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    右美托咪定通過(guò)調(diào)控TXNIP/NLRP3炎癥小體途徑減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷*

    2021-10-20 08:03:50王會(huì)娟李國(guó)利
    中國(guó)病理生理雜志 2021年9期
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激試劑盒黏膜

    賈 彤, 邢 珍, 王會(huì)娟, 李國(guó)利△

    (河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1麻醉科,2重癥醫(yī)學(xué)科,河北張家口 075061)

    腸道作為主要的消化吸收?qǐng)鏊c道黏膜中含有豐富的血管,發(fā)生炎癥會(huì)造成腸道屏障損傷,而腸道屏障損傷參與多種腸道疾病的發(fā)生,與炎癥性腸病、細(xì)菌性腸炎和克羅恩病等關(guān)系密切[1];腸道損傷會(huì)造成患者消瘦、營(yíng)養(yǎng)不良和生長(zhǎng)受阻,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[2]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種α2受體激動(dòng)藥物,其既可發(fā)揮鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用,又可抑制炎癥介質(zhì)釋放而發(fā)揮抗炎作用[3],在腸道中可以緩解燒傷引起的腸屏障損傷[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體參與腸道屏障損傷過(guò)程,能夠激活胱天蛋白酶1(caspase-1)/白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)通路,從而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),加重腸道損傷[5];NLRP3 與其介質(zhì)硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)結(jié)合,可以激活NLRP3 炎癥小體[6]。因此,抑制TXNIP/NLRP3 通路的激活可能對(duì)于緩解腸道屏障損傷具有重要的意義。本項(xiàng)工作以小鼠為研究對(duì)象,采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠腸道屏障損傷,初步探討DEX 治療腸道屏障損傷的機(jī)制,以期為臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物

    60 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠,6 周齡,(20±2)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0009。在溫度23 ℃、濕度50%、12 h 黑暗/12 h 光照條件下自由飲水?dāng)z食,所有動(dòng)物暫養(yǎng)1 周,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R 原則。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。

    2 主要試劑及儀器

    鹽酸DEX 注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);LPS(Santa Cruz);pcDNA3.1 載體和pcDNA3.1-TXNIP 過(guò)表達(dá)載體購(gòu)自廣州銳博生物有限公司;引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);小鼠IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫 吸 附 測(cè) 定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒及TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β抗體(Abcam);蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。RT-qPCR儀(Abbott;型號(hào):Abbott m2000rt);蛋白凝膠成像儀(Tanon;型號(hào):Tanon 4200)。

    3 主要方法

    3.1 模型制備及分組 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、模型(model)組、DEX組、DEX+pcDNA3.1組和DEX+TXNIP 組,每組12 只。除對(duì)照組外,其余各組小鼠參考文獻(xiàn)[7]方法給予腹腔注射15 mg/kg LPS誘導(dǎo)腸道屏障損傷,對(duì)照組小鼠則注射等體積生理鹽水。在LPS 誘導(dǎo)腸道屏障損傷前30 min,DEX組小鼠腹腔注射30 μg/kg DEX[8](濃度為30 mg/L),DEX+pcDNA3.1 組和DEX+TXNIP 組分別在DEX 組基礎(chǔ)上皮下注射5 nmol pcDNA3.1 和pcDNA3.1-TXNIP,對(duì)照組和模型組小鼠則皮下注射等體積生理鹽水。

    3.2 樣品采集 建模6 h 后處死小鼠,經(jīng)心室采血,1 000×g離心10 min,取上清置于-20 ℃冰箱保存待用;收集回腸組織,部分置于-80 ℃冰箱保存,部分置于4%多聚甲醛中固定。

    3.3 ELISA 檢測(cè)血清中IL-1β 和TNF-α 水平 采用小鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中IL-1β和TNF-α水平。

    3.4 HE 染色觀(guān)察腸道組織形態(tài) 從4%多聚甲醛中取出腸道組織,經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,切片(5 μm)。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、0.1%鹽酸乙醇分化、伊紅復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明后封片,光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腸道組織形態(tài)。根據(jù)腸道組織絨毛破損,細(xì)胞脫落、壞死,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分,無(wú)損傷;1 分,細(xì)胞出現(xiàn)局部萎縮、壞死,局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);2分,細(xì)胞片狀萎縮、壞死,片狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜結(jié)構(gòu)完整;3分,細(xì)胞大量萎縮、壞死,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,黏膜結(jié)構(gòu)不完整;4分,細(xì)胞大部分壞死,腸黏膜結(jié)構(gòu)消失,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

