黃精質(zhì)量控制方法改進(jìn)*

程 闖，胡衛(wèi)南，方倍倩，顏偉華，宋劍鋒，黃 華，鄭 明

（浙江省衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 衢州 324000）

黃精為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua的干燥根莖，按形狀不同，習(xí)稱“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”，春、秋二季采挖，除去須根，洗凈，置沸水中略燙或蒸至透心，干燥。2020年版《中國藥典（一部）》記載其功能與主治為補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎，用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少、肺虛燥咳、勞嗽咳血、精血不足、腰膝酸軟、須發(fā)早白、內(nèi)熱消渴等證。目前，多采用九蒸九曬法炮制，可消除生黃精的部分刺激性及毒副作用，增強(qiáng)療效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃精九蒸九曬后其色、香、味等均有變化，黃精多糖抗應(yīng)激、雄激素樣壯陽作用及免疫功能、抗貧血作用均有不同程度增強(qiáng)，毒性明顯降低［1－2］。近年來，黃精被大量用于治療新型冠狀病毒肺炎、急性肺損傷、肺結(jié)核、肺癌等［3－6］，還具有抑菌、抗炎、抗疲勞、增強(qiáng)免疫等多種生物活性［7－9］，但因其成分復(fù)雜、極性較大、水溶性強(qiáng)等特點(diǎn)，難以進(jìn)行定性和定量分析?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以無水葡萄糖為對照品，以蒽酮－硫酸為顯色劑，采用紫外－可見分光光度法測定黃精多糖的含量［10］。但該方法操作復(fù)雜，重復(fù)性差。為了更好地控制黃精藥材的質(zhì)量，避免上市流通的質(zhì)量參差不齊，亟需建立一種簡單、準(zhǔn)確、快速的質(zhì)量控制方法。本研究中采用超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/Q－TOF－MS）儀快速篩查出其中的25種化學(xué)成分，選擇樣品中含量穩(wěn)定、具有代表性的蔗糖、葡萄糖、果糖3種糖類成分，建立了同時(shí)測定其含量的高效液相色譜－示差檢測器（HPLC－RID）法，以有效控制黃精藥材的質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SCIEX ExionLCTM液相系統(tǒng)，SCIEX X500R QTOF質(zhì)譜系統(tǒng)（美國SCIEX公司）；Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有G1322A型真空脫氣機(jī)，G1311C型四元泵，G1329B型自動進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1362A型檢測器；Mettler XS205型電子分析天平（梅特勒－托利多公司，精度為0.000 1 g）；JAC 5020型超聲波清洗器（功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

蔗糖對照品（批號為111507－201704，含量為100%），無水葡萄糖對照品（批號為110833－201707，含量為99.9%），果糖對照品（批號為100231－201904，含量為99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；水為純化水，其他試劑均為分析純。27批次黃精飲片由衢州市內(nèi)3家企業(yè)提供，根據(jù)不同工藝處理方法分別編號為Ga，Gb，Gc，各9批。詳見表1。

表1 27批次黃精飲片3種工藝處理方法Tab.1 Three processing methods of 27 batches of Polygonati Rhizoma decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC/Q－TOF－MS和HPLC－RID條件與分析

2.1.1 UPLC/Q－TOF－MS條件與分析

色譜條件：色譜柱為ThermoScientificC18柱（100mm×2.0 mm，1.9μm）；流動相為2 mmol/L乙酸銨－0.1%甲酸水（A）－甲醇（B），梯度洗脫（程序見表2）；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為2μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program of the mobile phase

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）為70～1 300，離子源噴霧電壓為4.5 kV，離子源溫度為550℃，去簇電壓為－50 V，碰撞能量為－35 V，碰撞能量疊加為（－35±15）V，氣簾氣壓力為35 psi，霧化氣GS1和輔助氣GS2壓力均為50 psi，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為20 min；正離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z為70～1 300，噴霧電壓為5.5 kV，離子源溫度為550℃，去簇電壓為50 V，碰撞能量為35 V，碰撞能量疊加為（35±15）V，氣簾氣壓力為35 psi，霧化氣GS1和輔助氣GS2壓力均為50 psi，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為20 min。

觸發(fā)二級方法為信息依賴掃描性獲取模式（IDA），動態(tài)背景扣除（DBS）為觸發(fā)二級的條件，滿足該條件的優(yōu)先進(jìn)行二級掃描，共掃描出有代表性的化學(xué)物質(zhì)25種。Qtof共鑒定出25個(gè)化學(xué)成分，包括異鼠李素－3－O－新橙皮苷、牡荊素鼠李糖苷、薯蕷皂苷元、（6aR，11aR）－3－羥基－9，10－二甲氧基紫檀烷、甲基麥冬二氫高異黃酮B、木犀草素、山柰素、山柰酚、燃料木素、甘草素、5－羥甲基糠醛、1，4苯醌、大黃酸、蘆薈大黃素、D－半乳糖、D－甘露糖、無水葡萄糖、亞油酸、水楊酸、水合兒茶素、精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蔗糖、果糖。27批樣品中，黃精藥材中普遍存在的甲基麥冬二氫高異黃酮B、5－羥甲基糠醛的檢出率均為100.00%，薯蕷皂苷元的檢出率為80.00%，但不同來源和不同品種黃精含量差異很大；蔗糖、葡萄糖、果糖的檢出率均為100.00%，且含量穩(wěn)定。故最終確定了蔗糖、葡萄糖、果糖3種糖類成分含量的測定方法。

