基于AHP－CRITIC混合加權(quán)法的正交試驗優(yōu)選神氣湯提取工藝*

王 強，張 湛，楊 彬，孟慶紅，陳海蘭，楊 博，張 勇

（1.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京 101300；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300000）

神氣湯為國家級名老中醫(yī)高才達(dá)主任醫(yī)師總結(jié)的臨床經(jīng)驗方，具有調(diào)補心腎、益氣養(yǎng)陰功效，適用于免疫、內(nèi)分泌、心血管功能等多系統(tǒng)失調(diào)人群，臨床用于治療慢性疲勞綜合征（CFS）效果顯著［1］。神氣湯方中多糖具有增強造血功能、調(diào)節(jié)免疫、抗心肌缺血、保護外分泌腺等作用，君臣藥單體成分黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、馬錢苷、五味子醇甲等分別具有抗氧化、神經(jīng)保護、抗炎、舒張血管等活性［2－6］，與本品功效相符。干膏率是固體制劑成型的重要保證［7］，故本研究中擬以上述活性成分的提取率及干膏得率為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗結(jié)合AHP－CRITIC混合加權(quán)法（簡稱AHP－CRITIC法）分配指標(biāo)權(quán)重，并根據(jù)試驗結(jié)果優(yōu)化提取工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler公司，精度為十萬分之一）；ALPHA2－4LDPLUS型凍干機（美國Christ公司）；UV－2700型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥

乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；甲酸（分析純，美國Sigma試劑公司）；超純水（自制）；黨參炔苷對照品（批號為DST200325－035，含量為99.09%），毛蕊花糖苷對照品（批號為DST200709－061，含量為99.37%），松 脂 醇 二 葡 萄 苷 對 照 品（批 號 為DST200408－013，含量為98.85%），馬錢苷對照品（批號為DST200628－038，含量為99.31%），五味子醇甲對照品（批號為DST191010－010，含量為99.86%），D（＋）－無水葡萄糖對照品（批號為DST200529－005，含量為99.03%），均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；黨參（批號為18121117），鹽杜仲（批號為19102101），麥冬（批號為18102201），五味子（批號為1909034），熟地黃（批號為1910044），山藥（批號為19073002），枸杞（批號為18121813），山萸肉（批號為18122115），川牛膝（批號為1908008），菟絲子（批號為1903049），均購自北京盛世龍藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院張湛主任中藥師鑒定為正品；神氣湯（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

綜合考慮藥材成分溶解性和預(yù)試驗結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)［8－9］，最終確定以加水倍量（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，設(shè)計L9（34）正交試驗。因素水平見表1，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Tab.1 The factor levels of the L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 The design and results of the L9（34）orthogonal test

2.2 多糖含量測定

2.2.1 溶液制備

取D（＋）－無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋，即得質(zhì)量濃度為100.02μg/mL的葡萄糖對照品溶液。分別精密吸取2.1項下正交試驗中各組藥液各50 mL，凍干，加80%乙醇100 mL，攪拌，靜置12 h，棄去上清液，加入蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取葡萄糖對照品溶液適量，加水稀釋，配成質(zhì)量濃度分別為10.00，20.00，30.00，50.01，60.01，80.01μg/mL的系列對照品溶液，精密吸取上述溶液各2 mL，置10 mL具塞刻度試管中，各加入5 mL 0.2%蒽酮－硫酸試液，搖勻，迅速置冰水中冷卻，置沸水浴中加熱10 min，取出，冰水浴中冷卻10 min，紫外可見分光光度計下于620 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A＝9.815 5C＋0.199 8，R2＝0.999 1（n＝6）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在10.00～80.01μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液2mL，于620 nm波長處測定吸光度，12 h內(nèi)連續(xù)測定6次。結(jié)果的RSD為0.47%（n＝6），表明儀器日內(nèi)精密度良好。精密吸取同一對照品溶液2 mL，于620 nm波長處每隔8 h測定吸光度，連續(xù)測定72 h。結(jié)果的RSD為1.89%（n＝9），表明儀器日間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2.2.1項下供試品溶液2 mL，于620 nm波長處分別于0，2，4，8，16，24 h時測定吸光度。結(jié)果的RSD為0.21%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密吸取提取藥液2 mL，依法制備供試品溶液，于620 nm波長處測定吸光度。結(jié)果的RSD為0.56%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密吸取2.2.1項下供試品溶液1mL，共6份，分別加入葡萄糖對照品溶液1 mL，于620 nm波長處測定吸光度，并計算多糖含量。結(jié)果多糖的平均回收率為99.01%，RSD為1.29%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度高。

2.2.3 樣品含量測定

精密吸取2.2.1項下供試品溶液，于620 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算所測樣品中多糖的含量。結(jié)果見表2。

2.3 黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、馬錢苷、五味子醇甲含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時20%A→40%A，11～20 min時40%A→80%A，21～25 min時80%A；26～40 min時80%A→40%A，41～50min時41%A→80%A）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；檢測波長：230 nm（松脂醇二葡萄苷、馬錢苷），270 nm（黨參炔苷、五味子醇甲），330 nm（毛蕊花糖苷）；進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

取黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、馬錢苷、五味子醇甲對照品各適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋，即得質(zhì)量濃度分別為2.14，1.96，2.04，15.96，13.67μg/mL的混合對照品溶液。精密吸取2.1項下藥液50 mL，加無水乙醇至含醇量達(dá)80%，攪拌，棄沉渣，取上清液減壓蒸干，加10 mL甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別稱取缺黨參、熟地黃、鹽杜仲、山茱萸、五味子的處方量藥材，按2.1項下提取方法制備陰性水提液，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.3.2項下3種溶液各適量，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液對應(yīng)保留時間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

1.松脂醇二葡萄苷 2.馬錢苷 3.毛蕊花糖苷 4.黨參炔苷5.五味子醇甲A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.缺鹽杜仲的陰性對照藥材溶液 D.缺山萸肉的陰性對照藥材溶液E.缺熟地黃的陰性對照藥材溶液F.缺黨參的陰性對照藥材溶液G.缺五味子的陰性對照藥材溶液圖1 高效液相色譜圖1.lobetyolin 2.acteoside 3.pinoresinol diglucoside 4.loganin 5.schisandrol AA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference medicinal material solution without stir－baked Eucommiae Cortexwith with salt solution D.Negative reference medicinal material solution without Corni Fructus E.Negative reference medicinal material solution without Rehmanniae Radix Praeparata F.Negative reference medicinal material solution without Codonopsis Radix G.Negative reference medicinal material solution without Schisandrae Chinensis FructusFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.3.2項下混合對照品溶液適量，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，分別精密吸取1，2，6，8，10，12μL，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

表3 神氣湯中5種成分含量測定方法學(xué)考察結(jié)果Tab.3 Results of the methodlogical investigations of content determination of five components in Shenqi Decoction

檢測限和定量限確定：取黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、馬錢苷、五味子醇甲對照品各適量，精密稱定，分別用甲醇稀釋。以信噪比（S/N）為3時的質(zhì)量濃度為檢測限，以S/N為10時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果見表3。

精密度試驗：精密吸取2.3.2項下混合對照品溶液10μL，按2.3.1項下色譜條件在12 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果各待測成分峰面積的RSD介于1.26%～2.08%（n＝6），表明儀器日內(nèi)精密度良好。精密吸取2.3.2項下混合對照品溶液10μL，按2.3.1項下色譜條件每隔8 h進(jìn)樣測定1次，連續(xù)測定3 d。結(jié)果各待測成分峰面積的RSD介于1.63%～2.71%（n＝9），表明儀器日間精密度良好。

重復(fù)性試驗：取2.1項下藥液，分別按2.3.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，分別按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果各待測成分峰面積的RSD介于0.32%～2.57%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.3.2項下供試品溶液，共6份，分別按2.3.1項下色譜條件于0，2，4，8，16，24 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果各待測成分峰面積的RSD介于0.12%～2.23%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量的藥液，依法制備供試品溶液，平行6份，精密加入2.3.2項下對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算加樣回收率。結(jié)果見表3。

2.4 干膏得率測定

分別精密吸取2.1項下藥液50 mL，置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，烘箱減壓，干燥至恒定質(zhì)量，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱定質(zhì)量，并計算干膏得率。結(jié)果見表2。

2.5 指標(biāo)權(quán)重確立

AHP層次分析法（簡稱AHP法）確定權(quán)重系數(shù)：依據(jù)神氣湯君臣佐使配伍規(guī)律及藥理活性，將指標(biāo)成分分成4個層次，優(yōu)先順序為多糖＞黨參炔苷＝毛蕊花糖苷＞松脂醇二葡萄苷＝馬錢苷＝五味子醇甲＞干膏得率。各項指標(biāo)成分比較的判斷優(yōu)先矩陣結(jié)果見表4。采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對相對評分進(jìn)行層次分析，結(jié)果多糖、黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、馬錢苷、五味子醇甲、干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.298 0，0.177 8，0.177 8，0.096 8，0.096 8，0.096 8，0.056 1，一致性比率（CR）＝0.005＜0.10，表明指標(biāo)成分比較的判斷優(yōu)先矩陣具有滿意的一致性，求得的權(quán)重系數(shù)有效。

表4 指標(biāo)成對判斷優(yōu)先矩陣結(jié)果Tab.4 Pairwise comparison judgment prioritization matrix of indicators

CRITIC法確定權(quán)重系數(shù)：將表2中的數(shù)據(jù)經(jīng)線性插值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理［指標(biāo)成分＝（實測值－最小值）/（最大值－最小值）］，采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)得相關(guān)系數(shù)矩陣，結(jié)果兩兩成分比較呈正相關(guān)，由公式［10－11］計算得到多糖、黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、馬錢苷、五味子醇甲、干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.253 1，0.119 9，0.020 4，0.115 7，0.160 5，0.125 5，0.204 9。