    3.5 試劑盒檢測(cè)腸道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)腸道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS、SOD 和GSH 水平,其中MDA 用硫代巴比妥酸法,ROS 用熒光酶法,SOD 用ELISA 法,GSH 用微量酶標(biāo)法。

    3.6 RT-qPCR 檢測(cè)腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 水平 取30 mg 腸道組織,經(jīng)RNA 提取試劑盒提取總RNA 后,采用cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA,于PCR 儀中進(jìn)行TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 擴(kuò) 增。20 μL 反應(yīng)體系:2× SYBR Premix Ex TaqTMⅡProbe qPCR Mix 10 μL,ddH2O 8.0 μL,50 mg/L cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃5 min;94 ℃15 s,59 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。各引物序列見(jiàn)表1。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Primer sequences for RT-qPCR

    3.7 Western blot 檢測(cè)腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白水平 30 mg腸道組織經(jīng)手術(shù)剪剪碎,添加蛋白裂解液冰上研磨,研磨后冰上裂解20 min,4 ℃、16 000×g離心20 min,BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度,沸水煮10 min 使蛋白變性。每孔上樣30 μg,凝膠分離蛋白,PVDF 膜轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h;對(duì)應(yīng)加入Ⅰ抗(TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和β-actin 抗體),4 ℃孵育過(guò)夜;對(duì)應(yīng)加入Ⅱ抗,室溫孵育2 h。DAB 顯色試劑顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    GraphPad Prism 7.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 DEX對(duì)小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的影響

    與對(duì)照組相比,模型組、DEX 組、DEX+pcDNA3.1 組和DEX+TXNIP 組小鼠血清中IL-1β 和TNF-α 水平均升高(P<0.05);與模型組相比,DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平降低(P<0.05);分別與DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組相比,DEX+TXNIP 組小鼠血清中IL-1β 和TNF-α 水平升高(P<0.05),見(jiàn)圖1。

    Figure 1. The levels of IL-1β and TNF-α in the serum of mice. Mean±SD. n=12.#P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group;△P<0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖1 各組小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平

    2 DEX對(duì)腸道組織形態(tài)的影響

    對(duì)照組腸上皮細(xì)胞完整,層次清晰,病理評(píng)分0分;模型組腸道組織完整性被破壞,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象,炎癥浸潤(rùn)明顯,病理評(píng)分為3.76±0.19,與對(duì)照組相比評(píng)分升高(P<0.05);DEX 組和DEX+pcDNA3.1組腸道組織完整,但出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象,病理評(píng)分分別為1.96±0.23 和2.03±0.17,與模型組相比評(píng)分降低(P<0.05);DEX+TXNIP 組腸道完整性被破壞,出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象,炎癥浸潤(rùn)明顯,病理評(píng)分為3.16±0.21,與DEX+pcDNA3.1 組相比評(píng)分升高(P<0.05),見(jiàn)圖2。

    3 DEX 對(duì)小鼠腸道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS、SOD和GSH的影響

    與對(duì)照組相比,模型組腸道組織中MDA 含量和ROS 水平升高(P<0.05),而SOD 和GSH 活性降低(P<0.05);與模型組相比,DEX 組腸道組織中MDA含量和ROS 水平降低(P<0.05),SOD 和GSH 活性升高(P<0.05);分別與DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組相比,DEX+TXNIP 組腸道組織中MDA 含量升高(P<0.05),SOD和GSH活性降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。

    Figure 3. MDA content,ROS level,SOD activity and GSH activity in mouse intestinal tissues of each group. Mean±SD. n=12.#P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group;△P<0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖3 各組小鼠腸道組織中MDA含量、ROS水平及SOD和GSH活性

    4 DEX 對(duì)小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA和蛋白水平的影響

    與對(duì)照組相比,模型組小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 和蛋白水平升高(P<0.05);與模型組相比,DEX 組小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 和蛋白水平降低(P<0.05);分別與DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組相比,DEX+TXNIP 組腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 和蛋白水平升高(P<0.05),見(jiàn)圖4、5。