2.1.2 HPLC－RID條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

檢測器：安捷倫G1362A 1260RID型RID；色譜柱：Carbosep Coregel－87C（鈣型）柱（300 mm×7.8 mm，9μm）；流動相：純水；流速：0.6 mL/min；柱溫：80℃；RID光學(xué)設(shè)備溫度：45℃；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，取混合對照品溶液及供試品溶液A，B，C分別進(jìn)樣，結(jié)果各待測組分分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖1。

1.蔗糖 2.葡萄糖 3.果糖 4.黃精多糖A.混合對照品溶液 B.供試品溶液A（水提取物） C.供試品溶液B（80%乙醇回流提取物） D.供試品溶液C（殘?jiān)崛∥铮﹫D1 高效液相色譜圖1.Sucrose 2.Glucose 3.Fructose 4.Polygonatum polysaccharideA.Mixed reference solution B.Test solution A（water extract）C.Test solution B（80% ethanol reflux extract）D.Test solution C（residue extract）Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液

取蔗糖、葡萄糖、果糖對照品適量，精密稱定，置50mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分別含蔗糖0.5 mg、葡萄糖0.5 mg、果糖0.5 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液

水提取物：取樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水100 mL，密塞，搖勻，浸泡30 min，超聲處理（＜40℃）30 min，取出，立即過濾，棄去初濾液，即得供試品溶液A。

80%乙醇回流提取物：取樣品1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，收集80%乙醇提取物，即得供試品溶液B。

殘?jiān)崛∥铮喝?0%乙醇回流提取物項(xiàng)下殘?jiān)盀V紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次，每次10 mL，合并濾液與洗液，即得供試品溶液C。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取蔗糖、葡萄糖、果糖對照品各適量，精密稱定，分別用水溶解成質(zhì)量濃度為0.486 9，0.243 4，0.595 7 mg/mL的混合對照品貯備液，精密吸取混合對照品貯備液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00 mL，分別置20 mL容量瓶中，加水定容，即得系列混合對照品溶液。精密量取上述不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對照品溶液質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3，表明蔗糖、葡萄糖、果糖均在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限確定：取同一批樣品（編號為Ga 5），依法制備供試品溶液，用水稀釋，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比（S/N）為3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限，以S/N為10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果見表3。

精密度試驗(yàn)：取2.2.1項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果見表3，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批樣品（編號為Ga 5），依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，24，48 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表3，表明供試品溶液在常溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（編號為Ga 5），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表3，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號為Ga 5）1 g，精密稱定，共9份，依法制備供試品溶液，平均分為3組，按高、中、低濃度（150%，100%，50%）分別加入一定量的蔗糖、葡萄糖、果糖對照品，按2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)樣10μL測定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

A.蔗糖 B.葡萄糖 C.果糖圖2 不同蒸制次數(shù)黃精飲片中3種糖類成分的含量變化A.Sucrose B.Glucose C.FructoseFig.2 Content change of three sugar components in Polygonati Rhizoma prepared with different steaming and sun－drying times

耐用性試驗(yàn)：選擇不同柱溫、流速、流動相pH、品牌鈣型色譜柱測定同一批樣品（編號為Ga5）的含量。結(jié)果表明，色譜柱溫度為（80±1）℃，流速為（0.6±0.1）mL/min，流動相pH介于5.5～7.0時(shí)，測定結(jié)果穩(wěn)定，若樣品峰面積過大，應(yīng)稀釋至合適濃度再進(jìn)樣。

2.4 樣品含量測定

取27批樣品，每批取3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，按線性回歸方程計(jì)算各成分的含量。結(jié)果見表4。

表4 27批不同蒸制次數(shù)黃精飲片中3種糖類成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.4 Content determination of three sugar components in 27 batches of Polygonati Rhizoma prepared with different steaming and sun－drying times（mg/g，n＝3）

2.5 不同蒸制次數(shù)的黃精小分子糖含量測定

取27批次3種不同工藝制備的黃精飲片，依法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，繪制蔗糖、葡萄糖、果糖的含量變化趨勢圖（見圖2）。結(jié)果蔗糖含量在三制時(shí)達(dá)到頂峰，然后逐漸降低；葡萄糖和果糖含量在七制前逐步升高，七制后趨于穩(wěn)定。

3 討論

由圖2可知，3種不同工藝、不同蒸制次數(shù)黃精小分子糖的含量變化趨勢，可以指導(dǎo)藥企優(yōu)化改良黃精蒸制工藝，在提高黃精飲片質(zhì)量方面取得了進(jìn)展。

現(xiàn)行黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用80%乙醇回流提取進(jìn)行含量測定，由圖1可知，80%乙醇除將黃精中的單糖、二糖等小分子糖提取出來外，也提取了大量黃精多糖，故不能準(zhǔn)確反映原黃精飲片中的多糖含量，且該方法加樣回收試驗(yàn)難度較大。按此方法檢測，結(jié)合圖2黃精多糖的含量變化趨勢分析，現(xiàn)有產(chǎn)品中不合格率高達(dá)80%。而黃精近年來曾被作為國考核和省考核品種，皆因其含量測定方法有待商榷而無法出具含量測定報(bào)告，故黃精的含量測定標(biāo)準(zhǔn)需提高。

本研究中建立的HPLC－RID法操作簡便，縮短了分析時(shí)間，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性、耐用性均較好，蔗糖、葡萄糖、果糖在以上27批樣品中均檢出，且含量較高，數(shù)值穩(wěn)定，可用于黃精飲片的質(zhì)量控制。下一步將結(jié)合藥效提升檢測質(zhì)量。