AHP－CRITIC法確定權(quán)重系數(shù)：通過公式ωAHP－CRITICij＝ωAHPij×ωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij計算相關(guān)系數(shù)得多糖、黨參炔苷、毛蕊花糖苷、松脂醇二葡萄苷、馬錢苷、五味子醇甲、干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別為0.500 3，0.141 4，0.021 4，0.074 3，0.103 0，0.080 6，0.076 3。

權(quán)重評分比較：采用上述3種評分系數(shù)分別對正交試驗結(jié)果進(jìn)行評分，結(jié)果見表5。通過相關(guān)系數(shù)分析，AHP法 與AHP－CRITIC法、CRITIC與AHPCRITIC法、AHP法與CRITIC法的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 7，0.996 7，0.994 2，表明各數(shù)據(jù)間線性相關(guān)性強?？紤]AHP－CRITIC法包含信息更科學(xué)、合理，故選擇AHP－CRITIC法進(jìn)行權(quán)重分配，即綜合評分＝［（多糖/多糖最大量）×0.500 3＋（黨參炔苷/黨參炔苷最大量）×0.141 4＋（毛蕊花糖苷/毛蕊花糖苷最大量）×0.021 4＋（松脂醇二葡萄苷/松脂醇二葡萄苷最大量）×0.074 3＋（馬錢苷/馬錢苷最大量）×0.103 0＋（五味子醇甲/五味子醇甲最大量）×0.080 6＋（干膏得率/干膏得率最大量）×0.076 3］×100。

表5 3種賦權(quán)法對L9（34）正交試驗評分結(jié)果（分）Tab.5 Scoring results of L9（34）orthogonal test by the three weighting methods（point）

2.6 AHP－CRITIC法對正交試驗進(jìn)行評分

根據(jù)AHP－CRITIC法權(quán)重系數(shù)對L9（34）正交試驗結(jié)果進(jìn)行綜合評分，采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。正交試驗綜合評分結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表7 方差分析結(jié)果Tab.7 Results of the ANOVA

由表6可知，3個因素對綜合評分的影響順序為B＞A＞C，最佳提取工藝為A3B3C1。方差分析結(jié)果顯示，因素B對綜合評分結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），而因素A和因素C對綜合評分結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）?？紤]到后期工業(yè)生產(chǎn)成本，故最終確定提取工藝為A1B3C1，即加6倍量水，提取3次，每次30 min。

表6 AHP－CRITIC法對L9（34）正交試驗綜合評分結(jié)果Tab.6 Results of comprehensive score of the L9（34）orthogonal test based on AHP－CRITIC method

2.7 提取工藝驗證

稱取5倍處方量藥材，加6倍量水，提取3次，每次30 min，測定各指標(biāo)成分提取量、多糖含量和干膏得率。結(jié)果各指標(biāo)均處于較高水平，表明工藝可行、合理。詳見表8。

表8 提取工藝驗證試驗結(jié)果Tab.8 Results of the validation test of the extraction process

3 討論

神氣湯由12味藥材組方，方中，黨參、丹參補益心陰、養(yǎng)血通脈，共為君藥；熟地黃、山藥、枸杞、山萸肉、麥冬、川牛膝、鹽杜仲、五味子、菟絲子補腎填精、滋腎水以制心火，共為臣藥；砂仁開胃醒脾、使補而不滯、滋而不膩，共為使藥。諸藥合用，共奏滋補心腎、益氣養(yǎng)陰之功效［1］。本研究中考慮中藥復(fù)方在臨床以多成分、多靶點發(fā)揮療效，以及后續(xù)研制固體制劑要求，以多糖及君臣藥單體含量、干膏得率為考察指標(biāo)，系統(tǒng)、全面、有效地反映了提取物的信息。在多指標(biāo)評價的中藥提取工藝中，針對權(quán)重系數(shù)分配，目前常用方法有AHP法、CRITIC法。其中，AHP法雖體現(xiàn)了中藥復(fù)方君臣佐使配伍的規(guī)律特點，但受研究者主觀判斷影響；CRITIC法權(quán)重結(jié)果受客觀試驗數(shù)據(jù)影響，忽略了中藥復(fù)方各藥材的配伍特點。而本研究中采用AHP－CRITIC法結(jié)合了不同類型賦權(quán)法的優(yōu)點，主觀與客觀相結(jié)合，保證權(quán)重分配結(jié)果更穩(wěn)定、可靠。

本研究中采用3D紫外光譜對君臣藥各單體檢測波長進(jìn)行了考察，結(jié)果松脂醇二葡萄苷、馬錢苷分別于277，205 nm波長處響應(yīng)值最佳，但由于松脂醇二葡萄苷和馬錢苷保留時間接近，兩者于230 nm波長處吸收衰減較小，為了保持基線平穩(wěn)，這2個成分檢測波長選擇230 nm；五味子醇甲、黨參炔苷于270 nm波長處均有較大吸收，且末端吸收下基線較穩(wěn)定；毛蕊花糖苷于330 nm波長處響應(yīng)值最佳。參考文獻(xiàn)［12］，最終選擇在上述3個波長間切換進(jìn)行測定。