閥切換在線凈化技術(shù)檢測魚肉罐頭中苯并(a)芘

李亞，梁劍鋒*，梁美艷，卓梅芳，鐘水橋

1. 梧州學院化學工程與資源再利用學院（梧州 543002）；2. 梧州市食品藥品檢驗所（梧州 543002）

苯并芘是一種含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，按照苯環(huán)稠合位置可分為2種：苯并[a]（1, 2-苯并芘）芘和苯并[a]芘（4, 5-苯并芘）。其中，在食品中常見的苯并芘為苯并[a]芘，其可引起人體局部組織的癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細胞DNA、肺細胞和肝細胞損傷，因此有強烈的致癌作用，被國際衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[1-3]。苯并芘容易在水體、土壤和農(nóng)作物中殘留，而水產(chǎn)品中苯并芘的來源主要包括原料污染和加工過程污染，如養(yǎng)殖水污染造成在生物體內(nèi)富集，燒烤、煙熏、烘烤時受高溫影響發(fā)生裂解與熱聚合等反應(yīng)形成[3-6]。

魚罐頭是以新鮮或冷凍的魚為原料，經(jīng)加工處理、裝罐、加入調(diào)味料、密封、殺菌等加工過程制成的即食罐頭產(chǎn)品，按照加工工藝可以分為紅燒、茄汁、煎炸、清蒸、煙熏、油浸、水浸等類別[7]。由于魚肉中含有豐富蛋白質(zhì)和在加工過程使用大量油脂，而且加工過程為達到魚肉罐頭有特殊色、香、味，往往采用煎炸、紅燒、殺菌等高溫加工工藝，容易發(fā)生裂解和聚合反應(yīng)生產(chǎn)有害物質(zhì)苯并芘。近年來隨著中國社會與經(jīng)濟的快速發(fā)展，食品安全公共衛(wèi)生問題也隨之頻發(fā)，特別在2010年國內(nèi)出現(xiàn)茶籽油中苯并芘超標食品安全事件后，公眾對苯并(a)芘在食品中殘留越發(fā)關(guān)注[8-11]。因此，研究魚肉罐頭中苯并(a)芘方便、快捷的檢測方法，對保障公眾食品安全具有重要意義。

苯并(a)芘常用檢測方法有熒光分光光度法、薄層色譜法、免疫學法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用法等[12-16]。這些常用的檢測方法在前處理過程中需要采用高毒害性有機試劑二氯甲烷作為溶劑萃取，同時需要成本較高的苯并(a)芘分子印跡柱凈化提取液，還需要氮吹儀濃縮等手工操作步驟[17]，整個檢驗過程費時、費力，檢驗效率不高。近年來隨著閥切換在線凈化-超高速液相色譜儀聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展，其越來越多地被應(yīng)用在復(fù)雜的食品安全檢測領(lǐng)域，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在線凈化與檢測分析在系統(tǒng)內(nèi)自動完成，具有前處理簡單、靈敏度及回收率高的優(yōu)點[18-21]。試驗采用閥切換在線凈化系統(tǒng)應(yīng)用于魚肉罐頭中苯并(a)芘的檢測，簡化檢測過程中樣品前處理步驟，提高檢測自動化程度，減少有害有機試劑的使用，保護實驗人員的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉罐頭（市售）；正己烷、二氯甲烷、乙腈、異丙醇（色譜級，德國CNW公司）；SPE印跡柱（規(guī)格500 mg/6 mL，北京迪科馬科技有限公司）；苯并(a)芘標準溶液（質(zhì)量濃度20 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）。

1.2 儀器與設(shè)備

1290液相色譜儀[含2個高壓泵、1個六通閥、熒光檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司]；色譜柱Kromasil反C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，瑞典阿克蘇諾貝爾公司）；色譜柱ChromSpher Pi（80 mm×3.0 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；ST 16R冷凍離心機（美國熱電公司）；MP-48正壓固相萃取（?？萍瘓F股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線繪制

用正己烷-異丙醇（體積比1∶1）混合溶液將苯并(a)芘標準溶液（質(zhì)量濃度20 μg/mL）稀釋至50 ng/mL苯并(a)芘標準溶液中間液，用正己烷-異丙醇混合溶液逐級稀釋質(zhì)量濃度為1.0，2.5，5.0，7.50和10.0 ng/mL的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理方法

稱取2.50 g經(jīng)粉碎混勻樣品置于15 mL離心管中，加入正己烷-異丙醇混合溶液至5.00 mL，搖勻，用渦旋器混合3.0 min，將離心管放入冷凍離心機離心4.0 min（4 ℃、4 000 r/min），取出離心管放置至室溫后吸取溶液的上清液，用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，初濾液棄去，濾液放置在液相進樣小瓶待測。

1.3.3 系統(tǒng)分析過程

樣品提取濾液經(jīng)自動進樣器進樣，進樣后系統(tǒng)切換閥處于圖1（A）所示狀態(tài)，樣品進入系統(tǒng)第1根色譜柱分析，通過該色譜柱可以將樣品中大部分非極性、小極性雜質(zhì)分離出來，經(jīng)閥門3直接進入廢液池去除，同時目標物可以富集在該色譜柱上。系統(tǒng)工作過程如圖1（A）所示。

