正交試驗(yàn)法優(yōu)選養(yǎng)心安神顆粒醇提工藝

孫永慧，付玉琪，張 靜(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院， 哈爾濱 150040)

養(yǎng)心安神顆粒是由黃芪、白芍、五味子、當(dāng)歸、酸棗仁、川芎等13味中藥組成，具有養(yǎng)心安神、益氣養(yǎng)血、補(bǔ)腎益智、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)等功效.用于治療神經(jīng)衰弱、心悸失眠、倦怠無(wú)力、頭暈、多夢(mèng)、耳鳴健忘等癥，具有很好的療效.依據(jù)各味藥的藥效成分將方中五味子、茯神、白茯苓、肉桂、川芎、甘草6味藥材采用乙醇提取.其中五味子發(fā)揮收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的作用.木脂素類化合物是五味子的主要有效成分，包括五味子素類、五味子酚類、五味子酯類等，其測(cè)定多采用高效液相色譜法[1-9].為保障臨床治療效果，本文探索利用正交試驗(yàn)法優(yōu)化養(yǎng)心安神顆粒的醇提取工藝，以出膏率及含五味子醇甲的量作為檢測(cè)的指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定含五味子醇甲的量，作為評(píng)價(jià)提取工藝的標(biāo)準(zhǔn).

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters2695-2996型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省常州普天儀器制造有限公司).

1.2 藥材與試劑

五味子、茯神、白茯苓、肉桂、川芎、甘草藥材(購(gòu)買于哈爾濱市道外區(qū)人和藥材行)；水(超純水)；乙醇(分析純)；甲醇(色譜純)；五味子醇甲(批號(hào)：200817-201511，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院).

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)過(guò)篩選一定因素條件后，最后選定的四個(gè)因素分別為：乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)、加乙醇量(D).將上述四個(gè)因素定為與提取的效果具有相關(guān)性的四個(gè)因素[10-13].設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的水平為3個(gè)水平，以出膏率及含五味子醇甲的量為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn).提取工藝的因素水平表見(jiàn)表1.

表1 乙醇提取工藝因素水平表

2.2 含五味子醇甲量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)；甲醇-水(55∶45)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm.柱溫30 ℃；流速為1 mL/min；

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱量五味子醇甲對(duì)照品3.9 mg，放置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混勻，即得五味子醇甲的對(duì)照品溶液(0.39 mg/mL).

2.2.3 供試品溶液制備

取五味子7.5 g、白茯苓7.5 g、肉桂5 g、川芎7.5 g、茯神5 g、甘草5 g.依據(jù)正交試驗(yàn)表的試驗(yàn)條件提取，得到的溶液濃縮定容至100 mL量瓶中，精密量取10 mL蒸干，加甲醇溶解轉(zhuǎn)移至20 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，即得.

2.2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)

取白茯苓7.5 g、肉桂5 g、川芎7.5 g、茯神5 g、甘草5 g.按照正交實(shí)驗(yàn)表4號(hào)試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，提取液蒸干.處理方法同2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備.

對(duì)照品的色譜圖、供試品色譜圖、陰性色譜圖見(jiàn)圖1～3，結(jié)果為陰性供試品溶液五味子醇甲的色譜峰位置無(wú)干擾.

圖1 五味子醇甲對(duì)照品溶液HPLC圖

圖2 樣品溶液HPLC圖

圖3 陰性溶液HPLC圖

2.2.5 方法學(xué)考察

1)線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、15 μL注入色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣微克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程.求得回歸方程為Y=1.997 6×106X+3.005 2×104(R=0.999 9)，結(jié)果表明五味子醇甲于0.78～5.85 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2)精密度試驗(yàn)

精密吸取五味子醇甲對(duì)照品溶液，接連進(jìn)樣6次，每次10 μL，峰面積的積分值RSD為1.49%，結(jié)果表明本儀器具有良好的精密度.

3)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，進(jìn)樣10 μL.分別于0、1、2、4、8、12 h重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)定五味子醇甲峰面積.計(jì)算其RSD值為1.99%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品溶液具有比較良好的穩(wěn)定性.

4)重復(fù)性試驗(yàn)

取正交試驗(yàn)表第4號(hào)試驗(yàn)提取液制備6份供試品溶液， 各精密吸取供試品溶液10 μL， 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含五味子醇甲的量.計(jì)算RSD值為0.94%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，該樣品的處理方法符合重現(xiàn)性要求，重復(fù)性良好.

5)加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取已知含量的供試品提取液5 mL共計(jì)6份(1/20量的提取液)，分別加入五味子醇甲對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備供試溶液，精密吸取該供試溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率RSD值為1.21%.所得試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)確定的含量測(cè)定方法合理，具有良好的準(zhǔn)確度.

2.3 結(jié) 果

依次測(cè)定計(jì)算正交試驗(yàn)表中每組醇提液的出膏率以及含五味子醇甲的量，綜合評(píng)分=70%×含五味子醇甲量+30%×出膏率，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4.

表3 醇提取正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果表

表4 提取工藝方差分析表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響乙醇提取的主次因素順序?yàn)椋築>C>A>D.結(jié)合K值，按照正交提取的工藝可以得到的最佳提取工藝是：A1B3C3D1，即70%的乙醇溶液，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為2 h，加入乙醇的量分別為8倍量、6倍量、4倍量.

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)最佳提取條件，重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明工藝穩(wěn)定可行.

3 討 論

隨著新技術(shù)、新工藝、新輔料的出現(xiàn)，中藥顆粒劑的質(zhì)量和品類已得到明顯特升.顆粒劑是由傳統(tǒng)的中藥湯劑發(fā)展而來(lái)的,是中藥湯劑的發(fā)展與傳承，具有生產(chǎn)方便、服用量小、口感好、易貯藏、易攜帶及運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，滿足了對(duì)中藥現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化的需求，已經(jīng)成為人們常用的藥物劑型，具有良好的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用前景[14-16].

本實(shí)驗(yàn)采用不同提取條件測(cè)定，綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終得到最佳提取條件，對(duì)養(yǎng)心安神顆粒的醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為該復(fù)方制劑有效成分提取及今后的研究提供了理論依據(jù).