    Figure 4. TXNIP,NLRP3,caspase-1 and IL-1β mRNA levels in mouse intestinal tissues of each group. Mean±SD. n=12.#P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group;△P<0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖4 各組腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA水平

    討 論

    腸黏膜損傷的主要損傷機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等,炎癥反應(yīng)是腸道屏障功能損傷的關(guān)鍵原因[9],Zhang 等[10]研究顯示,在小鼠中腸道菌群異位會(huì)刺激腸黏膜炎癥,導(dǎo)致腸道機(jī)械屏障和黏膜免疫發(fā)生障礙,引起免疫抑制。因而,減少炎癥因子釋放對(duì)于緩解腸黏膜損傷具有重要作用。DEX作為新型α2腎上腺素受體激動(dòng)劑,已廣泛應(yīng)用于臨床,能完全溶于水,可快速被吸收,半衰期僅6 min,具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護(hù)等作用[11];也可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),能夠抑制免疫反應(yīng),同時(shí)抑制炎癥因子TNF-α 和IL-1β 等的作用[12]。在本研究中,DEX 能夠降低血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平,且能夠減輕LPS 誘導(dǎo)的腸道完整性破壞現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,緩解LPS誘導(dǎo)的腸黏膜損傷。

    Figure 5. TXNIP,NLRP3,caspase-1 and IL-1β protein levels in the intestinal tissues of mice in each group. Mean±SD. n=12.#P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group;&P<0.05 vs DEX group;△P<0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖5 各組小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白水平

    腸黏膜上皮細(xì)胞在正常腸道環(huán)境不發(fā)生炎癥反應(yīng),呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài),當(dāng)腸黏膜上皮細(xì)胞通過(guò)自身模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別病原菌時(shí),促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)揮機(jī)體防御作用[13]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)是PRRs之一,NLRP3 屬于NLRs 家族成員,在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá),也在腸黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá),能夠識(shí)別大部分病原微生物,LPS 是其中之一[14]。受LPS 刺激后,NLRP3 炎癥小體異?;罨軌虼龠M(jìn)caspase-1 和IL-1β等效應(yīng)分子的產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效能,參與機(jī)體炎癥和免疫過(guò)程[15]。本研究顯示,NLRP3 炎癥小體在LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中處于激活狀態(tài),DEX能夠降低NLRP3 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而緩解疾病。炎癥損傷伴隨氧化損傷在LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中發(fā)生,在本研究中檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量、ROS 水平及SOD 和GSH 活性,結(jié)果顯示,在LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中MDA 含量、ROS 水平升高及SOD 和GSH 活性降低。而MDA 具有細(xì)胞毒性和誘變性,是氧化應(yīng)激標(biāo)志;ROS 表示氧化應(yīng)激情況;SOD 和GSH 作為保護(hù)因子,可在氧化應(yīng)激反應(yīng)下,清除機(jī)體自由基及過(guò)氧化物[16-17],提示LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中抗氧化應(yīng)激水平降低,氧化應(yīng)激水平升高,腸道組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。DEX 能夠減輕自由基的產(chǎn)生,影響MDA 水平及過(guò)氧化氫酶活性,進(jìn)而降低機(jī)體中氧化應(yīng)激水平[18]。與He 等[19]研究結(jié)果類(lèi)似,本研究中DEX 能夠降低MDA 含量、ROS 水平,升高SOD和GSH活性,從而清除機(jī)體自由基,緩解腸道組織氧化應(yīng)激損傷。TXNIP 作為硫氧還蛋白的內(nèi)源性抑制蛋白,可通過(guò)與硫氧還蛋白活性部分相互結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)活性氧化物的堆積進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體損傷,還可激活NLRP3炎癥小體從而調(diào)控炎癥反應(yīng)[20]。本研究在DEX 干預(yù)基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)TXNIP 后,機(jī)體氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥因子水平升高,推測(cè)DEX通過(guò)抑制TXNIP 水平進(jìn)而調(diào)控NLRP3 表達(dá)從而降低LPS 誘導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激損傷,實(shí)現(xiàn)對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用。

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