高,被廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)學(xué)、化妝品等眾多領(lǐng)域。目前,藥物分析中對(duì)苯的殘留量有明確的限量規(guī)定,關(guān)于富勒烯作為最有潛力的藥物材料之一,其中苯殘留的分析方法尚鮮有報(bào)道,亟需明確并建立C60、C70富勒烯中苯殘留的分析測(cè)試方法。本工作探索并建立了基于GC-MS/MS測(cè)定C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的方法,并系統(tǒng)開(kāi)展了相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證。研究結(jié)果表明,該方法的選擇性好、靈敏度高、分析速度快,并且操作便捷、檢測(cè)成本低,可廣泛應(yīng)用于C60、C70富勒烯樣品中痕量苯殘留的定量及定性檢測(cè)。研究結(jié)果將有助于指導(dǎo)富勒烯中其它殘留組分的測(cè)定,對(duì)富勒烯的應(yīng)用推廣特別是藥物臨床前的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義