系統(tǒng)分析一段時間樣品后，通過控制六通閥進行系統(tǒng)中管路切換（如圖1B所示），同時將系統(tǒng)色譜的流動相比例改變，將第1根色譜流出的富集的目標分析物洗脫出來，目標分析物進入第2根色譜柱分析后進入熒光檢測器定量分析完成檢測后系統(tǒng)中六通閥切回到圖1A所示狀態(tài)，流動相改變回初始比例，系統(tǒng)平衡5 min后進行下次測定。

圖1 閥切換系統(tǒng)工作示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

在實際樣品檢測過程中，通過考察不同色譜柱、流動相條件、柱溫箱溫度進行試驗，最終確定采用Kromasil反C18色譜柱作為樣品中雜質(zhì)去除、富集目標分析物的色譜柱，流動相采用乙腈-水（體積比82∶18），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量500 μL（500 μL定量環(huán)）。使用ChromSpher Pi色譜柱對洗脫出的目標分析物進一步分離，流動相采用異丙醇-乙腈（體積比65∶35），流速1.2 mL/min，柱溫40 ℃，F(xiàn)LD（熒光）檢測器，發(fā)射波長406 nm，激發(fā)波長384 nm。目標分析物苯并(a)芘色譜圖見圖2，檢測的苯并(a)芘陽性樣品色譜圖見圖3。

圖2 苯并(a)芘標準色譜圖

圖3 陽性樣品色譜圖

2.2 系統(tǒng)中六通閥切換時間考察

為確定合適系統(tǒng)六通閥切換時間，需要確定樣品、目標分析物苯并芘在第1根色譜柱Kromasil反C18的各自的大致出峰時間（見圖4）。由圖4可知，樣品中非極性、小極性雜質(zhì)基本上在3.2 min前被洗脫出色譜柱進入廢液池，而樣品中目標分析物在3.5 min后被洗脫出色譜，因此將系統(tǒng)中六通閥切換時間確定在3.5 min。如果過早切換系統(tǒng)六通閥會，樣品中過多的雜質(zhì)帶入第2根色譜分離柱，增加第2根色譜柱分離難度，從而影響整個系統(tǒng)的分離效果，可能造成檢測結(jié)果偏高；在3.5 min后切換六通閥會導致部分目標分析物被洗脫到廢液池，導致方法回收率降低、檢測結(jié)果偏低。

2.3 方法學考察

使用貯備標準溶液配制標準曲線質(zhì)量濃度為1.0，2.5，5.0，7.50和10.0 ng/mL的標準工作液，按照色譜條件進樣檢測，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），標準物質(zhì)熒光峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到標準曲線線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)和范圍。試驗方法的苯并(a)芘在1.0~10.0 ng/mL范圍內(nèi)樣品濃度與響應(yīng)值之間呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=0.478 8X+0.012 0，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 1，具有良好線性關(guān)系。對質(zhì)量濃度1.0 ng/mL的標準溶液重復(fù)進樣8次得到方法重現(xiàn)性及3倍信噪比計算方法檢出限，方法相對標準偏差（n=8）為3.35%，檢出限為0.08 μg/kg（色譜圖見圖5）。

圖5 試驗方法的檢出限色譜圖

2.4 樣品的測定

從市場上購買5批次魚肉罐頭（分別編號T1~T5），分別采用雙柱在線凈化檢測系統(tǒng)和GB 5009.27—2016進行測定，每份樣品重復(fù)測定6次，兩種方法檢測結(jié)果分別見表1。

表1 實際樣品檢測結(jié)果（n=6）

試驗考察閥切換超速液相色譜儀系統(tǒng)與G B 5009.27—2016在檢測結(jié)果、標準偏差、變異系數(shù)等方面差異。從5份實際樣品檢測結(jié)果可知，試驗方法在分析結(jié)果、標準偏差、變異系數(shù)與國標方法相近。

2.5 方法回收率與精密度

對市場上購買的常見5批次魚肉罐頭中添加苯并(a)芘標準溶液，分別進行1，5和10 μg/kg的3個水平添加，每個添加水平做6次測定，分別采用閥切換在線凈化系統(tǒng)與國標方法測定法計算回收率和精密度，試驗結(jié)果見表2和表3。

表2 試驗方法的回收率、精密度測定結(jié)果（n=6）

表3 國標方法的回收率、精密度測定結(jié)果（n=6）

從測定結(jié)果可以看出，閥切換超高速液相色譜系統(tǒng)方法回收率在81.62%~94.85%之間，相對標準偏差（SRSD）為2.11%~4.22%，與國標方法在加標回收率、相對標準偏差方面結(jié)果接近，表明該系統(tǒng)試驗結(jié)果符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中回收率和精密度的要求，方法檢出限滿足含量在μg/kg級別的檢測要求[22]，表明試驗方法適用于魚肉罐頭中苯并(a)芘的檢測。

3 結(jié)論

試驗方法通過六通閥的切換，使檢測樣品只需通過簡單提取后，便可在系統(tǒng)中實現(xiàn)自動在線凈化、富集、檢測等檢測過程，適用于魚肉罐頭等富含蛋白、脂肪的復(fù)雜食品中苯并芘的定量分析，該系統(tǒng)無需采用價格昂貴、操作復(fù)雜的苯并芘分析專用的SPE印跡柱，從而降低檢測成本、提高檢測效率，同時整個檢測過程中無需用到二氯甲烷等劇毒有機試劑，保護試驗檢測人員的健康及操作環(huán)境，試驗方法在檢出限、加標回收率、精密度方面與國標檢測方法相一致，可應(yīng)用于高脂肪、高蛋白復(fù)雜食品基體中苯并(a)芘的快速檢測分析。